بيو بريك

تأسست مؤسسة BioBricks عام 2006 على يد مهندسين وعلماء كمنظمة غير ربحية بهدف توحيد معايير المكونات البيولوجية في هذا المجال. ^{[ 6 ]} وتركز المؤسسة على تطوير مجالات التكنولوجيا والقانون والتعليم والمجتمع العالمي فيما يتعلق بالبيولوجيا التركيبية . تشمل أنشطة مؤسسة BioBricks استضافة مؤتمرات SBx.0، وبرامج تقنية وتعليمية. تُعد مؤتمرات SBx.0 مؤتمرات دولية حول البيولوجيا التركيبية تُعقد في مختلف أنحاء العالم. تهدف البرامج التقنية إلى إنتاج سلسلة من المكونات البيولوجية القياسية، بينما يُسهم توسيع نطاق برامجها التعليمية في إنشاء مصادر مفتوحة وموحدة للمكونات البيولوجية. ^{[ 7 ]}

كبديل لأنظمة براءات الاختراع التقليدية في مجال التقنية الحيوية، وسعيًا لتمكين استخدام BioBricks كمعيار مجتمعي مفتوح المصدر، أنشأت مؤسسة BioBricks اتفاقية BioBrick العامة، التي تتألف من اتفاقية المساهمين واتفاقية المستخدمين. يوقع الراغبون في المساهمة بجزء من المشروع على اتفاقية المساهمين، متعهدين بعدم المطالبة بحقوق الملكية الفكرية التي يملكها المساهمون والتي قد تحد من استخدام المواد المُساهم بها. ويحق لموقعي اتفاقية المستخدمين استخدام جميع الأجزاء المُقدمة من المساهمين بحرية. ولا يُشترط على المستخدمين المساهمة في المشروع لاستخدام هذه الأجزاء، ويحق لهم المطالبة بحقوق الملكية الفكرية للاختراعات التي يتم تطويرها باستخدامها. ^{[ 8 ]} تسمح اتفاقية المستخدمين للمستخدمين بإثبات اختراع استخدامات الأجزاء، والكشف عن براءات اختراع تركيبات الأجزاء، والبناء بحرية على مساهمات المستخدمين الآخرين. ^{[ 9 ] [ 10 ]}

طُوِّر معيار التجميع رقم 10 بواسطة توم نايت، وهو المعيار الأكثر استخدامًا. يعتمد هذا المعيار على استخدام إنزيمات القطع . كل جزء من BioBrick عبارة عن تسلسل DNA محمول على بلازميد دائري يعمل كناقل . ^{[ 12 ]} يعمل الناقل كنظام نقل لأجزاء BioBrick. تمثلت الخطوة الأولى نحو وضع معيار BioBrick في إدخال تسلسلات قياسية، وهي تسلسلات البادئة واللاحقة، التي تُحيط بنهايتي 5 ′ و3 ′ لجزء DNA على التوالي. ^{[ 13 ]} تُشفِّر هذه التسلسلات القياسية مواقع إنزيمات قطع محددة. يُشفِّر تسلسل البادئة مواقع EcoRI (E) و Xbal (X)، بينما يُشفِّر تسلسل اللاحقة مواقع SpeI (S) و PstI (P). لا تُعتبر البادئة واللاحقة جزءًا من جزء BioBrick. ^{[ 3 ]} لتسهيل عملية التجميع، يجب ألا يحتوي جزء BioBrick نفسه على أي من مواقع القطع هذه. أثناء تجميع جزأين مختلفين، يُهضم أحد البلازميدات باستخدام إنزيمي EcoRI و SpeI . أما البلازميد الحامل لجزء BioBrick الآخر، فيُهضم باستخدام إنزيمي EcoRI و Xbal . ينتج عن ذلك بلازميدان بنهايات بارزة بطول 4 أزواج قاعدية عند طرفي 5 ′ و3 ′ . سترتبط مواقع EcoRI لأنها متكاملة مع بعضها البعض. كما سترتبط مواقع Xbal و SpeI أيضًا لأن عملية الهضم تُنتج نهايات متوافقة. الآن، أصبح كلا جزئي الحمض النووي في بلازميد واحد. يُنتج الربط موقعًا "ندبيًا" بطول 8 أزواج قاعدية بين جزئي BioBrick. ولأن الموقع الندبي هو هجين من مواقع Xbal و SpeI ، فإنه لا يُتعرف عليه بواسطة أي من إنزيمي التقييد. ^{[ 13 ]} تبقى تسلسلات البادئة واللاحقة دون تغيير نتيجةً لعملية الهضم والربط هذه، مما يسمح بخطوات تجميع لاحقة مع المزيد من أجزاء BioBrick.

يُعدّ هذا التجميع عمليةً غير قابلة للتكرار : فالتطبيقات المتعددة لا تُغيّر المنتج النهائي، وتحافظ على البادئة واللاحقة. على الرغم من أن التجميع القياسي لـ BioBrick يسمح بتكوين وحدات وظيفية، إلا أن هناك قيدًا على هذا النهج القياسي. فموقع الندبة ذو الثمانية أزواج قاعدية لا يسمح بإنشاء بروتين اندماجي . ^{[ 12 ]} يتسبب موقع الندبة في انزياح الإطار ، مما يمنع القراءة المستمرة للكودونات، وهي ضرورية لتكوين البروتين الاندماجي.

قام توم نايت لاحقًا بتطوير معيار التجميع BB-2 في عام 2008 لمعالجة مشاكل ربط ندوب نطاقات البروتين، حيث تتكون هذه الندوب من ثماني قواعد، مما يؤدي إلى إطار قراءة مختلف عند ربط نطاقات البروتين. وتتشابه الإنزيمات المستخدمة لهضم الأجزاء الأولية تقريبًا، ولكن مع تعديل البادئات واللواحق. ^{[ 14 ]}

اقترح كلٌّ من ج. كريستوفر أندرسون، وجون إي. ديوبر، وماريانا ليغيا، وغابرييل سي. وو، وجوناثان سي. غولر، وآدم ب. أركين، وجاي دي. كيسلينغ معيار التجميع BglBrick في سبتمبر 2009، وهو معيار مشابه جدًا في مفهومه لمعيار BioBrick، ولكنه يُتيح إنتاج بروتينات اندماجية دون تغيير إطار القراءة أو إدخال كودونات توقف، مع إنشاء ندبة رابطة من الأحماض الأمينية المحايدة نسبيًا (GlySer). يتكون جزء BglBrick من تسلسل DNA محاط بمواقع EcoRI وBglII في الطرف 5 ′ (GAATTCaaaA GATCT ) ومواقع BamHI وXhoI في الطرف 3 ′ ( G GATCCaaaCTCGAG)، ويفتقر إلى مواقع التقييد هذه داخليًا. يُنقى الجزء العلوي في التجميع الثنائي من هضم EcoRI/BamHI، بينما يُنقى الجزء السفلي + الناقل من هضم EcoRI/BglII. يؤدي ربط هذين الجزأين إلى تكوين جزء مركب يعيد تشكيل المواقع الجانبية الأصلية المطلوبة في تعريف الجزء، تاركًا تسلسل ندبة GGATCT عند نقطة اتصال الجزأين، وهي ندبة تشفر الأحماض الأمينية جليسين وسيرين عند دمج أجزاء CDS معًا في الإطار الصحيح، وهو أمر مناسب نظرًا لأن ثنائي الببتيد GlySer هو رابط شائع لمجالات البروتين. ^{[ 2 ]}

ابتكر مختبر بام سيلفر معيار تجميع سيلفر للتغلب على مشكلة تكوين البروتين المدمج. يُعرف هذا المعيار أيضًا باسم معيار بيوفيوجن، وهو تطوير لمعيار بيوبريك 10. يتضمن معيار سيلفر حذف نيوكليوتيد واحد من موقعي Xbal و SpeI ، مما يُقصر موقع الندبة بمقدار نيوكليوتيدين، ليُشكل تسلسل ندبة مكونًا من 6 أزواج قاعدية. يسمح هذا التسلسل بالحفاظ على إطار القراءة. يُشفّر تسلسل الندبة الحمضين الأمينيين ثريونين (ACT) وأرجينين (AGA). ^{[ 15 ]} يُتيح هذا التحسين البسيط تكوين بروتين مدمج ضمن الإطار. مع ذلك، يُعد كون الأرجينين حمضًا أمينيًا كبيرًا ومشحونًا عيبًا في تقنية تجميع بيوفيوجن، إذ تُؤدي خصائصه إلى عدم استقرار البروتين وفقًا لقاعدة النهاية الأمينية .

قدّم فريق فرايبورغ المشارك في مسابقة iGEM عام 2007 ^{[ 16 ]} معيارًا جديدًا للتجميع للتغلب على عيوب تقنية Biofusion القياسية الحالية. أنشأ الفريق مجموعة جديدة من تسلسلات البادئات واللواحق بإضافة مواقع إنزيمات تقييد إضافية، AgeI و NgoMIV، إلى البادئات واللواحق الموجودة على التوالي. تتوافق مواقع إنزيمات التقييد المُضافة حديثًا مع معيار BioBrick. لا يزال معيار فرايبورغ يُشكّل موقعًا ندبيًا بطول 6 أزواج قاعدية، لكن تسلسل الندبة (ACCGGC) يُشفّر الآن الثريونين والجليسين على التوالي. ينتج عن هذا التسلسل الندبي بروتين أكثر استقرارًا ^{[ 17 ]،} حيث يُشكّل الجليسين طرفًا أمينيًا مستقرًا، على عكس الأرجينين الذي يُشير إلى تحلل الطرف الأميني. تُقلّل تقنية التجميع التي اقترحها فريق فرايبورغ من قيود معيار Biofusion.

تُعدّ طريقة التجميع 3A الأكثر شيوعًا، نظرًا لتوافقها مع معيار التجميع 10، ومعيار سيلفر، ومعيار فرايبورغ. تتضمن هذه الطريقة جزأين من BioBrick وبلازميدًا مُستهدفًا. يحتوي البلازميد المُستهدف على جين سام (قاتل) لتسهيل اختيار البلازميد المُجمّع بشكل صحيح. كما أن البلازميدات المُستهدفة تحمل جينات مقاومة للمضادات الحيوية مختلفة عن تلك الموجودة في البلازميدات الحاملة لأجزاء BioBrick. تُهضم جميع البلازميدات الثلاثة باستخدام إنزيم تقييد مناسب، ثم تُترك لتتحد. الجزء المُجمّع بشكل صحيح فقط هو الذي يُنتج جزءًا مُركبًا قابلًا للحياة موجودًا في البلازميد المُستهدف. وهذا يُتيح اختيارًا دقيقًا، حيث أن أجزاء BioBrick المُجمّعة بشكل صحيح فقط هي التي تبقى.

لا تعتمد طريقة تجميع الإدخال المُضخّم على تسلسلات البادئات واللواحق، مما يسمح باستخدامها مع معظم معايير التجميع. كما أنها تتميز بمعدل تحويل أعلى من تجميع 3A، ولا تتطلب أن تحتوي البلازميدات المعنية على جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية. تقلل هذه الطريقة من التشويش الناتج عن البلازميدات غير المقطوعة عن طريق تضخيم الإدخال المطلوب باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قبل الهضم، ومعالجة الخليط بإنزيم التقييد DpnI ، الذي يهضم الحمض النووي المُمَثْيَل مثل البلازميدات. يؤدي التخلص من بلازميدات القالب باستخدام DpnI إلى ترك الإدخال فقط ليتم تضخيمه بواسطة PCR. ولتقليل احتمالية تكوين بلازميدات ذات تركيبات غير مرغوب فيها من الإدخال والعمود الفقري، يمكن معالجة العمود الفقري بالفوسفاتاز لمنع إعادة ربطه. ^{[ 14 ]}

تتيح طريقة جيبسون للتجميع بدون ندوب ربط عدة وحدات BioBricks في وقت واحد. تتطلب هذه الطريقة أن تتداخل التسلسلات المطلوبة بمقدار 20 إلى 150 زوجًا قاعديًا . ولأن وحدات BioBricks لا تتداخل، تتطلب هذه الطريقة استخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإنشاء نهايات بارزة بين وحدات BioBricks المتجاورة. يهاجم إنزيم T5 exonuclease النهايات 5 ′ للتسلسلات، مُنشئًا حمضًا نوويًا أحادي السلسلة في نهايات جميع التسلسلات حيث صُممت المكونات المختلفة للارتباط. ثم يُضيف إنزيم DNA polymerase أجزاء الحمض النووي إلى الفجوات في مكونات الارتباط، ويمكن لإنزيم Taq ligase إغلاق السلاسل النهائية. ^{[ 14 ]}

صُممت طريقة التجميع 4R/2M لدمج أجزاء (BioBrick Assembly Standard 10 أو Silver Standard) داخل البلازميدات الموجودة (أي بدون تفاعل البوليميراز المتسلسل أو الاستنساخ الفرعي). تتفاعل البلازميدات داخل الخلايا الحية مع إنزيمات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي المتخصصة في تسلسل الحمض النووي، بحيث يتم تعديل كل منها وحمايته من أحد إنزيمي القطع الداخليين اللذين يُستخدمان لاحقًا لتخطيط نواتج الربط الدائرية غير المرغوب فيها. ^{[ 18 ]}