العناصر المتحركة المرتبطة بتقنية كريسبر

📅 آخر تحديث: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

تُعدّ العناصر المتحركة المرتبطة بتقنية كريسبر ( CASTs ) عناصر وراثية متنقلة ( MGEs ) تطورت لتستخدم أنظمة كريسبر بسيطة لنقل الحمض النووي (DNA) الموجه بواسطة الحمض النووي الريبوزي (RNA). [ 1 ] على عكس أنظمة كريسبر التقليدية التي تحتوي على آليات تداخل لتحليل الحمض النووي المستهدف، تفتقر العناصر المتحركة المرتبطة بتقنية كريسبر إلى البروتينات و/أو نطاقات البروتين المسؤولة عن قطع الحمض النووي. [ 2 ] تتحد آلية العناصر المتحركة المتخصصة، المشابهة لتلك الموجودة في عنصر Tn7 المتحرك المعروف جيدًا ، مع الحمض النووي الريبوزي لكريسبر (crRNA) وبروتينات Cas المرتبطة به لإتمام عملية النقل. [ 1 ] تم توصيف أنظمة العناصر المتحركة المرتبطة بتقنية كريسبر في مجموعة واسعة من البكتيريا، وتستخدم تكوينات كريسبر متنوعة، بما في ذلك النوع IF، والنوع IB، والنوع IC، والنوع ID، والنوع IE، والنوع IV، والنوع VK. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] لا تزال العناصر الجينية المتحركة (MGEs) جزءًا مهمًا من التبادل الجيني عبر النقل الجيني الأفقي ، وقد ثبت تورط أنظمة CRISPR في تبادل آليات مقاومة المضادات الحيوية والدفاع المضاد للفيروسات، بالإضافة إلى الجينات المشاركة في استقلاب الكربون المركزي. [ 5 ] [ 6 ] تُظهر هذه الأنظمة إمكانات واعدة في الهندسة الوراثية نظرًا لقابليتها للبرمجة، ومرونة تسلسل PAM، وقدرتها على الإدخال مباشرةً في جينوم العائل دون حدوث كسور في الحمض النووي المزدوج، مما يستلزم تنشيط آليات إصلاح العائل. [ 3 ] [ 7 ]  كما أنها تفتقر إلى بروتيني Cas1 وCas2، ولذلك تعتمد على أنظمة CRISPR أخرى أكثر اكتمالًا لاكتساب الفواصل في عملية النقل الجيني العابر. [ 2 ] [ 3 ]

البنية والوظيفة الطبيعية

تُشبه العناصر المتحركة المرتبطة بتقنية كريسبر عنصر Tn7 المتحرك الذي يعمل بآلية القص واللصق. [ 1 ] يحتوي هذا العنصر على إنزيم ترانسبوزاز غير متجانس يتكون من بروتيني TnsA وTnsB، وبروتين منظم TnsC. [ 1 ] أظهر التحليل البنيوي ارتباط بروتين TnsB بتسلسلات محددة على نهايات العنصر المتحرك، مما يسمح باستئصاله وحركته. [ 8 ] يتم استهداف التكامل بواسطة بروتيني TnsD أو TnsE اللذين يستهدفان بشكل تفضيلي مواقع آمنة داخل كروموسوم الخلية المضيفة أو العناصر المتحركة (البلازميدات أو العاثيات)، على التوالي. [ 1 ] لا يوجد بروتين TnsE في عناصر CAST، ولكن يوجد نظير لبروتين TnsD، وهو TniQ، الذي يعمل على سد الفجوة بين إنزيم الترانسبوزاز ونظام كريسبر-كاس. [ 9 ] وُجد أن أنواعًا متعددة من تقنية كريسبر ترتبط بالترانسبوزونات، ومن أكثرها دراسةً النوع IF، الذي يستخدم مُؤثرًا متعدد الوحدات الفرعية (كاسكيد)، والنوع VK، الذي يستخدم مُؤثرًا واحدًا هو Cas12k. [ 3 ] [ 7 ] في كلتا الحالتين، تطورت ترانسبوزونات Tn7 لتستفيد من هذه المُؤثرات لإنشاء حلقات R للتكامل في مواقع محددة. [ 3 ] بينما يوجد TnsA في أنظمة النوع IF، فإنه غائب بشكل ملحوظ في أنظمة النوع VK التي أظهرت معدلات تكامل خارج الهدف أعلى خلال التوصيف الأولي. [ 3 ] [ 10 ]

النوع IF-3

تم التعرف على نوع IF-3 CAST (Tn6677) لأول مرة في ضمة الكوليرا، وقد خضع لدراسات مستفيضة. [ 7 ] يحتوي هذا النظام على البروتينات TnsA وTnsB وTnsC التي ترتبط بـ Cas6 وCas7 وبروتين Cas5-Cas8 المدمج من خلال تفاعلاتها مع TniQ. [ 9 ] تشمل خطوات التكامل الأولية ارتباط TniQ-Cascade بالموقع المستهدف، واستئصال TnsA وTnsB للترانسبوزون، يليه ارتباط TnsC بـ TniQ وارتباط الترانسبوزاز بـ TnsC. [ 9 ] قد يحدث استهداف غير مقصود قبل هذه الخطوة الأخيرة، ولكن ارتباط TnsB وTnsC يؤدي إلى خطوة تدقيق نهائية للحفاظ على نسبة عالية من الاستهداف الصحيح. [ 11 ] تم التحقق من صحة تكامل Tn6677 بكفاءة تقارب 100% في مواقع محددة في نقاط متعددة من جينوم العائل. [ 7 ] كما تم توصيف أنظمة أخرى والتحقق من صحتها في هذه الفئة بنطاقات متفاوتة من الكفاءة، وتشمل أنظمة متعامدة لعمليات الإدخال المتعددة حتى 10 كيلوبايت. [ 6 ] [ 12 ]

من الخصائص الفريدة لأنظمة النوع IF-3 وجود جزيئات RNA موجهة ذاتية الاستهداف تُستخدم لاستهداف كروموسوم الخلية المضيفة. وقد حصرت هذه الأنظمة الفواصل المقابلة باستخدام جزيئات crRNA غير نمطية تمنع أنظمة النوع 1F الداخلية من استخدام هذه الجزيئات الموجهة وآليات التداخل الخاصة بها لتدمير الخلية المضيفة. [ 13 ] ومن آليات الحصر الأخرى استخدام خاصية تحمل عدم التطابق، مما يسمح لأنظمة CAST فقط باستهداف مواقع في الجينوم دون الحاجة إلى تطابق تام مع الفاصل. [ 13 ]

النوع VK

تم توصيف نظام النوع VK في الأصل من بكتيريا زرقاء ، Scytonema hofmanni، ويحتوي على مُؤثِّر Cas واحد، Cas12k، يعمل مع tracrRNA . [ 3 ] يعمل هذا النظام بشكل مشابه لـ Tn7 ولكنه لا يحتوي على بروتين TnsA، مما قد يؤدي إلى استهداف غير مُستهدف وتكوين هجين أثناء الإفراط في التعبير. [ 10 ] يرتبط مُركَّب Cas12k وtracrRNA بالموقع المُستهدف، ويتم بلمرة TnsC مُباشرةً بجواره قبل ارتباط TniQ وتعرّف TnsB عليه ودمجه. [ 14 ] في حين أن هذه الأنظمة تستخدم tracrRNA التقليدي الخاص بأنظمة CRISPR من النوع الثاني، إلا أنها تستطيع أيضًا الاستهداف باستخدام crRNA قصير يقع بجوار نهاية الترانسبوزون. [ 15 ] تستهدف فواصل النوع VK بشكل تفضيلي المواقع القريبة من جينات tRNA، ولكن لوحظت مواقع أخرى في أدلة crRNA القصيرة هذه التي تم الحصول عليها بوسائل غير تقليدية. [ 15 ]

تطبيقات في الهندسة الوراثية

استُخدمت عناصر النقل المرتبطة بتقنية كريسبر لتحرير الجينات في المختبر وفي الكائنات الحية ، وذلك في مواقع مختلفة، وفي عوائل مختلفة، وبحمولات جينية متنوعة. جُمعت جميع مكونات نظام Tn6677 من ضمة الكوليرا (Vibrio cholerae) في بلازميد واحد ، وثبتت قدرته على توصيل عناصر نقل يصل طولها إلى 10 كيلوبايت بكفاءة تقارب 100%. [ 16 ] كما ثبت ذلك في سياق مجتمعي، حيث أدى التوصيل الاقتراني لناقلات الانتحار إلى توفير مقاومة للمضادات الحيوية أو تحسين الوظائف الأيضية لميكروب واحد فقط. [ 17 ] أُجريت معظم الدراسات الأولية لتوصيف هذه الأنظمة في بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) ، ولكن تم تأكيد فعاليتها في بكتيريا بيتا بروتيو وجاما بروتيو بكفاءة عالية، وفي بكتيريا ألفا بروتيو بكفاءة أقل نوعًا ما. [ 18 ] كما ثبت أن بلازميد Tn6677 يعمل في خلايا HEK293T البشرية، مما يُشير إلى إمكانية استخدامه علاجيًا في المستقبل. [ 19 ]

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 6 بيترز جيه إي، ماكاروفا كيه إس، شماكوف إس، كونين إي في (أغسطس 2017). "استقطاب أنظمة كريسبر-كاس بواسطة عناصر النقل الشبيهة بـ Tn7" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 114 (35): E7358– E7366 . Bibcode : 2017PNAS..114E7358P . doi : 10.1073/pnas.1709035114 . PMC 5584455. PMID 28811374 .  
  2. 1 2 3 Faure G, Shmakov SA, Yan WX, Cheng DR, Scott DA, Peters JE, et al. (أغسطس 2019). " تقنية كريسبر-كاس في العناصر الوراثية المتنقلة: الدفاع المضاد وما بعده" . مجلة نيتشر ريفيوز. علم الأحياء الدقيقة . 17 (8): 513-525 . doi : 10.1038 / s41579-019-0204-7 . PMC 11165670. PMID 31165781. S2CID 174809341 .    
  3. 1 2 3 4 5 6 7 ستريكر ج، لادها أ، غاردنر ز، شميد-بورغك ج ل، ماكاروفا ك س، كونين إي ف، تشانغ ف (يوليو 2019). "إدخال الحمض النووي الموجه بالحمض النووي الريبي باستخدام ناقلات مرتبطة بتقنية كريسبر" . مجلة ساينس . 365 (6448): 48-53 . Bibcode : 2019Sci...365...48S . doi : 10.1126/science.aax9181 . PMC 6659118. PMID 31171706 .  
  4. ↑ ريبارسكي جيه آر، هو كيه، هيل إيه إم، ويلك سي أو، فينكلستين آي جيه (ديسمبر 2021). " الاكتشاف الميتاجينومي للعناصر المتحركة المرتبطة بتقنية كريسبر" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 118 (49). Bibcode : 2021PNAS..11812279R . doi : 10.1073/pnas.2112279118 . PMC 8670466. PMID 34845024 .  
  5. ↑ بنلر إس، فور جي، ألتاي-تران إتش، شماكوف إس، تشنغ إف، كونين إي (ديسمبر 2021). جيوفانوني إس جيه (محرر). "تتضمن جينات الحمولة في عناصر النقل الشبيهة بـ Tn7 تنوعًا هائلاً من أنظمة الدفاع، والعناصر الوراثية المتنقلة، وجينات مقاومة المضادات الحيوية" . mBio . 12 ( 6): e0293821. doi : 10.1128/mBio.02938-21 . PMC 8649781. PMID 34872347 .  
  6. 1 2 كلومبي إس إي، جابر ن، به إل واي، موهابير جيه تي، بيرنهايم أ، ستيرنبرغ إس إتش (فبراير 2022). " التنوع التطوري والآلي للترانسبوزونات المرتبطة بتقنية كريسبر من النوع IF" . الخلية الجزيئية . 82 (3): 616-628.e5. doi : 10.1016/j.molcel.2021.12.021 . PMC 8849592. PMID 35051352 .  
  7. 1 2 3 4 كلومبي إس إي، فو بي إل، هالبين-هيلي تي إس، ستيرنبرغ إس إتش (يوليو 2019). "أنظمة كريسبر-كاس المشفرة بواسطة الترانسبوزون توجه تكامل الحمض النووي الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي". نيتشر . 571 ( 7764): 219-225 . doi : 10.1038/s41586-019-1323-z . PMID 31189177. S2CID 189817057 .  
  8. ↑ كازمارسكا زد، كزارنوكي-سيسيورا إم، جوريكا-ميناكوسكا كم، وينجو آر جيه، جاكيويتز جيه، زاجكو دبليو، وآخرون . (يوليو 2022). "الأساس الهيكلي للتعرف على نهاية الترانسبوزون يشرح السمات المركزية لأنظمة تبديل Tn7" . الخلية الجزيئية . 82 (14): 2618-2632.e7. دوى : 10.1016/j.molcel.2022.05.005 . بمك 9308760 . بميد 35654042 .   
  9. 1 2 3 هالبين-هيلي تي إس، كلومبي إس إي، ستيرنبرغ إس إتش، فرنانديز آي إس (يناير 2020). "الأساس البنيوي لاستهداف الحمض النووي بواسطة نظام CRISPR-Cas المشفر بواسطة ترانسبوزون". نيتشر . 577 ( 7789): 271-274 . doi : 10.1038/s41586-019-1849-0 . PMID 31853065. S2CID 209410376 .  
  10. 1 2 تو سي جيه، أور بي، كلاينستايفر بي بي (يوليو 2023). "إدخال دقيق للحمض النووي بتقنية القص واللصق باستخدام ناقلات الحمض النووي المرتبطة بتقنية كريسبر من النوع VK المُهندسة". مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 41 (7): 968-979 . doi : 10.1038/s41587-022-01574-x . PMID 36593413. S2CID 255464426 .  
  11. ↑ هوفمان إف تي، كيم إم، بيه إل واي، وانغ جيه، فو بي إل، جيلسينجر دي آر، وآخرون . (سبتمبر 2022). "التجنيد الانتقائي لبروتين TnsC يعزز دقة النقل الموجه بالحمض النووي الريبي" . مجلة نيتشر . 609 (7926): 384-393 . Bibcode : 2022Natur.609..384H . doi : 10.1038/s41586-022-05059-4 . PMC 10583602. PMID 36002573 .   
  12. ↑ روبرتس أ، نيثري إم إيه، بارانجو آر (نوفمبر 2022). "التوصيف الوظيفي لأنواع مختلفة من عناصر النقل المرتبطة بتقنية كريسبر من النوع IF" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 50 (20): 11670-11681 . doi : 10.1093/nar/gkac985 . PMC 9723613. PMID 36384163 .  
  13. 1 2 بيتاسي إم تي، هسيه إس سي، بيترز جيه إي (ديسمبر 2020). "تصنيف الحمض النووي الريبوزي الدليلي يُمكّن من اختيار الموقع المستهدف في عناصر النقل Tn7-CRISPR-Cas" . مجلة Cell . 183 (7): 1757–1771.e18. doi : 10.1016 /j.cell.2020.11.005 . PMC 7770071. PMID 33271061 .  
  14. ↑ كيركيس، آي.، شميتز، إم.، أوبرلي، إس.، شانيز، سي.، جينيك، إم. (نوفمبر 2021). "اختيار الموقع المستهدف وإعادة تشكيله بواسطة أنظمة CRISPR-transposon من النوع الخامس" . مجلة نيتشر . 599 (7885): 497-502 . Bibcode : 2021Natur.599..497Q . doi : 10.1038/s41586-021-04030- z . PMC 7613401. PMID 34759315 .  
  15. 1 2 سايتو إم، لادا أ، ستريكر جي، فور جي، نيومان إي، ألتاي-تران إتش، وآخرون . (أبريل 2021). “الأنماط المزدوجة لتوجيه الترانسبوزون المرتبط بـ CRISPR” . خلية . 184 (9): 2441-2453.e18. دوى : 10.1016/j.cell.2021.03.006 . بمك 8276595 . بميد 33770501 .   
  16. ↑ فو بي إل، روندا سي، كلومبي إس إي، تشين إي إي، أكري سي، وانغ إتش إتش، ستيرنبرغ إس إتش (أبريل 2021). "إنزيمات التكامل الموجهة بتقنية كريسبر الحمض النووي الريبي لهندسة جينوم بكتيري متعددة عالية الكفاءة" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 39 (4): 480-489 . doi : 10.1038/s41587-020-00745-y . PMC 10583764. PMID 33230293 .  
  17. ↑ روبين، بي. إي.، دايموند، إس.، كريس، بي. إف.، كريتس-كريستوف، إيه.، لو، واي. سي.، بورخيس، إيه. إل.، وآخرون . (يناير 2022). "تحرير الجينوم الخاص بالأنواع والمواقع في المجتمعات البكتيرية المعقدة" . مجلة نيتشر مايكروبيولوجي . 7 (1): 34-47 . doi : 10.1038/s41564-021-01014-7 . PMC 9261505. PMID 34873292 .   
  18. ↑ تروخيو رودريغيز إل، إلينغتون إيه جيه، رايش سي آر، شيفريت إم جي (يوليو 2023). "الترانسبوزاز المرتبط بتقنية كريسبر للطفرات الموجهة في أنواع مختلفة من البروتيوكتيريا" . مجلة ACS للبيولوجيا التركيبية . 12 (7): 1989-2003 . doi : 10.1021/acssynbio.3c00065 . PMC 10367135. PMID 37368499 .  
  19. ↑ لامبي جي دي، كينغ آر تي، هالبين-هيلي تي إس، كلومبي إس إي، هوغان إم آي، فو بي إل، وآخرون . (مارس 2023). "دمج الحمض النووي المستهدف في الخلايا البشرية دون حدوث كسور في السلسلة المزدوجة باستخدام ناقلات الحمض النووي المرتبطة بتقنية كريسبر" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 42 (1): 87-98 . doi : 10.1038/s41587-023-01748-1 . PMC 10620015. PMID 36991112 .