التسلسل الناري

الموسوعة الحرة

التسلسل الناري هو طريقة غير كهربائية لتحديد ترتيب النيوكليوتيدات في الحمض النووي، تعتمد على مبدأ "التسلسل بالتخليق"، حيث يتم التسلسل عن طريق الكشف عن النيوكليوتيد الذي يدمجه إنزيم بوليميراز الحمض النووي . يعتمد التسلسل الناري على الكشف الضوئي الناتج عن تفاعل متسلسل عند إطلاق البيروفوسفات ، ومن هنا جاءت تسميته.

مبادئ

وُصِفَ مبدأ التسلسل الناري لأول مرة عام ١٩٩٣ على يد كلٍّ من ب. نيرن ، وب. بيترسون، وم . أولين . [ ١ ] [ ٢ ] [ ٣ ] تجمع هذه التقنية بين التسلسل على الطور الصلب ، واستخدام خرز مغناطيسي مغلف بالستربتافيدين ، وبوليميراز الحمض النووي المؤتلف الذي يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز من ٣' إلى ٥' (التدقيق)، والكشف عن البيروفوسفات غير العضوي باستخدام إنزيم لوسيفيراز اليراعة . [ ٤ ] [ ٥ ]

على وجه التحديد، يُضاف محلولٌ من ثلاثة إنزيمات - بوليميراز الحمض النووي ، وكبريتيد الأدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ولوسيفيراز اليراعة - بالإضافة إلى نيوكليوسيد ثلاثي الفوسفات منزوع الأكسجين (dNTP) إلى الحمض النووي أحادي السلسلة المراد تحديد تسلسله، ويُتابع دمج النيوكليوتيدات بقياس الضوء المنبعث نتيجةً لإنتاج بيروفوسفات غير عضوي. تحدد شدة الضوء ما إذا كان قد تم دمج صفر أو نيوكليوتيد واحد أو أكثر، مما يُبين عدد النيوكليوتيدات المُكملة الموجودة على السلسلة القالب. يُزال خليط النيوكليوتيدات قبل إضافة خليط آخر، وتُكرر العملية لكل نيوكليوتيد من النيوكليوتيدات الأربعة، حتى يتم تحديد تسلسل الحمض النووي للسلسلة القالب أحادية السلسلة.

وُصفت طريقة ثانية تعتمد على المحلول للتسلسل الناري في عام ١٩٩٨ من قِبل مصطفى رونغي ، [ماتياس أولين]، [ ٦ ] وبال نيرن . في هذه الطريقة البديلة، يُضاف إنزيم إضافي، وهو الأبيراز ، لإزالة النيوكليوتيدات التي لا يدمجها بوليميراز الحمض النووي. وهذا يُتيح إضافة مزيج الإنزيمات - بوليميراز الحمض النووي ، واللوسيفيراز ، والأبيراز - عند بدء التسلسل، والاحتفاظ به في محلول التفاعل طوال العملية (مما يُسهّل الأتمتة). وفي العام التالي، طرحت شركة Pyrosequencing جهازًا آليًا يعتمد على هذا المبدأ في السوق.

وُصفت طريقة ثالثة، وهي طريقة التسلسل الناري الميكروفلويدي، عام 2005 من قِبل فريق بحث صناعي بقيادة جوناثان روثبرغ ، في شركة 454 لعلوم الحياة . [ 7 ] [ 3 ] اعتمد هذا النهج البديل للتسلسل الناري على المبدأ الأصلي المتمثل في ربط الحمض النووي المراد تسلسله بدعامة صلبة؛ وقد أثبت روثبرغ وزملاؤه إمكانية إجراء التسلسل بطريقة متوازية للغاية باستخدام التصنيع الميكروي والمصفوفات الدقيقة . وقد أتاح ذلك تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية، وطُرح جهاز آلي في السوق. دشّن هذا الجهاز الأول من نوعه في مجال التسلسل حقبة جديدة في أبحاث علم الجينوم ، وساهم في الانخفاض السريع لأسعار تسلسل الحمض النووي ، مما أتاح تسلسل الجينوم الكامل بأسعار معقولة .

إجراء

كيف يعمل التسلسل الناري
يوضح الرسم البياني كيفية عمل التسلسل الناري.

تتضمن تقنية "التسلسل بالتخليق" أخذ شريط واحد من الحمض النووي المراد تسلسله، ثم تخليق شريطه المكمل له إنزيميًا. تعتمد طريقة التسلسل الناري على الكشف عن نشاط بوليميراز الحمض النووي (إنزيم تخليق الحمض النووي) باستخدام إنزيم آخر مُضيء كيميائيًا . تسمح هذه الطريقة، بشكل أساسي، بتسلسل شريط واحد من الحمض النووي عن طريق تخليق الشريط المكمل له، زوجًا قاعديًا واحدًا في كل مرة، والكشف عن القاعدة التي أُضيفت فعليًا في كل خطوة. يكون قالب الحمض النووي ثابتًا، وتُضاف محاليل النيوكليوتيدات A وC وG وT بالتتابع وتُزال من التفاعل. لا يُنتج الضوء إلا عندما يُكمل محلول النيوكليوتيدات أول قاعدة غير مزدوجة في القالب. يسمح تسلسل المحاليل التي تُنتج إشارات مُضيئة كيميائيًا بتحديد تسلسل القالب. [ 8 ] [ 1 ] [ 3 ]

بالنسبة للنسخة القائمة على المحلول من التسلسل الناري، يتم تهجين قالب الحمض النووي أحادي السلسلة ( ssDNA ) مع بادئ التسلسل ويتم تحضينه مع إنزيمات بوليميراز الحمض النووي ، وكبريتيد الأدينوسين ثلاثي الفوسفات ، واللوسيفيراز، والأبيراز ، ومع الركائز أدينوسين 5' فوسفوسلفات (APS) واللوسيفيرين . [ 8 ]

  1. تبدأ الخطوة الثانية بإضافة أحد ثلاثي فوسفات ديوكسي نيوكليوتيدات الأربعة (dNTPs ) - حيث يُضاف dATPαS، وهو ليس ركيزة لإنزيم لوسيفيراز، بدلاً من dATP لتجنب التشويش. يقوم بوليميراز الحمض النووي بدمج ثلاثي فوسفات ديوكسي نيوكليوتيدات الصحيحة والمكملة على القالب. يؤدي هذا الدمج إلى إطلاق بيروفوسفات (PPi). [ 8 ]
  1. يحوّل إنزيم سلفوريلز ATP البيروفوسفات (PPi) إلى ATP بوجود أدينوسين 5'-فوسفات الكبريتات. يعمل هذا الـ ATP كركيزة لتحويل اللوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين بواسطة إنزيم لوسيفيراز، مما يُنتج ضوءًا مرئيًا بكميات تتناسب مع الكمية المُضافة. يتم رصد الضوء الناتج عن التفاعل المُحفز بواسطة إنزيم لوسيفيراز بواسطة كاميرا، ثم يُحلل بواسطة برنامج حاسوبي. [ 8 ]
  1. يتم تحلل النيوكليوتيدات غير المدمجة وATP بواسطة إنزيم الأبيراز ، ويمكن أن يبدأ التفاعل من جديد مع نيوكليوتيد آخر. [ 8 ]

يمكن تمثيل هذه العملية بالمعادلات التالية:

  • PPi + APS → ATP + كبريتات (يحفز بواسطة ATP-سلفوريلاز)؛
  • ATP + لوسيفيرين + O2 → AMP + PPi + أوكسيلوسيفيرين + CO2 + hv (محفز بواسطة لوسيفيراز)؛

حيث PPi هو بيروفوسفات، وAPS هو أدينوسين 5-فوسفوسلفات، وATP هو أدينوسين ثلاثي الفوسفات، وO2 هو الأكسجين الجزيئي ، وAMP هو أدينوسين أحادي الفوسفات، و CO2 هو ثاني أكسيد الكربون، وhv هو الضوء. [ 8 ]

القيود

من عيوب هذه الطريقة حاليًا أن طول قراءات تسلسل الحمض النووي الفردية يتراوح بين 300 و500 نيوكليوتيد، وهو أقصر من الطول الذي يمكن الحصول عليه باستخدام طرق إنهاء السلسلة (مثل تسلسل سانجر) والذي يتراوح بين 800 و1000 نيوكليوتيد. وهذا قد يُصعّب عملية تجميع الجينوم ، خاصةً بالنسبة للتسلسلات التي تحتوي على كمية كبيرة من الحمض النووي المتكرر . كما أن غياب آلية التدقيق اللغوي يحدّ من دقة هذه الطريقة.

التسويق التجاري

تأسست شركة Pyrosequencing AB، ومقرها أوبسالا، السويد ، برأس مال استثماري من شركة HealthCap بهدف تسويق الأجهزة والكواشف اللازمة لتسلسل أجزاء قصيرة من الحمض النووي باستخدام تقنية التسلسل الناري. [ 9 ] أُدرجت شركة Pyrosequencing AB في بورصة ستوكهولم عام 1999. [ 9 ] وعندما استحوذت Pyrosequencing AB على شركة Biotage LLC الأمريكية، وشركات أخرى، عام 2003، غُيّر اسمها إلى Biotage AB. [ 9 ] بيعت وحدات التسلسل الناري وغيرها من الوحدات الطبية الحيوية التابعة لشركة Biotage AB إلى شركة Qiagen عام 2008. [ 9 ] رُخّصت تقنية التسلسل الناري لشركة 454 Life Sciences . طوّرت 454 تقنية التسلسل الناري القائمة على المصفوفات، والتي برزت كمنصة لتسلسل الحمض النووي على نطاق واسع ، بما في ذلك تسلسل الجينوم وعلم الجينوم البيئي .

استحوذت شركة روش على شركة 454 لايف ساينسز ، وأعلنت عن إيقاف منصة التسلسل 454 في عام 2013. [ 10 ] تم استبدال منصة التسلسل 454 جزئيًا بتقنية تسلسل الصبغة من Illumina ، ومنتجات التسلسل من Applied Biosystems.

للمزيد من القراءة

مراجع

  1. أحمديان ، أفشين؛ إهن، ماريا؛ هوبر، صوفيا (2006). "التسلسل الناري: التاريخ، والكيمياء الحيوية، والمستقبل" . مجلة كلينيكا كيميكا أكتا . 363 ( 1-2 ) : 83-94 . doi : 10.1016/j.cccn.2005.04.038 . PMID 16165119 . 
  2. ↑ نيرين، ب.؛ بيترسون، ب.؛ وأولين، م. (يناير 1993). "التسلسل المصغر للحمض النووي في الطور الصلب باستخدام مقايسة الكشف عن بيروفوسفات غير عضوي إنزيمي ضوئي" . الكيمياء الحيوية التحليلية . 208 (1): 171-175 . doi : 10.1006/abio.1993.1024 . ISSN 0003-2697 . PMID 8382019. تاريخ الاسترجاع: 28 أكتوبر 2025 .  {{cite journal}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )
  3. 1 2 3 غيمراوي، ميرنا؛ تيجيرو، نيكول فرنانديز؛ دنكان، جورج؛ ماكورد، بروس (2023). "التسلسل الناري: المنهجية الجنائية الحالية والتطبيقات المستقبلية - مراجعة" . Electrophoresis . 44 ( 1-2 ): 298-312 . doi : 10.1002/elps.202200177 . ISSN 1522-2683 . PMID 36168852 .  
  4. ↑ أولين، م. (31 أغسطس 1989). "الفصل المغناطيسي للحمض النووي" . مجلة نيتشر (لندن) . 340 (6236): 733-734 . Bibcode : 1989Natur.340..733U . doi : 10.1038/340733a0 . PMID 2770876. تاريخ الاسترجاع: 28 أكتوبر 2025 . 
  5. ↑ نيرين، بال ولوندين، آرني (ديسمبر 1985). "طريقة إنزيمية للرصد المستمر لتخليق بيروفوسفات غير عضوي" . الكيمياء الحيوية التحليلية . 151 (2): 504-509 . doi : 10.1016/0003-2697(85)90211-8 . ISSN 0003-2697 . PMID 3006540. تاريخ الاسترجاع: 28 أكتوبر 2025 .  {{cite journal}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )
  6. ↑ "كلية العلوم الهندسية في الكيمياء والتكنولوجيا الحيوية والصحة" .
  7. ^ مارغوليس، م. إيغولم، م. التمان، نحن؛ عطية، س.؛ بدر، شبيبة؛ بمبين، لوس أنجلوس؛ بركا،. برافرمان، MS؛ تشن، Y.-J؛ تشن، Z .؛ ديويل، بينالي الشارقة؛ دو، ل.؛ فييرو، JM. جوميز، الخامس عشر؛ جودوين، قبل الميلاد. هو، دبليو؛ هيلجيسين، S .؛ هو، CH؛ إيرزيك، GP؛ جاندو، SC؛ ألينكير، ملي؛ جارفي، تي بي؛ جيراج، كيلو بايت. كيم، J.-B. نايت، جي آر؛ لانزا، الابن؛ ليمون، ج.ه. ليفكويتز، إس إم؛ لي، م. لي، J.؛ لوهمان، كوالالمبور. لو، ه.؛ ماخيجاني، VB. ماكداد، KE. ماكينا، النائب؛ مايرز، إي دبليو؛ نيكرسون، إي. نوبيل، جي آر؛ بلانت، ر.؛ بوك، ب.ب.؛ رونان، م.ت.؛ روث، ج.ت.؛ ساركيس، ج.ج.؛ سيمونز، ج.ف.؛ سيمبسون، ج.و.؛ سرينيفاسان، م.؛ تارتارو، ك.ر.؛ توماش، أ.؛ فوغت، ك.أ.؛ فولكمر، ج.أ.؛ وانغ، ش.هـ.؛ وانغ، ي.؛ وينر، م.ب.؛ يو، ب.؛ بيغلي، ر.ف.؛ وروثبيرغ، ج.م. (31 يوليو 2005). "تسلسل الجينوم في مفاعلات بيكولتر عالية الكثافة مصنعة بتقنية النانو" . مجلة نيتشر (لندن) . 437 (7057): 376-380 . Bibcode : 2005Natur.437..376M . doi : 10.1038/nature03959 . PMC 1464427. PMID 16056220 .  {{cite journal}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )
  8. ١ ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ فريق عمل شركة كياجين (٤ أغسطس ٢٠١٧). "نظرة عامة على تقنية ومنصة التسلسل الناري" . مركز المعرفة والدعم/مركز المعرفة/التكنولوجيا والبحث/مركز موارد التسلسل الناري (Qiagen.com) . تم الاطلاع عليه بتاريخ ٤ أغسطس ٢٠١٧ .
  9. ١ ٢ ٣ ٤ فريق عمل بيوتاج. "تاريخ بيوتاج" . Biotage.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ ١٩ سبتمبر ٢٠٢٢ .
  10. ↑ هولمر، مارك (17 أكتوبر 2013). "روش تغلق قسم علوم الحياة 454 مع تقليص تركيزها على تسلسل الجينات" . فيرس بيوتك . تم الاطلاع عليه بتاريخ 28 أكتوبر 2015 .