ترميز أساسي 2

تقنية ترميز قاعدتين ، والمعروفة أيضًا باسم SOLiD ( التسلسل عن طريق ربط النيوكليوتيدات والكشف عنها )، هي تقنية تسلسل من الجيل التالي طورتها شركة Applied Biosystems ، وهي متاحة تجاريًا منذ عام 2008. تُنتج هذه التقنيات مئات الآلاف من قراءات التسلسل الصغيرة في وقت واحد. من الأمثلة المعروفة على طرق تسلسل الحمض النووي هذه: التسلسل الناري 454 (الذي طُرح عام 2005)، ونظام Solexa (الذي طُرح عام 2006)، ونظام SOLiD (الذي طُرح عام 2007). وقد أدت هذه الأساليب إلى خفض التكلفة من 0.01 دولار/قاعدة في عام 2004 إلى ما يقرب من 0.0001 دولار/قاعدة في عام 2006 وزيادة قدرة التسلسل من 1,000,000 قاعدة/جهاز/يوم في عام 2004 إلى أكثر من 100,000,000 قاعدة/جهاز/يوم في عام 2006.

تعتمد تقنية الترميز ثنائي القاعدة على تسلسل الربط بدلاً من التسلسل بالتخليق. ^{[ 1 ]} ومع ذلك، فبدلاً من استخدام مجسات فلورية مُوسومة بتسعة قواعد تميز ست قواعد فقط، تستفيد هذه التقنية من مجسات فلورية مُوسومة بثمانية قواعد تميز القاعدتين الأقرب إلى الطرف 3'، ويمكن تكرارها بشكل مشابه لطريقة ماسيفيتش، مما يسمح بالحصول على قراءات أطول من 6 أزواج قاعدية (25-50 زوجًا قاعديًا منشورة، ^{[ 2 ]} و50 زوجًا قاعديًا في قاعدة بيانات NCBI في فبراير 2008). تُمكّن هذه التقنية من قراءة كل قاعدة مرتين دون مضاعفة الجهد. ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

تتضمن الخطوات العامة المشتركة بين العديد من تقنيات التسلسل الجيني من الجيل التالي ما يلي:

1. التجزئة العشوائية للحمض النووي الجينومي
2. تثبيت أجزاء مفردة من الحمض النووي على دعامة صلبة مثل حبة أو سطح صلب مستوٍ
3. تضخيم أجزاء الحمض النووي على السطح الصلب باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتكوين مستعمرات البوليميراز ^{[ 7 ]}
4. التسلسل والتحليل الموضعي اللاحق بعد كل دورة باستخدام المسح الفلوري أو التلألؤ الكيميائي. ^{[ 8 ]}

في عام 1988، أثبت وايتلي وزملاؤه استخدام ربط قليل النوكليوتيدات الموسومة بالفلور للكشف عن متغيرات الحمض النووي. ^{[ 9 ]} وفي عام 1995، أثبت ماسيفيتش ^{[ 10 ]} الربط المتكرر لقليل النوكليوتيدات للكشف عن متغيرات الحمض النووي المتجاورة. وفي عام 2003، أثبت دريسمان وزملاؤه ^{[ 11 ]} استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المستحلب لإنتاج ملايين الخرزات المُضخّمة استنساخياً، والتي يمكن إجراء فحوصات الربط المتكرر عليها. وفي عام 2005، أجرى شندور وزملاؤه عملية تسلسل جمعت بين تقنيات وايتلي ودريسمان، حيث قاموا بربط مجسات "ثمانية قواعد متدهورة" ذات 9 قواعد موسومة بالفلور، والتي ميزت بين القواعد المختلفة وفقًا لوسم المجس والقواعد غير المتدهورة. تم تكرار هذه العملية (بدون إعادة توليد نهاية قابلة للتمديد كما في Macevicz) باستخدام بادئات متطابقة ولكن مع مجسات تحمل علامات تحدد قواعد غير متدهورة مختلفة لتسلسل قراءات 6bp في الاتجاه 5->3 وقراءات 7bp في الاتجاه 3->5.

يستخدم نظام التسلسل SOLiD مجسات ذات ترميز قاعدي مزدوج.

يمكن تلخيص الكيمياء الأساسية في الخطوات التالية: ^{[ 12 ]}

- الخطوة الأولى، تحضير المكتبة: تبدأ هذه الخطوة بتقطيع الحمض النووي الجينومي إلى أجزاء صغيرة. ثم يُضاف نوعان مختلفان من المحولات (على سبيل المثال A1 وA2). تحتوي المكتبة الناتجة على أجزاء من الحمض النووي القالب، والتي يتم وسمها بمحول واحد في كل طرف (A1-قالب-A2).

- الخطوة 2، تفاعل البلمرة المتسلسل في المستحلب: في هذه الخطوة، يتم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل في المستحلب (قطرات من الماء معلقة في الزيت) باستخدام أجزاء الحمض النووي من المكتبة، واثنين من البادئات (P1 وP2) التي تكمل المحولات المستخدمة سابقًا (P1 مع A1 وP2 مع A2)، ومكونات تفاعل البلمرة المتسلسل الأخرى، وخرزات بحجم 1 ميكرومتر مرتبطة بأحد البادئات (مثل P1) لتخفيف الحمض النووي من المكتبة لزيادة حجم القطرة التي تحتوي على جزء واحد من الحمض النووي وخرزة واحدة في قطرة مستحلب واحدة.

في كل قطرة، يرتبط قالب الحمض النووي بالخرزة المرتبطة بـ P1 من جهة A1. ثم يقوم إنزيم بوليميراز الحمض النووي بتمديد السلسلة من P1 لتكوين التسلسل المكمل، مما ينتج عنه في النهاية خرزة غنية بنواتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) من قالب واحد. بعد انتهاء تفاعل البلمرة المتسلسل، يتم فصل القوالب عن الخرزات. وقد وصف دريسمان وزملاؤه هذه التقنية لأول مرة عام 2003.

الخطوة الثالثة، إثراء الخرز: عمليًا، 30% فقط من الخرز تحتوي على الحمض النووي المستهدف. لزيادة عدد الخرز الذي يحتوي على الحمض النووي المستهدف، تُضاف خرزات كبيرة من البوليسترين المغلفة بـ A2 إلى المحلول. بالتالي، سترتبط أي خرزة تحتوي على النواتج الممتدة بخرزة البوليسترين عبر طرفها P2. سيتم فصل المركب الناتج عن الخرز غير المستهدف، ثم يُذاب لفصل الخرز المستهدف عن البوليسترين. يمكن لهذه الخطوة أن تزيد إنتاجية هذا النظام من 30% قبل الإثراء إلى 80% بعده.

بعد عملية الإثراء، يتم تعديل الطرف 3' للمنتجات (الطرف P2) مما يجعلها قادرة على الارتباط التساهمي في الخطوة التالية. وبالتالي، فإن منتجات هذه الخطوة هي خرزات مرتبطة بالحمض النووي مع تعديل الطرف 3' لكل خيط من خيوط الحمض النووي.

- الخطوة الرابعة، ترسيب الخرز: في هذه الخطوة، يتم ترسيب نواتج الخطوة السابقة على شريحة زجاجية. تلتصق الخرزات بسطح الزجاج بشكل عشوائي من خلال روابط تساهمية بين الخرزات المعدلة عند الطرف 3' والزجاج.

- الخطوة 5، تفاعل التسلسل: كما ذكرنا سابقًا، على عكس طرق الجيل التالي الأخرى التي تُجري التسلسل من خلال التخليق، يعتمد ترميز القاعدتين على التسلسل عن طريق الربط. ويتم الربط باستخدام مجسات ثمانية النيوكليوتيدات محددة.

تتكون هذه المجسات من ثماني قواعد، وتحتوي على مجموعة هيدروكسيل حرة في الطرف 3'، وصبغة فلورية في الطرف 5'، وموقع انقسام بين النيوكليوتيد الخامس والسادس. أول قاعدتين (بدءًا من الطرف 3') مكملتان للنيوكليوتيدات المراد تحديد تسلسلها. القواعد من 3 إلى 5 متماثلة، وقادرة على الارتباط بأي نيوكليوتيد في التسلسل الأساسي. القواعد من 6 إلى 8 متماثلة أيضًا، ولكنها تُفصل، مع الصبغة الفلورية، مع استمرار التفاعل. يؤدي فصل الصبغة الفلورية والقواعد من 6 إلى 8 إلى ترك مجموعة فوسفات حرة في الطرف 5' جاهزة لمزيد من الربط. وبهذه الطريقة، يتم ربط الموضعين n+1 و n+2 بشكل صحيح، ثم n+6 و n+7، وهكذا. يبقى تركيب القواعد n+3 و n+4 و n+5 غير محدد حتى جولات أخرى من تفاعل تحديد التسلسل.

تتألف خطوة التسلسل أساسًا من خمس جولات، وتتألف كل جولة من حوالي 5-7 دورات (الشكل 2). تبدأ كل جولة بإضافة بادئ عام مكمل لـ P1. يحتوي هذا البادئ، على سبيل المثال، على n نيوكليوتيد، ويتطابق طرفه 5' تمامًا مع الطرف 3' لـ P1. في كل دورة، تُضاف مجسات ثمانية النيوكليوتيدات وتُربط وفقًا لقاعدتيها الأولى والثانية. بعد ذلك، تُغسل المجسات غير المرتبطة المتبقية، ويُقاس الإشارة الفلورية من المجس المرتبط، ثم يُفصل المجس المرتبط بين نيوكليوتيده الخامس والسادس. أخيرًا، يُعاد ضبط البادئ والمجسات للجولة التالية.

في الجولة التالية، يرتبط بادئ عالمي جديد بالموقع n-1 (حيث يتطابق طرفه 5' مع القاعدة التي تسبق تمامًا الطرف 3' للبادئ P1)، وتُكرر الدورات اللاحقة على غرار الجولة الأولى. أما الجولات الثلاث المتبقية، فتُجرى باستخدام بادئات عالمية جديدة ترتبط بالموقعين n-2 و n-3 و n-4 بالنسبة للطرف 3' للبادئ P1.

يسمح التفاعل الكامل المكون من خمس جولات بتسلسل حوالي 25 زوجًا من القواعد من القالب من P1.

الخطوة 6، فك تشفير البيانات: لفك تشفير البيانات المُمثلة بالألوان، يجب أولاً معرفة عاملين مهمين. أولاً، يجب أن نعرف أن كل لون يُشير إلى قاعدتين. ثانياً، نحتاج إلى معرفة إحدى القاعدتين في التسلسل: هذه القاعدة مُدمجة في التسلسل في الجولة الأخيرة (الخامسة) من الخطوة 5. هذه القاعدة المعروفة هي النيوكليوتيد الأخير من الطرف 3' للوحدة P1 المعروفة. لذلك، بما أن كل لون يُمثل نيوكليوتيدين، حيث تُشكل القاعدة الثانية من كل وحدة ثنائية النيوكليوتيد القاعدة الأولى من الوحدة الثنائية التالية، فإن معرفة قاعدة واحدة فقط في التسلسل ستُمكّننا من تفسير التسلسل بأكمله (الشكل 2). ^{[ 13 ]}

عمليًا، لا يُنصح بالترجمة المباشرة لقراءات الألوان إلى قراءات القواعد، إذ أن أي خطأ في تحديد الألوان سيؤدي إلى انزياح في إطار قراءة القواعد. وللاستفادة القصوى من خصائص "تصحيح الأخطاء" في ترميز القاعدتين، يُفضل تحويل تسلسل القاعدة المرجعي إلى فضاء الألوان. يوجد تحويل واحد واضح لتسلسل القاعدة المرجعي إلى فضاء الألوان، ومع أن العكس صحيح أيضًا، إلا أن التحويل قد يكون غير دقيق بشكل كبير في حال وجود أي أخطاء في التسلسل. ^{[ 14 ]}

يمكن الاستفادة من قواعد التشفير الثنائي الأساس بشكل صحيح عند ربط قراءات فضاء اللون بمرجع فضاء اللون، حيث لا يمكن تمثيل تعدد الأشكال الأساسي الحقيقي إلا من خلال اختلافات الألوان المتجاورة. ولا يمكن فك تشفير قراءات اللون أو ترجمتها مباشرةً إلى قواعد بكفاءة دون معرفة مسبقة.

وبشكل أدق، لا تُعد هذه الطريقة أداة لتصحيح الأخطاء، بل أداة لتحويلها. إذ يُحوّل فضاء الألوان نمط الخطأ الأكثر شيوعًا (أخطاء القياس الفردية) إلى تردد مختلف عن تردد أكثر أشكال التباين الجيني شيوعًا (التغيرات في النوكليوتيدات المفردة أو تغيرات القاعدة المفردة). وتؤثر هذه التغيرات في القاعدة المفردة على الألوان المتجاورة في فضاء الألوان. وهناك قواعد منطقية تُساعد في تصحيح الأخطاء المتجاورة إلى أخطاء متجاورة "صحيحة" و"غير صحيحة".

يمكن تقدير احتمالية حدوث خطأين متجاورين في قراءة بطول 50 زوجًا قاعديًا. هناك 49 طريقة لإجراء تغييرات متجاورة على سلسلة مكونة من 50 حرفًا (قراءة بطول 50 زوجًا قاعديًا). وهناك 1225 طريقة لإجراء تغييرات غير متجاورة على سلسلة مكونة من 50 حرفًا (50 اختيارًا لـ 2). ببساطة، إذا افترضنا أن الأخطاء عشوائية تمامًا (عادةً ما تكون أكثر تكرارًا في نهاية القراءات)، فإن 49 خطأً فقط من أصل 1225 ستكون مرشحة لتكون تعددات أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs). إضافةً إلى ذلك، يمكن أن يكون ثلث الأخطاء المتجاورة فقط أخطاءً صحيحة وفقًا للتصنيف المعروف للمجسات، مما ينتج عنه 16 خطأً فقط من أصل 1225 يمكن أن تكون مرشحة لتكون تعددات أشكال النوكليوتيدات المفردة. يُعد هذا مفيدًا بشكل خاص للكشف عن تعددات أشكال النوكليوتيدات المفردة عند التغطية المنخفضة، حيث يقلل من النتائج الإيجابية الخاطئة عند التغطية المنخفضة، كما ذكر سميث وآخرون ^{[ 15 ] .}

تُقرأ كل قاعدة في هذه الطريقة التسلسلية مرتين. يؤدي هذا إلى تغيير لون لونين متجاورين في فضاء الألوان، وبالتالي، لكي يُشخَّص تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) بشكل خاطئ، يجب أن يُشخَّص لونان متجاوران بشكل خاطئ. ولهذا السبب، فإن معدل الخطأ في تحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) يكون في حدود e^2، حيث e هو معدل الخطأ في الجهاز.

عند تحديد القواعد، تتسبب الأخطاء في تحديد لون واحد في حدوث أخطاء في الجزء المتبقي من القراءة. في تحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP)، يمكن تصحيح ذلك، مما يؤدي إلى انخفاض معدل الخطأ في تحديد SNP. مع ذلك، في التجميع البسيط من الصفر، يتبقى معدل الخطأ الخام للجهاز، والذي سيكون أعلى بكثير من 0.06% المُبلغ عنه لتحديد SNP. يمكن أن يؤدي ترشيح جودة القراءات إلى الحصول على قراءات ذات دقة خام أعلى، والتي عند محاذاتها لتشكيل متواليات ملونة، يمكنها توفير تسلسلات مرجعية حيث يمكن الاستفادة بشكل أفضل من ترميز القاعدتين. كما يمكن للتجميعات الهجينة باستخدام تقنيات أخرى الاستفادة بشكل أفضل من ترميز القاعدتين.

• تسلسل الحمض النووي
• التسلسل عن طريق الربط
• التسلسل في الوقت الحقيقي لجزيء واحد