تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل

📅 آخر تحديث: ٣٠ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣٠ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 3 صور
الموسوعة الحرة

تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل ( OE-PCR ) هو نوع من تفاعل البوليميراز المتسلسل ( PCR ) . ويُعرف أيضًا باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل للوصل عن طريق تمديد التداخل / الوصل عن طريق تمديد النتوء (SOE-PCR) . يُستخدم هذا التفاعل لتجميع عدة شظايا صغيرة من الحمض النووي المزدوج في تسلسل حمض نووي أكبر. ويُستخدم OE-PCR على نطاق واسع لإدخال طفرات في نقاط محددة في التسلسل أو لتجميع تسلسل حمض نووي مخصص من شظايا حمض نووي صغيرة في عديد نيوكليوتيدات أكبر . [ 1 ]

عملية ربط جزيئات الحمض النووي

تُظهر هذه الصورة كيف يمكن استخدام تقنية OE-PCR لربط سلسلتين من الحمض النووي (الأحمر والأزرق). تشير الأسهم إلى النهايات 3'

كما هو الحال في معظم تفاعلات البلمرة المتسلسلة (PCR)، يُستخدم بادئان - واحد لكل طرف - لكل تسلسل. لربط جزيئين من الحمض النووي، تُستخدم بادئات خاصة عند الأطراف المراد ربطها. لكل جزيء، تُصمم البادئة عند الطرف المراد ربطه بحيث يكون لها نتوء 5' مكمل لنهاية الجزيء الآخر. بعد التزاوج، عند حدوث التضاعف، يُمدد الحمض النووي بتسلسل جديد مكمل للجزيء المراد ربطه به. بمجرد تمديد كلا جزيئي الحمض النووي بهذه الطريقة، يُخلطان ويُجرى تفاعل البلمرة المتسلسلة باستخدام البادئات الخاصة بالأطراف البعيدة فقط. ستعمل التسلسلات التكميلية المتداخلة المُدخلة كبادئات، وسيتم دمج التسلسلين. تتميز هذه الطريقة عن تقنيات ربط الجينات الأخرى بعدم حاجتها إلى مواقع تقييد.

للحصول على إنتاجية أعلى، يتم استخدام بعض البادئات بكميات زائدة كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل .

إدخال الطفرات

توضح هذه الصورة كيف يمكن استخدام تقنية OE-PCR لحذف تسلسل من شريط الحمض النووي DNA

لإدخال طفرة في تسلسل الحمض النووي، يُصمَّم بادئٌ مُحدَّد . قد يحتوي البادئ على استبدالٍ واحد أو على تسلسلٍ جديدٍ في طرفه 5'. إذا لزم حذف جزءٍ من التسلسل، يُضاف تسلسلٌ يقع في الطرف 5' من الجزء المحذوف، لأن الطرف 3' للبادئ يجب أن يكون مُكمِّلاً للشريط القالب حتى يتمكن البادئ من الارتباط به بشكلٍ كافٍ.

بعد ارتباط البادئ بالقالب، تستمر عملية تضاعف الحمض النووي حتى نهاية القالب. يتم فصل سلسلتي الحمض النووي، ثم يرتبط البادئ الثاني بسلسلة الحمض النووي المتكونة حديثًا، والتي تحتوي على تسلسل من البادئ الأول. تستمر عملية التضاعف لإنتاج سلسلة من التسلسل المطلوب، والتي تحتوي على الطفرة.

يُعاد فصل سلسلتي الحمض النووي المزدوجتين، ويستطيع البادئ الأول الآن الارتباط بسلسلة الحمض النووي الأخيرة. يستمر تفاعل التضاعف لإنتاج قطعة من الحمض النووي ثنائية السلاسل بالكامل . بعد دورات إضافية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الحمض النووي، يمكن فصل العينة بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز ، متبوعًا بالاستخلاص الكهربائي لجمعها.

يُعدّ توليد قليل النوكليوتيدات بكفاءة ، التي يزيد طولها عن 110 نيوكليوتيدات، أمرًا بالغ الصعوبة. لذا، لإدخال طفرة في تسلسل يتجاوز ما يسمح به بادئ بطول 110 نيوكليوتيدات، من الضروري استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل. في هذا التفاعل، يُستخدم التسلسل المراد تعديله لإنتاج سلسلتين معدلتين، تحملان الطفرة عند طرفيهما المتقابلين، وذلك باستخدام التقنية المذكورة سابقًا. بعد الخلط والفصل، تُترك السلسلتان لتتحدا لتكوين ثلاث تركيبات مختلفة كما هو موضح في الرسم التخطيطي. يسمح فقط الجزيء المزدوج، الخالي من التداخل عند الطرف 5'، بالتمديد بواسطة بوليميراز الحمض النووي في الاتجاه من 3' إلى 5'.

بعد تمديد تفاعل OE-PCR، يتم إخضاع مزيج PCR أو الأجزاء المفصولة ذات الحجم المناسب لتفاعل PCR عادي، باستخدام البادئات الخارجية المستخدمة في تفاعلات PCR الأولية المسببة للطفرات.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مزيج من تقنية OE-PCR وتقنية PCR غير المتماثلة لتحسين كفاءة الطفرات الموجهة للموقع . [ 2 ]

تطبيقات في الاستنساخ الجزيئي

توضح الصورة الخطوات الرئيسية الثلاث لتفاعل OE-PCR.

إلى جانب إدخال الطفرات، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل (OE-PCR) على نطاق واسع لتجميع تسلسلات الحمض النووي المعقدة دون إدخال نيوكليوتيدات غير مرغوب فيها في أي موضع. وهذا ممكن لأن OE-PCR يعتمد على استخدام نهايات متراكبة مكملة لتوجيه عملية الربط غير المندوب لقطع الحمض النووي المخصصة بالترتيب المطلوب. هذه هي الميزة الرئيسية لـ OE-PCR وطرق الاستنساخ الأخرى القائمة على التماثل الطويل، مثل تجميع جيبسون ، والتي تتغلب على قيود طرق الاستنساخ التقليدية القائمة على هضم إنزيمات التقييد والربط . [ 3 ]

تتألف عملية تجميع تسلسلات الحمض النووي المخصصة باستخدام تقنية OE-PCR من ثلاث خطوات رئيسية. أولًا، يتم تضخيم تسلسلات الحمض النووي الفردية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من قوالب مختلفة، وتُحاط هذه التسلسلات بالزوائد التكميلية المطلوبة. ثانيًا، تُدمج نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُحصل عليها سابقًا في تفاعل PCR لتمديد التداخل، حيث ترتبط الزوائد التكميلية بشكل ثنائي، مما يسمح للبوليميراز بتمديد سلسلة الحمض النووي. أخيرًا، تُستخدم بادئات خارجية تستهدف الزوائد الخارجية، ويتم تضخيم ناتج الحمض النووي المطلوب في تفاعل PCR النهائي.

الاعتبارات الفنية

يعتمد نجاح تجميع الحمض النووي بتقنية OE-PCR على عدة عوامل، أهمها الخصائص الجوهرية لتسلسل الحمض النووي المراد تجميعه، وتسلسل وطول النهايات المتداخلة، وتصميم البادئات الخارجية للتضخيم النهائي، وظروف تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). عادةً، يمكن دمج من 2 إلى 6 قطع في تفاعل OE-PCR واحد. [ 4 ] يجب ألا يقل طول النهايات المتداخلة عن 40 نيوكليوتيدًا لضمان التفاعل الكافي بين القطع. تُصمم بادئات التضخيم النهائية عادةً وفقًا للإرشادات العامة لتفاعل البلمرة المتسلسل، ولكن بتركيز أقل من 2 إلى 5 مرات مقارنةً بتفاعلات البلمرة المتسلسل القياسية، حيث ثبت أن ذلك يقلل من التضخيم غير المرغوب فيه. [ 5 ] بالإضافة إلى ذلك ، يُوصى بشدة باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المُصححة.

مراجع

  1. ↑ هيغوتشي ر، كروميل ب، سايكي ر (1988). "طريقة عامة لتحضير شظايا الحمض النووي في المختبر وإجراء طفرات محددة عليها: دراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 16 (15): 7351-7367 . doi : 10.1093/nar/16.15.7351 . PMC 338413. PMID 3045756 .  
  2. ↑ شياو، يو-هوا؛ ين، مينغ-هوي؛ هو، لي؛ لو، مينغ؛ باي، يان (2007-06-01). "طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل غير المتماثل، متجاوزةً التنقية الوسيطة وتضخيم القالب الأصلي في الطفرات الموجهة للموقع" . رسائل التكنولوجيا الحيوية . 29 (6): 925-930 . doi : 10.1007/s10529-007-9327-4 . ISSN 1573-6776 . PMID 17356793. S2CID 1765921 .   
  3. ↑ بيهتيلا، بروك. "البلازميدات 101: تجميع جيبسون وطرق الاستنساخ الأخرى القائمة على التماثل الطويل" . blog.addgene.org . تم الاطلاع عليه بتاريخ 7 أبريل 2023 .
  4. ↑ لو، وي-غوي؛ ليو، هوي-تشن؛ لين، وان-هوانغ؛ كبير، محمد همايون؛ سو، يي (9 سبتمبر 2013). "الوصل المتزامن لقطع متعددة من الحمض النووي في تفاعل PCR واحد" . الإجراءات البيولوجية على الإنترنت . 15 (1): 9. doi : 10.1186/1480-9222-15-9 . ISSN 1480-9222 . PMC 3847634. ​​PMID 24015676 .   
  5. ↑ هيلغارث، رولاند س.؛ لانيغان، توماس م. (2020-01-01). "تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل من أجل بناء الجينات المحورة بكفاءة" . MethodsX . 7 100759. doi : 10.1016 /j.mex.2019.12.001 . ISSN 2215-0161 . PMC 6992990. PMID 32021819 .