الاستنساخ الجزيئي

📅 آخر تحديث: ٢٩ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٩ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 6 صور
الموسوعة الحرة
رسم تخطيطي للاستنساخ الجزيئي باستخدام البكتيريا والبلازميدات

الاستنساخ الجزيئي هو مجموعة من الأساليب التجريبية في البيولوجيا الجزيئية تُستخدم لتجميع جزيئات الحمض النووي المؤتلف وتوجيه تضاعفها داخل الكائنات الحية المضيفة . [ 1 ] يشير استخدام مصطلح "الاستنساخ" إلى أن هذه الطريقة تتضمن تضاعف جزيء واحد لإنتاج مجموعة من الخلايا ذات جزيئات الحمض النووي المتطابقة. يستخدم الاستنساخ الجزيئي عمومًا تسلسلات الحمض النووي من كائنين مختلفين: النوع الذي يمثل مصدر الحمض النووي المراد استنساخه، والنوع الذي سيعمل كمضيف حي لتضاعف الحمض النووي المؤتلف. تُعدّ طرق الاستنساخ الجزيئي أساسية في العديد من المجالات المعاصرة في البيولوجيا والطب الحديثين. [ 2 ]

في تجربة الاستنساخ الجزيئي التقليدية، يُستخلص الحمض النووي المراد استنساخه من كائن حي مُستهدف، ثم يُعالج بالإنزيمات في أنبوب اختبار لإنتاج شظايا أصغر من الحمض النووي. بعد ذلك، تُدمج هذه الشظايا مع الحمض النووي الناقل لإنتاج جزيئات الحمض النووي المُعاد تركيبه. ثم يُدخل الحمض النووي المُعاد تركيبه إلى كائن حي مُضيف (عادةً ما يكون سلالة مختبرية سهلة النمو وغير ضارة من بكتيريا الإشريكية القولونية ). ينتج عن ذلك مجموعة من الكائنات الحية التي تتضاعف فيها جزيئات الحمض النووي المُعاد تركيبه جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي للمضيف. ولأنها تحتوي على شظايا من الحمض النووي الغريب، تُسمى هذه الكائنات الحية المُعدلة وراثيًا ( GMOs ). [ 3 ] تستفيد هذه العملية من إمكانية تحفيز خلية بكتيرية واحدة على امتصاص جزيء واحد من الحمض النووي المُعاد تركيبه وتكراره. يمكن بعد ذلك تكثير هذه الخلية الواحدة بشكل أُسّي لإنتاج عدد كبير من البكتيريا، تحتوي كل منها على نسخ من الجزيء المُعاد تركيبه الأصلي. لذا، يُشار عادةً إلى كلٍّ من التجمع البكتيري الناتج وجزيء الحمض النووي المُعاد تركيبه باسم "الاستنساخ". وبالمعنى الدقيق، يشير مصطلح الحمض النووي المُعاد تركيبه إلى جزيئات الحمض النووي، بينما يشير مصطلح الاستنساخ الجزيئي إلى الطرق التجريبية المُستخدمة لتجميعها. وقد نشأت فكرة إمكانية إدخال تسلسلات مختلفة من الحمض النووي في بلازميد ، بحيث تُنقل هذه التسلسلات الغريبة إلى البكتيريا وتُنسخ كجزء من البلازميد. أي أن هذه البلازميدات يمكن أن تعمل كناقلات استنساخ لحمل الجينات. [ 4 ]

يمكن استنساخ وتضخيم أي تسلسل من الحمض النووي تقريبًا، ولكن هناك بعض العوامل التي قد تحد من نجاح هذه العملية. من أمثلة تسلسلات الحمض النووي التي يصعب استنساخها: التكرارات المعكوسة، ومواقع بدء التضاعف، والسنتروميرات، والتيلوميرات. كما تقل احتمالية النجاح عند إدخال تسلسلات الحمض النووي كبيرة الحجم. تكون نسبة نجاح الإدخالات التي يزيد حجمها عن 10 كيلو قاعدة محدودة للغاية، ولكن يمكن تعديل العاثيات، مثل العاثية λ، لإدخال تسلسل يصل حجمه إلى 40 كيلو قاعدة بنجاح. [ 5 ]

تاريخ

قبل سبعينيات القرن العشرين، كان فهم علم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية يعاني من قصور كبير نتيجة عدم القدرة على عزل ودراسة الجينات الفردية من الكائنات الحية المعقدة. تغير هذا الوضع جذريًا مع ظهور تقنيات الاستنساخ الجزيئي. سعى علماء الأحياء الدقيقة، في محاولة لفهم الآليات الجزيئية التي تحد من خلالها البكتيريا نمو العاثيات، إلى عزل إنزيمات القطع المحددة ، وهي إنزيمات قادرة على قطع جزيئات الحمض النووي فقط عند مصادفة تسلسلات محددة من الحمض النووي. [ 6 ] وقد أظهروا أن إنزيمات القطع تقطع جزيئات الحمض النووي بطول الكروموسوم في مواقع محددة، وأنه يمكن تنقية أجزاء محددة من الجزيء الأكبر حجمًا عن طريق الفصل حسب الحجم. وباستخدام إنزيم ثانٍ، هو إنزيم ربط الحمض النووي ، أمكن ربط الشظايا الناتجة عن إنزيمات القطع في تركيبات جديدة، تُسمى الحمض النووي المؤتلف . من خلال إعادة تركيب أجزاء الحمض النووي المرغوبة مع الحمض النووي الناقل، مثل العاثيات أو البلازميدات، التي تتكاثر طبيعيًا داخل البكتيريا، أمكن إنتاج كميات كبيرة من جزيئات الحمض النووي المؤتلف النقي في مزارع البكتيريا. وقد تم توليد ودراسة أولى جزيئات الحمض النووي المؤتلف في عام 1972. [ 7 ] [ 8 ]

ملخص

تستغل تقنية الاستنساخ الجزيئي حقيقة أن التركيب الكيميائي للحمض النووي (DNA) متطابقٌ أساسًا في جميع الكائنات الحية. لذا، إذا أُدخل أي جزء من الحمض النووي من أي كائن حي في جزء من الحمض النووي يحتوي على التسلسلات الجزيئية اللازمة لتضاعف الحمض النووي ، ثم أُدخل الحمض النووي المُعاد تركيبه الناتج إلى الكائن الحي الذي استُخلصت منه تسلسلات التضاعف، فإن الحمض النووي الغريب سيتضاعف جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي للخلية المضيفة في الكائن المُعدَّل وراثيًا .

يُشبه الاستنساخ الجزيئي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في كونه يسمح بتكرار تسلسل الحمض النووي. ويكمن الفرق الأساسي بين الطريقتين في أن الاستنساخ الجزيئي يتضمن تكرار الحمض النووي في كائن حي دقيق، بينما يُكرر تفاعل البوليميراز المتسلسل الحمض النووي في محلول معزول عن الخلايا الحية .

الاستنساخ والمحاكاة الحاسوبية

قبل إجراء تجارب الاستنساخ الفعلية في المختبر، تُخطط معظم هذه التجارب على الحاسوب باستخدام برامج متخصصة. ورغم إمكانية التخطيط التفصيلي للاستنساخ باستخدام أي محرر نصوص، بالإضافة إلى أدوات عبر الإنترنت لتصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على سبيل المثال، إلا أن هناك برامج مخصصة لهذا الغرض. ومن هذه البرامج، على سبيل المثال، برنامج ApE.(مفتوح المصدر)، دي إن إيه سترايدر(مفتوح المصدر)، برنامج النسخ التسلسلي(مجاناً)، كولاجين(مفتوح المصدر)، و SnapGene (تجاري). تسمح هذه البرامج بمحاكاة تفاعلات PCR ، والهضم بالإنزيمات القاطعة ، والربط ، وما إلى ذلك، أي جميع الخطوات الموضحة أدناه.

خطوات

الهدف العام من الاستنساخ الجزيئي هو أخذ جين معين من بلازميد وإدخاله في بلازميد آخر. [ 9 ] ويتم ذلك عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وتفاعل الهضم، وتفاعل الربط، والتحويل.

في تجارب الاستنساخ الجزيئي القياسية، يتضمن استنساخ أي جزء من الحمض النووي بشكل أساسي سبع خطوات: (1) اختيار الكائن المضيف وناقل الاستنساخ، (2) تحضير الحمض النووي للناقل، (3) تحضير الحمض النووي المراد استنساخه، (4) إنشاء الحمض النووي المؤتلف، (5) إدخال الحمض النووي المؤتلف في الكائن المضيف، (6) اختيار الكائنات الحية التي تحتوي على الحمض النووي المؤتلف، (7) فحص المستنسخات ذات إدخالات الحمض النووي المرغوبة والخصائص البيولوجية.

من الجدير بالذكر أن القدرة المتزايدة ودقة منصات تركيب الحمض النووي تسمح بتصميمات أكثر تعقيدًا في الهندسة الجزيئية. قد تتضمن هذه المشاريع سلاسل طويلة جدًا من تسلسل الحمض النووي الجديد و/أو اختبار مكتبات كاملة في وقت واحد، بدلًا من اختبار تسلسلات فردية. تُدخل هذه التحولات تعقيدًا يتطلب من التصميم الابتعاد عن التمثيل المسطح القائم على النيوكليوتيدات والتوجه نحو مستوى أعلى من التجريد. من أمثلة هذه الأدوات GenoCAD وTeselagen.(مجاني للأوساط الأكاديمية) أو GeneticConstructor(مجاناً للأكاديميين).

اختيار الكائن المضيف وناقل الاستنساخ

رسم تخطيطي لبلازميد استنساخ شائع الاستخدام؛ pBR322 . وهو عبارة عن قطعة دائرية من الحمض النووي يبلغ طولها 4361 قاعدة. يحتوي على جينين لمقاومة المضادات الحيوية ، مما يمنحه مقاومة للأمبيسيلين والتتراسيكلين ، بالإضافة إلى منشأ تضاعف يستخدمه المضيف لتضاعف الحمض النووي.

على الرغم من استخدام عدد كبير جدًا من الكائنات المضيفة ونواقل الاستنساخ الجزيئي، فإن الغالبية العظمى من تجارب الاستنساخ الجزيئي تبدأ بسلالة مخبرية من بكتيريا الإشريكية القولونية ( E. coli ) وناقل استنساخ بلازميدي . وتُستخدم الإشريكية القولونية ونواقل البلازميد على نطاق واسع نظرًا لتطورها التقني، وتعدد استخداماتها، وتوافرها الواسع، وقدرتها على توفير نمو سريع للكائنات المُعاد تركيبها بأقل قدر من المعدات. [ 3 ] إذا كان الحمض النووي المراد استنساخه كبيرًا جدًا (من مئات الآلاف إلى ملايين الأزواج القاعدية)، فغالبًا ما يُختار ناقل الكروموسوم الاصطناعي البكتيري [ 10 ] أو ناقل الكروموسوم الاصطناعي الخميري .

قد تتطلب التطبيقات المتخصصة أنظمة مضيف-ناقل متخصصة. على سبيل المثال، إذا رغب الباحثون في استخلاص بروتين معين من الكائن المُعاد تركيبه، فسيتم اختيار ناقل تعبير يحتوي على إشارات مناسبة لعمليتي النسخ والترجمة في الكائن المضيف المطلوب. بدلاً من ذلك، إذا رُغِبَ في تضاعف الحمض النووي في أنواع مختلفة (على سبيل المثال، نقل الحمض النووي من البكتيريا إلى النباتات)، فيمكن اختيار ناقل متعدد النطاق المضيف (يُسمى أيضًا ناقل النقل ). مع ذلك، عمليًا، تبدأ تجارب الاستنساخ الجزيئي المتخصصة عادةً بالاستنساخ في بلازميد بكتيري، يليه الاستنساخ الفرعي في ناقل متخصص.

بغض النظر عن تركيبة المضيف والناقل المستخدمة، فإن الناقل يحتوي دائمًا تقريبًا على أربعة أجزاء من الحمض النووي ذات أهمية بالغة لوظيفته وفائدته التجريبية: [ 3 ]

  • يُعدّ أصل تضاعف الحمض النووي ضروريًا لكي يتضاعف الناقل (وتسلسلاته المؤتلفة المرتبطة به) داخل الكائن المضيف
  • موقع واحد أو أكثر من مواقع التعرف الفريدة لإنزيمات التقييد لتكون بمثابة مواقع يمكن من خلالها إدخال الحمض النووي الغريب
  • جين علامة وراثية قابلة للاختيار يمكن استخدامه لتمكين بقاء الخلايا التي استوعبت تسلسلات ناقلة
  • جين مميز يمكن استخدامه لفحص الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الغريب
انقسام تسلسل الحمض النووي الذي يحتوي على موقع تقييد BamHI . يتم قطع الحمض النووي عند التسلسل المتناظر لإنتاج "نهايات لاصقة".

تحضير الحمض النووي الناقل

يُعالج ناقل الاستنساخ بإنزيم قطع داخلي لقطع الحمض النووي عند الموقع المُراد إدخال الحمض النووي الغريب فيه. يُختار إنزيم القطع بحيث يُولّد بنيةً عند موقع القطع تتوافق مع نهايات الحمض النووي الغريب (انظر نهاية الحمض النووي ). عادةً، يتم ذلك بقطع الحمض النووي للناقل والحمض النووي الغريب باستخدام نفس إنزيم القطع أو إنزيم القطع الداخلي، مثل EcoRI ، وقد عُزل هذا الإنزيم من بكتيريا الإشريكية القولونية. [ 11 ] تحتوي معظم النواقل الحديثة على مواقع قطع مُتعددة مُلائمة وفريدة ضمن جزيء الناقل (بحيث لا يُمكن قطع الناقل إلا عند موقع واحد)، وتقع هذه المواقع ضمن جين (غالبًا بيتا-جالاكتوزيداز ) يُمكن استخدام تعطيله للتمييز بين الكائنات المُعاد تركيبها وغير المُعاد تركيبها في مرحلة لاحقة من العملية. لتحسين نسبة الكائنات المُعاد تركيبها إلى الكائنات غير المُعاد تركيبها، يُمكن معالجة الناقل المُقسّم بإنزيم ( الفوسفاتاز القلوي ) الذي يُزيل الفوسفات من نهايات الناقل. جزيئات الناقل ذات النهايات المُزالة منها الفوسفات غير قادرة على التضاعف، ولا يُمكن استعادة التضاعف إلا إذا تم دمج الحمض النووي الغريب في موقع القطع. [ 12 ]

تحضير الحمض النووي المراد استنساخه

يُنتج الحمض النووي المستخدم في الاستنساخ عادةً باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR ). يُخلط الحمض النووي القالب مع القواعد (وحدات بناء الحمض النووي)، والبادئات (قطع قصيرة من الحمض النووي أحادي السلسلة المكمل)، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي الذي يبني سلسلة الحمض النووي. يمر المزيج بدورات من التسخين والتبريد لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي المنسوخ.

لاستنساخ الحمض النووي الجينومي، يُستخلص الحمض النووي المراد استنساخه من الكائن الحيّ المُراد استنساخه. يُمكن استخدام أي مصدر نسيجي تقريبًا (حتى أنسجة الحيوانات المنقرضة )، [ 13 ] طالما لم يكن الحمض النووي مُتحللًا بشكلٍ كبير. بعد ذلك، يُنقى الحمض النووي باستخدام طرق بسيطة لإزالة البروتينات المُلوثة (الاستخلاص بالفينول)، والحمض النووي الريبي (باستخدام إنزيم الريبونيوكلياز)، والجزيئات الأصغر (الترسيب و/أو الاستشراب). غالبًا ما تُستخدم تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم تسلسلات مُحددة من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ( RT-PCR ) قبل الاستنساخ الجزيئي.

يمكن الحصول على الحمض النووي (DNA) لتجارب الاستنساخ من الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي ( استنساخ الحمض النووي التكميلي أو cDNA)، أو على شكل حمض نووي اصطناعي ( تخليق الجينات الاصطناعي ). يُستخدم استنساخ cDNA عادةً للحصول على مستنسخات تمثل مجموعة mRNA للخلايا المستهدفة، بينما يُستخدم الحمض النووي الاصطناعي للحصول على أي تسلسل دقيق يحدده المصمم. قد يكون هذا التسلسل المصمم ضروريًا عند نقل الجينات عبر الشفرات الوراثية (على سبيل المثال، من الميتوكوندريا إلى النواة) [ 14 ] أو ببساطة لزيادة التعبير الجيني عبر تحسين الكودونات . [ 15 ]

يُعالج الحمض النووي المنقى بعد ذلك بإنزيم تقييد لإنتاج شظايا ذات نهايات قابلة للربط بنهايات الناقل. عند الضرورة، يمكن إضافة أجزاء قصيرة مزدوجة السلاسل من الحمض النووي ( وصلات ) تحتوي على مواقع التقييد المطلوبة لإنشاء تراكيب طرفية متوافقة مع الناقل. [ 3 ] [ 12 ]

إنتاج الحمض النووي المؤتلف باستخدام إنزيم ربط الحمض النووي

يُعدّ إنتاج الحمض النووي المُعاد تركيبه، من نواحٍ عديدة، أبسط خطوة في عملية الاستنساخ الجزيئي. يُخلط الحمض النووي المُستخلص من الناقل والمصدر الخارجي معًا بتراكيز مناسبة، ثم يُعرّض لإنزيم ( ليغاز الحمض النووي ) الذي يربط الأطراف معًا بروابط تساهمية. يُطلق على هذا التفاعل اسم الربط . يصبح خليط الحمض النووي الناتج، الذي يحتوي على أطراف مرتبطة عشوائيًا، جاهزًا بعد ذلك لإدخاله إلى الكائن الحي المُضيف.

لا يتعرف إنزيم ربط الحمض النووي (DNA ligase) إلا على نهايات جزيئات الحمض النووي الخطية ويتفاعل معها، مما ينتج عنه عادةً خليط معقد من جزيئات الحمض النووي ذات نهايات متصلة عشوائيًا. ستكون المنتجات المطلوبة (حمض نووي ناقل مرتبط تساهميًا بحمض نووي غريب) موجودة، ولكن عادةً ما توجد أيضًا تسلسلات أخرى (مثل الحمض النووي الغريب المرتبط بنفسه، وحمض نووي الناقل المرتبط بنفسه، وتراكيب ذات ترتيب أعلى من الحمض النووي الناقل والغريب). يتم فرز هذا الخليط المعقد في الخطوات اللاحقة من عملية الاستنساخ، بعد إدخال خليط الحمض النووي إلى الخلايا. [ 3 ] [ 12 ]

إدخال الحمض النووي المؤتلف إلى الكائن المضيف

يُعاد خليط الحمض النووي، الذي سبق معالجته في المختبر، إلى خلية حية، تُسمى الكائن المضيف. وتتنوع طرق إدخال الحمض النووي إلى الخلايا، وغالبًا ما يعتمد اسم هذه الخطوة في عملية الاستنساخ الجزيئي على الطريقة التجريبية المختارة (مثل التحويل ، والنقل الجيني ، والعدوى ، والتحفيز الكهربائي ). [ 3 ] [ 12 ]

عندما تتمكن الكائنات الدقيقة من امتصاص الحمض النووي (DNA) من بيئتها المحلية ونسخه، تُسمى هذه العملية بالتحول ، وتُسمى الخلايا التي تكون في حالة فسيولوجية تسمح لها بامتصاص الحمض النووي بالخلايا المؤهلة . [ 16 ] في زراعة خلايا الثدييات، تُسمى العملية المماثلة لإدخال الحمض النووي إلى الخلايا عادةً بالنقل الجيني . يتطلب كل من التحول والنقل الجيني عادةً تحضير الخلايا من خلال نظام نمو خاص وعملية معالجة كيميائية تختلف باختلاف الأنواع والخلايا المستخدمة.

تستخدم عملية التثقيب الكهربائي نبضات كهربائية عالية الجهد لنقل الحمض النووي عبر غشاء الخلية (وجدار الخلية، إن وُجد). [ 17 ] في المقابل، تتضمن عملية النقل الجيني تغليف الحمض النووي في جسيمات مشتقة من الفيروسات، واستخدام هذه الجسيمات الشبيهة بالفيروسات لإدخال الحمض النووي المُغلّف إلى الخلية من خلال عملية تُشبه العدوى الفيروسية. على الرغم من أن التثقيب الكهربائي والنقل الجيني طريقتان متخصصتان للغاية، إلا أنهما قد تكونان أكثر الطرق فعالية لنقل الحمض النووي إلى الخلايا.

اختيار الكائنات الحية التي تحتوي على تسلسلات ناقلة

أياً كانت الطريقة المستخدمة، فإن إدخال الحمض النووي المُعاد تركيبه إلى الكائن المضيف المُختار عادةً ما يكون عملية منخفضة الكفاءة؛ أي أن نسبة ضئيلة فقط من الخلايا ستمتص الحمض النووي فعلياً. ويتعامل العلماء التجريبيون مع هذه المشكلة من خلال خطوة الانتقاء الجيني الاصطناعي، حيث تُقتل الخلايا التي لم تمتص الحمض النووي بشكل انتقائي، ولا تنجو إلا الخلايا القادرة على نسخ الحمض النووي الذي يحتوي على جين العلامة الانتقائية المُشفّر بواسطة الناقل. [ 3 ] [ 12 ]

عند استخدام الخلايا البكتيرية ككائنات مضيفة، يكون الواسم الانتقائي عادةً جينًا يُكسب مقاومةً لمضاد حيوي قاتل ، كالأمبيسيلين مثلاً . تنجو الخلايا الحاملة للبلازميد عند تعرضها للمضاد الحيوي، بينما تموت الخلايا التي لم تستوعب تسلسلات البلازميد. وعند استخدام خلايا الثدييات (كالخلايا البشرية أو الفأرية)، تُستخدم استراتيجية مماثلة، إلا أن الجين الواسم (الذي يُشفّر عادةً كجزء من كاسيت kanMX ) يُكسب مقاومةً للمضاد الحيوي جينيتيسين .

فحص المستنسخات ذات إدخالات الحمض النووي المرغوبة والخصائص البيولوجية

تستخدم نواقل الاستنساخ البكتيرية الحديثة (مثل pUC19 ومشتقاتها اللاحقة، بما في ذلك نواقل pGEM) نظام الفرز الأزرق والأبيض لتمييز مستعمرات (مستنسخات) الخلايا المعدلة وراثيًا عن تلك التي تحتوي على الناقل الأصلي (أي الحمض النووي للناقل بدون إدخال تسلسل مُعاد التركيب). في هذه النواقل، يُدخل الحمض النووي الغريب في تسلسل يُشفّر جزءًا أساسيًا من إنزيم بيتا-جالاكتوزيداز ، وهو إنزيم يؤدي نشاطه إلى تكوين مستعمرة زرقاء اللون على وسط الاستنبات المستخدم في هذه الدراسة. يُعطّل إدخال الحمض النووي الغريب في تسلسل ترميز بيتا-جالاكتوزيداز وظيفة الإنزيم، بحيث تبقى المستعمرات التي تحتوي على الحمض النووي المُحوّل عديمة اللون (بيضاء). لذلك، يستطيع الباحثون بسهولة تحديد مستنسخات البكتيريا المعدلة وراثيًا وإجراء المزيد من الدراسات عليها، مع تجاهل تلك التي لا تحتوي على الحمض النووي المُعاد تركيبه.

يُطلق على مجموع النسخ المستنسخة الفردية التي يتم الحصول عليها في تجربة الاستنساخ الجزيئي اسم مكتبة الحمض النووي . قد تكون المكتبات بالغة التعقيد (كما هو الحال عند استنساخ الحمض النووي الجينومي الكامل من كائن حي) أو بسيطة نسبيًا (كما هو الحال عند نقل جزء من الحمض النووي المستنسخ مسبقًا إلى بلازميد مختلف)، ولكن من الضروري دائمًا تقريبًا فحص عدد من النسخ المستنسخة المختلفة للتأكد من الحصول على بنية الحمض النووي المطلوبة. يمكن تحقيق ذلك من خلال مجموعة واسعة جدًا من الأساليب التجريبية، بما في ذلك استخدام تهجين الأحماض النووية ، ومجسات الأجسام المضادة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحليل قطع التقييد ، و/أو تسلسل الحمض النووي . [ 3 ] [ 12 ]

التطبيقات

يُتيح الاستنساخ الجزيئي للعلماء الحصول على كمية غير محدودة تقريبًا من أي جزء من الحمض النووي (DNA) مُستخلص من أي جينوم. ويمكن استخدام هذه المادة في طيف واسع من الأغراض، بما في ذلك تلك المتعلقة بالعلوم البيولوجية الأساسية والتطبيقية. وفيما يلي ملخص لبعض أهم هذه التطبيقات.

تنظيم الجينوم والتعبير الجيني

لقد أدى الاستنساخ الجزيئي بشكل مباشر إلى توضيح التسلسل الكامل للحمض النووي لجينومات عدد كبير جدًا من الأنواع وإلى استكشاف التنوع الجيني داخل الأنواع الفردية، وهو عمل تم إنجازه في الغالب عن طريق تحديد تسلسل الحمض النووي لأعداد كبيرة من أجزاء الجينوم المستنسخة عشوائيًا، وتجميع التسلسلات المتداخلة.

على مستوى الجينات الفردية، تُستخدم النسخ الجزيئية لإنتاج مجسات تُستخدم لدراسة كيفية التعبير الجيني ، وكيفية ارتباط هذا التعبير بعمليات بيولوجية أخرى، بما في ذلك البيئة الأيضية، والإشارات خارج الخلوية، والنمو، والتعلم، والشيخوخة، وموت الخلايا. كما تُتيح الجينات المستنسخة أدوات لدراسة الوظيفة البيولوجية وأهمية الجينات الفردية، من خلال تمكين الباحثين من تعطيل الجينات، أو إحداث طفرات دقيقة باستخدام الطفرات الموضعية أو الطفرات الموجهة للموقع . وتُوفر الجينات المستنسخة في نواقل التعبير للاستنساخ الوظيفي وسيلةً لفحص الجينات بناءً على وظيفة البروتين المُعبَّر عنه.

إنتاج البروتينات المؤتلفة

يمكن أن يؤدي الحصول على النسخة الجزيئية لجين ما إلى تطوير كائنات حية تُنتج البروتين الناتج عن هذا الجين، والذي يُسمى البروتين المُعاد تركيبه. عمليًا، غالبًا ما يكون تطوير كائن حي يُنتج الشكل النشط من البروتين المُعاد تركيبه بكميات كافية أصعب من استنساخ الجين نفسه. ويعود ذلك إلى أن الإشارات الجزيئية للتعبير الجيني معقدة ومتغيرة، ولأن طي البروتين واستقراره ونقله قد يكون أمرًا بالغ الصعوبة.

تتوفر حاليًا العديد من البروتينات المفيدة كمنتجات مُعاد تركيبها . وتشمل هذه البروتينات: (1) البروتينات ذات الفائدة الطبية التي يُمكن أن يُصحح إعطاؤها جينًا معيبًا أو ضعيف التعبير (مثل العامل الثامن المُعاد تركيبه ، وهو عامل تخثر الدم الذي يُعاني من نقص في بعض أنواع الهيموفيليا ، [ 18 ] والأنسولين المُعاد تركيبه ، المُستخدم لعلاج بعض أنواع داء السكري [ 19 ] )، (2) البروتينات التي يُمكن إعطاؤها للمساعدة في حالات الطوارئ المُهددة للحياة (مثل مُنشط البلازمينوجين النسيجي ، المُستخدم لعلاج السكتات الدماغية [ 20 ] )، (3) لقاحات الوحدات الفرعية المُعاد تركيبها، حيث يُمكن استخدام بروتين مُنقى لتحصين المرضى ضد الأمراض المُعدية، دون تعريضهم للعامل المُعدي نفسه (مثل لقاح التهاب الكبد ب [ 21 ] )، و(4) البروتينات المُعاد تركيبها كمادة قياسية لاختبارات التشخيص المختبرية.

الكائنات المعدلة وراثيًا

بعد تحديد خصائص الجينات المستنسخة ومعالجتها لتوفير الإشارات اللازمة للتعبير الجيني المناسب، يمكن إدخالها في الكائنات الحية، مما يُنتج كائنات معدلة وراثيًا، تُعرف أيضًا بالكائنات المعدلة وراثيًا (GMOs). على الرغم من أن معظم الكائنات المعدلة وراثيًا تُنتج لأغراض البحث البيولوجي الأساسي (انظر على سبيل المثال، الفأر المعدل وراثيًا )، فقد طُوّر عدد منها للاستخدام التجاري، بدءًا من الحيوانات والنباتات التي تُنتج المستحضرات الصيدلانية أو مركبات أخرى ( الزراعة الدوائية )، ونباتات المحاصيل المقاومة لمبيدات الأعشاب ، والأسماك الاستوائية المتألقة ( GloFish ) للترفيه المنزلي. [ 1 ]

العلاج الجيني

تتضمن المعالجة الجينية تزويد الخلايا التي تفتقر إلى وظيفة جينية بجين وظيفي، بهدف تصحيح اضطراب وراثي أو مرض مكتسب. ويمكن تقسيم المعالجة الجينية بشكل عام إلى فئتين. الأولى هي تعديل الخلايا الجنسية، أي الحيوانات المنوية أو البويضات، مما ينتج عنه تغيير جيني دائم للكائن الحي بأكمله والأجيال اللاحقة. ويعتبر الكثيرون هذا النوع من المعالجة الجينية، المعروف باسم "المعالجة الجينية للخلايا الجنسية"، غير أخلاقي عند تطبيقه على البشر. [ 22 ] أما النوع الثاني من المعالجة الجينية، وهو "المعالجة الجينية للخلايا الجسدية"، فيشبه عملية زرع الأعضاء. في هذه الحالة، يتم استهداف نسيج واحد أو أكثر من خلال المعالجة المباشرة أو عن طريق استئصال النسيج، وإضافة الجين أو الجينات العلاجية في المختبر، ثم إعادة الخلايا المعالجة إلى المريض. وقد بدأت التجارب السريرية للمعالجة الجينية للخلايا الجسدية في أواخر التسعينيات، وكان الهدف الرئيسي منها علاج السرطانات واضطرابات الدم والكبد والرئة. [ 23 ]

على الرغم من الدعاية الكبيرة والوعود الكثيرة، اتسم تاريخ العلاج الجيني البشري بنجاح محدود نسبيًا. [ 23 ] غالبًا ما يؤدي إدخال جين إلى الخلايا إلى تخفيف جزئي أو مؤقت فقط لأعراض المرض المُعالَج. وقد عانى بعض المرضى الذين خضعوا لتجارب العلاج الجيني من آثار جانبية للعلاج نفسه، بما في ذلك الوفاة. في بعض الحالات، تنتج هذه الآثار الجانبية عن تعطيل جينات أساسية في جينوم المريض عن طريق الإدخال الجيني. وفي حالات أخرى، تلوثت النواقل الفيروسية المستخدمة في العلاج الجيني بفيروس مُعدٍ. ومع ذلك، لا يزال يُنظر إلى العلاج الجيني على أنه مجال واعد في الطب، ويشهد نشاطًا بحثيًا وتطويريًا مكثفًا.

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 واتسون، جيه دي (2007). الحمض النووي المؤتلف: الجينات والمجينات: دورة قصيرة . سان فرانسيسكو: دبليو إتش فريمان. ISBN 978-0-7167-2866-5.
  2. ↑ باتن سي إل، جليك بي آر، باستيرناك جيه (2009). التكنولوجيا الحيوية الجزيئية: مبادئ وتطبيقات الحمض النووي المؤتلف . واشنطن العاصمة: مطبعة الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة. ISBN 978-1-55581-498-4.
  3. 1 2 3 4 5 6 7 8 براون، ت. (2006). استنساخ الجينات وتحليل الحمض النووي: مقدمة . كامبريدج، ماساتشوستس: بلاكويل للنشر. ISBN 978-1-4051-1121-8.
  4. ↑ غاريت، آر إتش، وغريشام، سي إم (2013). الكيمياء الحيوية ( الطبعة الخامسة). بروكس/كول، سينغيج ليرنينغ. رقم ISBN  978-1-133-10629-6. OCLC 777722371 . 
  5. ↑ غاريت، آر إتش، وغريشام، سي إم (2010). الكيمياء الحيوية ( الطبعة الرابعة). بلمونت، كاليفورنيا، بروكس/كول: سينغيج ليرنينغ. ص 380. ISBN   978-0-495-10935-8. OCLC 297392560 . 
  6. ↑ ناثانز د، سميث هـ.و. (1975). "إنزيمات القطع المحددة في تحليل وإعادة هيكلة جزيئات الحمض النووي". المراجعة السنوية للكيمياء الحيوية . 44 : 273-293 . doi : 10.1146/annurev.bi.44.070175.001421 . PMID 166604 . 
  7. ↑ كوهين إس إن، تشانغ إيه سي، بوير إتش دبليو، هيلينغ آر بي (نوفمبر 1973). "بناء بلازميدات بكتيرية وظيفية بيولوجيًا في المختبر" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 70 (11): 3240-3244 . Bibcode : 1973PNAS...70.3240C . doi : 10.1073/pnas.70.11.3240 . PMC 427208. PMID 4594039 .  
  8. ↑ جاكسون، د. أ.، سيمونز، ر. هـ.، بيرغ، ب. (أكتوبر 1972). "طريقة كيميائية حيوية لإدخال معلومات وراثية جديدة في الحمض النووي لفيروس SV40: جزيئات دائرية من الحمض النووي SV40 تحتوي على جينات عاثية لامدا وأوبيرون الجالاكتوز من الإشريكية القولونية" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 69 (10): 2904-2909 . Bibcode : 1972PNAS...69.2904J . doi : 10.1073/pnas.69.10.2904 . PMC 389671. PMID 4342968 .  
  9. ↑ "البلازميد / البلازميدات | تعلم العلوم على موقع Scitable" . www.nature.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 2017-12-06 .
  10. ↑ شيزويا هـ، بيرين ب، كيم يو جيه، مانشينو ف، سليباك ت، تاتشيري ي، سيمون م (سبتمبر 1992). "استنساخ وحفظ مستقر لقطع من الحمض النووي البشري بطول 300 كيلو قاعدة في بكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام ناقل قائم على عامل F" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 89 (18): 8794-7 . Bibcode : 1992PNAS...89.8794S . doi : 10.1073/pnas.89.18.8794 . PMC 50007. PMID 1528894 .  
  11. ↑ بينغود أ، يلتش أ (سبتمبر 2001). "بنية ووظيفة إنزيمات القطع من النوع الثاني" . أبحاث الأحماض النووية . 29 (18): 3705-3727 . doi : 10.1093/nar/29.18.3705 . PMC 55916. PMID 11557805 .  
  12. 1 2 3 4 5 6 راسل، د. و.، وسامبروك، ج. (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر . كولد سبرينغ هاربور، نيويورك: مختبر كولد سبرينغ هاربور. ISBN 978-0-87969-576-7.
  13. ↑ هيغوتشي ر، باومان ب، فرايبرغر م، رايدر أو أ، ويلسون أ س (1984). "تسلسلات الحمض النووي من الكواجا، وهو حيوان منقرض من فصيلة الخيول". مجلة نيتشر . 312 (5991): 282-284 . Bibcode : 1984Natur.312..282H . doi : 10.1038/312282a0 . PMID 6504142. S2CID 4313241 .  
  14. ↑ بوميناتان أ، فان هوزر س، باسستي ن، باورز ك، كرامبتون أ ل، وانغ إكس، وآخرون . (نوفمبر 2016). "التعبير النووي المستقر لجيني ATP8 وATP6 يُنقذ طفرةً مُعطّلةً في مُركّب الحمض النووي للميتوكوندريا الخامس" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 44 (19): 9342-9357 . doi : 10.1093/nar/gkw756 . PMC 5100594. PMID 27596602 .   
  15. ↑ بلوتكين جيه بي، كودلا جي (يناير 2011). "مترادف ولكن ليس متطابقًا: أسباب ونتائج انحياز الكودون" . مراجعات الطبيعة. علم الوراثة . 12 (1): 32-42 . doi : 10.1038 / nrg2899 . PMC 3074964. PMID 21102527 .  
  16. ↑ ليدربيرغ ج (فبراير 1994). "تحول علم الوراثة بواسطة الحمض النووي: احتفال بذكرى أفيري وماكلويد وماكارتي (1944)" . علم الوراثة . 136 (2): 423-426 . doi : 10.1093/genetics/136.2.423 . PMC 1205797. PMID 8150273 .  
  17. ↑ ويرث ر، فريزنيغر أ، فيدلر س (مارس 1989). "تحويل أنواع مختلفة من البكتيريا سالبة الغرام تنتمي إلى 11 جنسًا مختلفًا بواسطة التحويل الكهربائي". علم الوراثة الجزيئية والعامة . 216 (1): 175-177 . doi : 10.1007/BF00332248 . PMID 2659971. S2CID 25214157 .  
  18. ↑ أولدنبورغ ج، دولان ج، ليم ج (يناير 2009). "رعاية مرضى الهيموفيليا : الماضي والحاضر والمستقبل" . الهيموفيليا . 15 (ملحق 1): 2-7 . doi : 10.1111/j.1365-2516.2008.01946.x . PMID 19125934. S2CID 29118026 .  
  19. ↑ مجلة الطب (نوفمبر 1989). "الأنسولين البشري: أول دواء بتقنية الحمض النووي". المجلة الأمريكية لصيدلة المستشفيات . 46 (11 ملحق 2): S9-11. PMID 2690608 . 
  20. ↑ ليفاندوفسكي سي، بارسان دبليو (فبراير 2001). "علاج السكتة الدماغية الإقفارية الحادة". حوليات طب الطوارئ . 37 (2): 202-216 . doi : 10.1067/mem.2001.111573 . PMID 11174240 . 
  21. ↑ تشانغ إم إتش ، تشين سي جيه ، لاي إم إس، هسو إتش إم، وو تي سي، كونغ إم إس، ليانغ دي سي، شاو دبليو واي، تشين دي إس (يونيو 1997). "التطعيم الشامل ضد التهاب الكبد ب في تايوان ومعدل الإصابة بسرطان الخلايا الكبدية لدى الأطفال. مجموعة دراسة سرطان الكبد لدى الأطفال في تايوان" . مجلة نيو إنجلاند الطبية . 336 (26): 1855-1859 . doi : 10.1056/NEJM199706263362602 . PMID 9197213 . 
  22. ↑ أغسطس جيه تي (1997). العلاج الجيني . المجلد 40. دار النشر الأكاديمية. ص 508. ISBN   978-0-08-058132-3.
  23. 1 2 فايفر أ، فيرما آي إم (2001). "العلاج الجيني: وعود ومشاكل". المراجعة السنوية لعلم الجينوم وعلم الوراثة البشرية . 2 : 177-211 . doi : 10.1146/annurev.genom.2.1.177 . PMID 11701648 . 

للمزيد من القراءة

  • شعار ويكيميديا ​​كومنزوسائط متعلقة بالاستنساخ الجزيئي على ويكيميديا ​​كومنز