الكتلة المولية المطلقة

الكتلة المولية المطلقة هي عملية تستخدم لتحديد خصائص الجزيئات .

استندت أولى القياسات المطلقة للأوزان الجزيئية (أي التي أُجريت دون الرجوع إلى المعايير) إلى الخصائص الفيزيائية الأساسية وعلاقتها بالكتلة المولية. وكان من أكثر هذه القياسات فائدةً قياس الضغط الأسموزي عبر الأغشية والترسيب .

كان من الممكن أيضًا اتباع نهج آلي مطلق آخر مع تطوير نظرية تشتت الضوء على يد ألبرت أينشتاين ، وتشاندراسيكارا فينكاتا رامان ، وبيتر ديباي ، وبرونو هـ. زيم ، وآخرين. تمثلت مشكلة القياسات التي أُجريت باستخدام قياس الضغط الأسموزي الغشائي والترسيب في أنها لم تُحدد سوى الخصائص الكلية لعينة البوليمر . علاوة على ذلك، كانت هذه القياسات تستغرق وقتًا طويلاً للغاية وعرضة لأخطاء المُشغل . وللحصول على معلومات حول خليط متعدد التشتت من الكتل المولية، طُوّرت طريقة لفصل الأحجام المختلفة. وقد تحقق ذلك من خلال ظهور كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC). تعتمد كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي على حقيقة أنه يمكن تصغير مسام مادة التعبئة لأعمدة الكروماتوغرافيا بما يكفي لتستقر الجزيئات مؤقتًا في فراغاتها البينية. أثناء مرور العينة عبر العمود، تقضي الجزيئات الأصغر وقتًا أطول في هذه الفراغات مقارنةً بالجزيئات الأكبر، التي لديها أماكن أقل "للتجول". والنتيجة هي فصل العينة وفقًا لحجمها الهيدروديناميكي.${\displaystyle V_{h}}$ونتيجةً لذلك، تخرج الجزيئات الكبيرة أولاً، ثم تتبعها الجزيئات الصغيرة في المذيب. وباختيار مادة تعبئة مناسبة للعمود، يُمكن تحديد دقة الفصل في النظام. كما يُمكن دمج الأعمدة على التوالي لزيادة الدقة أو توسيع نطاق الأحجام المدروسة.

تتمثل الخطوة التالية في تحويل زمن خروج العينات من المحاليل إلى قياس للكتلة المولية. وهذا ممكن لأنه إذا عُرفت الكتلة المولية لمادة قياسية، فإن زمن خروجها من المحاليل يساوي كتلة مولية محددة. وباستخدام عدة مواد قياسية، يمكن إنشاء منحنى معايرة يربط بين الزمن والكتلة المولية. وهذا مهم لتحليل البوليمرات، إذ يمكن إثبات أن بوليمرًا واحدًا يحتوي على مكونات عديدة، ويؤثر تعقيد هذه المكونات وتوزيعها على خصائصه الفيزيائية. مع ذلك، لهذه التقنية عيوبها. فعلى سبيل المثال، تُقاس العينات المجهولة دائمًا نسبةً إلى مواد قياسية معروفة، وقد تتشابه هذه المواد القياسية مع العينة المراد تحليلها أو لا. ثم تُحوّل القياسات التي تُجرى بواسطة كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC) رياضيًا إلى بيانات مشابهة لتلك التي تُحصل عليها التقنيات الحالية.

تكمن المشكلة في أن النظام تمت معايرته وفقًا لخصائص Vh لمعايير البوليمر، وهي خصائص لا ترتبط مباشرةً بالكتلة المولية. فإذا لم تكن العلاقة بين الكتلة المولية وVh للمعيار مماثلة لتلك الخاصة بالعينة المجهولة، فإن المعايرة تصبح غير صالحة. لذا، ولضمان الدقة، يجب أن تستخدم المعايرة نفس البوليمر، بنفس البنية، في نفس المذيب، وأن يكون له نفس التفاعل مع المذيب، حيث أن طبقة التميؤ تُغير Vh.

أظهر بينوا وزملاؤه أن مراعاة الحجم الهيدروديناميكي من شأنه حل المشكلة. في منشوره، بيّن بينوا أن جميع البوليمرات الاصطناعية تخرج على نفس المنحنى عند رسم لوغاريتم اللزوجة الذاتية مضروبًا في الكتلة المولية مقابل حجم الإخراج. هذا هو أساس المعايرة الشاملة التي تتطلب استخدام مقياس لزوجة لقياس اللزوجة الذاتية للبوليمرات. وقد ثبتت فعالية المعايرة الشاملة مع البوليمرات المتفرعة، والبوليمرات المشتركة، وكذلك البوليمرات النجمية.

للحصول على نتائج كروماتوغرافية جيدة، يجب ألا يكون هناك أي تفاعل مع العمود باستثناء التفاعل الناتج عن الحجم. ومع ازدياد متطلبات خصائص البوليمر، ازدادت الحاجة إلى الحصول على معلومات دقيقة حول الكتلة المولية والحجم. وقد كان هذا الأمر بالغ الأهمية في التطبيقات الصيدلانية، حيث قد تؤدي التغيرات الطفيفة في الكتلة المولية (مثل التكتل ) أو الشكل إلى اختلاف في النشاط البيولوجي . بل قد يكون لهذه التغيرات تأثير ضار بدلاً من التأثير المفيد.

لحساب الكتلة المولية، تتطلب أجهزة تشتت الضوء قياس شدة الضوء المتشتت عند زاوية الصفر. وهذا غير عملي لأن مصدر الليزر سيطغى على شدة الضوء المتشتت عند زاوية الصفر. لذا، يوجد بديلان: إما القياس عند زاوية قريبة جدًا من الصفر، أو القياس عند زوايا متعددة ثم الاستقراء باستخدام نموذج (رايلي، رايلي-جانز-ديباي، بيري، مي، إلخ) حتى زاوية الصفر.

كانت أجهزة تشتت الضوء التقليدية تعمل عن طريق أخذ قراءات من زوايا متعددة، حيث تُقاس كل زاوية على حدة. وفي أوائل سبعينيات القرن الماضي، طُوّر نظام تشتت الضوء بزاوية منخفضة، مما سمح باستخدام قياس واحد لحساب الكتلة المولية. ورغم أن القياسات عند الزوايا المنخفضة أفضل لأسباب فيزيائية أساسية (إذ تميل الجزيئات إلى تشتيت ضوء أكثر في الاتجاهات ذات الزوايا المنخفضة مقارنةً بالزوايا العالية)، إلا أن أحداث التشتت عند الزوايا المنخفضة الناتجة عن الغبار وتلوث الطور المتحرك تُطغى بسهولة على تشتت الضوء من الجزيئات المراد دراستها. وعندما شاع استخدام تقنية تشتت ضوء الليزر بزاوية منخفضة (LALLS) في سبعينيات ومنتصف ثمانينيات القرن الماضي، لم تكن المرشحات ذات الجودة العالية والمخصصة للاستخدام لمرة واحدة متوفرة بسهولة، ولذا حظيت القياسات متعددة الزوايا بالأفضلية.

تم اختراع تشتت الضوء متعدد الزوايا في منتصف الثمانينيات، وكانت الأجهزة من هذا النوع قادرة على إجراء القياسات عند الزوايا المختلفة في وقت واحد، ولكن لم يكن ذلك حتى أواخر الثمانينيات (10-12) عندما أصبح ربط كاشفات تشتت ضوء الليزر متعدد الزوايا (MALS) بأنظمة SEC اقتراحًا عمليًا يمكّن من تحديد كل من الكتلة المولية والحجم من كل شريحة من جزء البوليمر.

يمكن تطبيق قياسات تشتت الضوء على البوليمرات الاصطناعية والبروتينات والمستحضرات الصيدلانية والجسيمات مثل الليبوسومات والمذيلات والبروتينات المغلفة. تُجرى القياسات بنمطين: نمط غير مجزأ ( نمط الدفعات) أو نمط التدفق المستمر (باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي، أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء، أو أي طريقة أخرى لتجزئة التدفق ). تُجرى تجارب نمط الدفعات إما بحقن عينة في خلية التدفق باستخدام محقنة أو باستخدام قوارير منفصلة. تُستخدم هذه القياسات غالبًا لقياس الأحداث المحددة زمنيًا مثل تفاعلات الأجسام المضادة مع المستضدات أو تجميع البروتينات . كما يمكن استخدام قياسات نمط الدفعات لتحديد معامل الفيروس الثاني (A2)، وهو قيمة تُعطي مقياسًا لاحتمالية التبلور أو التجمع في مذيب معين. يمكن استخدام تجارب التدفق المستمر لدراسة المواد الخارجة من أي مصدر تقريبًا. وبشكل أكثر شيوعًا، تُربط أجهزة الكشف بمجموعة متنوعة من أنظمة الفصل الكروماتوغرافي المختلفة. إن القدرة على تحديد كتلة وحجم المواد التي يتم فصلها تجمع بين ميزة نظام الفصل والقياس المطلق لكتلة وحجم الأنواع التي يتم فصلها.

يُتيح إضافة كاشف تشتت الضوء الساكن (SLS) الموصول بنظام كروماتوغرافي الاستفادة من تقنية الفصل الكروماتوغرافي الاستبعادي الحجمي (SEC) أو ما شابهها، بالإضافة إلى ميزة الكشف المطلق. تعتمد بيانات تشتت الضوء كليًا على حاصل ضرب إشارة تشتت الضوء في التركيز؛ ولا يُؤثر زمن الاستخلاص، ويمكن تغيير الفصل لعينات مختلفة دون الحاجة إلى إعادة المعايرة. علاوة على ذلك، يُمكن استخدام طريقة فصل غير قائمة على الحجم، مثل كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) أو كروماتوغرافيا الأيونات (IC). وبما أن كاشف تشتت الضوء يعتمد على الكتلة، فإنه يزداد حساسية مع ازدياد الكتلة المولية. لذا، فهو أداة ممتازة للكشف عن التكتل. وكلما زاد عدد التكتلات، زادت حساسية الكاشف.

تُجرى قياسات LALS عند زاوية منخفضة جدًا حيث يكون متجه التشتت شبه معدوم. لا تحتاج LALS إلى أي نموذج لمطابقة التغير الزاوي، وبالتالي فهي توفر قياسات أكثر دقة للأوزان الجزيئية للجزيئات الكبيرة. مع ذلك، لا تُعطي LALS وحدها أي مؤشر على متوسط ​​الجذر التربيعي لنصف القطر.

تعتمد قياسات تشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS) على حساب كمية الضوء المتشتت عند كل زاوية مُكتشفة. ويستند هذا الحساب إلى شدة الضوء المقاسة وكفاءة الكم لكل كاشف. ثم يُستخدم نموذج لتقريب شدة الضوء المتشتت عند زاوية الصفر. بعد ذلك، تُربط شدة الضوء المتشتت عند زاوية الصفر بالكتلة المولية.

كما ذُكر سابقًا، يُمكن لكاشف MALS أيضًا توفير معلومات حول حجم الجزيء. هذه المعلومات هي الجذر التربيعي المتوسط ​​لنصف قطر الجزيء (RMS أو Rg). يختلف هذا عن Rh المذكور أعلاه والذي يأخذ طبقة التميؤ في الاعتبار. يُعرَّف الجذر التربيعي المتوسط ​​لنصف القطر رياضيًا بأنه مجموع أنصاف أقطار الجزيء مضروبًا في الكتلة عند ذلك القطر.

• أ. أينشتاين ، حوليات الفيزياء 33 (1910)، 1275
• سي في رامان، المجلة الهندية للفيزياء 2 (1927)، 1
• ب. ديباي، مجلة الفيزياء التطبيقية 15 (1944)، 338
• BH Zimm, J. Chem. Phys. 13 (1945), 141
• BH Zimm, J. Chem. Phys. 16 (1948), 1093
• بي إتش زيم، آر إس شتاين، وبي دوتي، النشرة السياسية 1 (1945)، 90
• م. فيكسمان، مجلة الكيمياء الفيزيائية 23 (1955)، 2074
• إيه سي أوانو ودبليو كاي جيه بولي. الخيال العلمي. أ1(12) (1974)، 1151
• ز. غروبيسيتش، ب. ريمب، وهـ. بينوا، مجلة علوم البوليمرات، 5 (1967)، 753
• كاشف MALS ذو التدفق عبر، DLS 800، شركة ساينس سبكتروم.
• بي جيه وايت، سي جاكسون، وجي كي وايت، المجلة الأمريكية للمختبرات 20(6) (1988)، 86
• بي جيه وايت، دي إل هيكس، سي جاكسون، وجي كي وايت، المجلة الأمريكية للمختبرات 20(6) (1988)، 106
• سي. جاكسون، إل إم نيلسون، وبي جيه وايت، مجلة العلوم التطبيقية للبوليمرات 43 (1989)، 99