تسلسل الببتيدات من الصفر

عند انكسار روابط السلسلة الرئيسية، تتشكل ستة أنواع مختلفة من أيونات التسلسل كما هو موضح في الشكل 1. تُصنف أيونات الشظايا المشحونة في الطرف الأميني إلى a أو b أو c، بينما تُصنف أيونات الشظايا المشحونة في الطرف الكربوكسيلي إلى x أو y أو z. يشير الرمز السفلي n إلى عدد بقايا الأحماض الأمينية. اقترح روبستورف وفولمان هذه التسمية لأول مرة، ثم عدّلها بييمان وأصبحت النسخة الأكثر قبولًا على نطاق واسع. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

من بين هذه الأيونات المتسلسلة، تعد الأيونات a و b و y أكثر أنواع الأيونات شيوعًا، خاصة في مطياف الكتلة منخفض الطاقة الناتج عن التفكك الناجم عن التصادم (CID)، نظرًا لأن رابطة أميد الببتيد (CO-NH) هي الأكثر عرضة للتلف وفقدان CO من الأيونات b.

كتلة أيونات بيتا = مجموع (كتل البقايا) + 1 (H ⁺ )

كتلة أيونات y = مجموع (كتل البقايا) + 19 (H ₂ O+H ⁺ )

كتلة أيونات ألفا = كتلة أيونات بيتا - 28 (CO)

ينتج عن انشطار العمود الفقري المزدوج أيونات داخلية، من نوع الأسيليوم مثل H₂N _- CHR₂ ^- CO-NH-CHR₃ ^- CO⁺ أو من نوع الإيمونيوم مثل H₂N _- CHR₂ ^- CO-NH⁺ ⁼ CHR₃ ^. وعادةً ما تُشكل هذه الأيونات اضطرابًا في الأطياف.

يحدث انقسام إضافي تحت تأثير CID عالي الطاقة عند السلسلة الجانبية لبقايا الطرف الكربوكسيلي، مما يؤدي إلى تكوين أيونات d _n و v _n و w _n . ^{[ 8 ]}

معظم الأيونات المجزأة هي أيونات b أو y. كما تُلاحظ أيونات a بشكل متكرر نتيجة فقدان CO من أيونات b. ^{[ 9 ]}

تتشكل الأيونات التابعة (أيونات w _{n و} v _n و d _{n ) بواسطة CID عالي الطاقة.}

تؤدي الأيونات المحتوية على Ser- و Thr- و Asp- و Glu- إلى فقدان جزيئي محايد للماء (-18).

تؤدي الأيونات المحتوية على Asn- و Gln- و Lys- و Arg- إلى فقدان جزيئي متعادل للأمونيا (-17).

يؤدي فقدان الأمونيا المحايد من الأرجينين إلى أيونات مجزأة (y-17) أو أيونات (b-17) ذات وفرة أعلى من أيوناتها المقابلة.

عندما يحتوي الطرف الكربوكسيلي على بقايا قاعدية، فإن الببتيد يولد أيون (b _{n-1 +18).}

يمكن ملاحظة زوج أيوني متكامل في أطياف الأيونات متعددة الشحنات. في هذا الزوج الأيوني، يساوي مجموع أرقامه السفلية العدد الإجمالي لبقايا الأحماض الأمينية في الببتيد المجهول.

إذا كان الطرف الكربوكسيلي هو Arg أو Lys، فيمكن العثور على أيون y ₁ في الطيف لإثبات ذلك.

في عملية التفكك الناجم عن التصادم منخفض الطاقة (CID)، تُعد أيونات b و y الأيونات الناتجة الرئيسية. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ فقدان الأمونيا (-17 دالتون) في الجزء الذي يحتوي على أحماض أمينية RKNQ. كما لوحظ فقدان الماء (-18 دالتون) في الجزء الذي يحتوي على أحماض أمينية STED. ولم تظهر أيونات ثانوية في الأطياف.

في التفكك الناتج عن التصادم عالي الطاقة، يمكن ملاحظة جميع أنواع الأيونات المجزأة المختلفة ولكن لا توجد خسائر في الأمونيا أو الماء.

في تفكك نقل الإلكترون (ETD) وتفكك التقاط الإلكترون (ECD)، تكون الأيونات السائدة هي c و y و z+1 و z+2 وأحيانًا أيونات w.

بالنسبة لتحلل ما بعد المصدر (PSD) في MALDI ، فإن أيونات a و b و y هي أكثر أيونات المنتج شيوعًا.

العوامل المؤثرة على التجزئة هي حالة الشحنة (كلما زادت حالة الشحنة، قلت الطاقة اللازمة للتجزئة)، وكتلة الببتيد (كلما زادت الكتلة، زادت الطاقة المطلوبة)، والطاقة المستحثة (تؤدي الطاقة الأعلى إلى مزيد من التجزئة)، وتسلسل الأحماض الأمينية الأساسي، وطريقة التفكك، وغاز التصادم.

تتمثل إحدى الطرق القديمة في سرد ​​جميع الببتيدات المحتملة لأيون السلائف في طيف الكتلة، ومطابقة طيف الكتلة لكل مرشح مع الطيف التجريبي. الببتيد المحتمل الذي يمتلك الطيف الأكثر تشابهًا سيكون لديه أعلى فرصة ليكون التسلسل الصحيح. مع ذلك، قد يكون عدد الببتيدات المحتملة كبيرًا. على سبيل المثال، يحتوي ببتيد سلائف ذو وزن جزيئي 774 على 21,909,046 ببتيدًا محتملاً. على الرغم من أن هذه العملية تتم باستخدام الحاسوب، إلا أنها تستغرق وقتًا طويلاً. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

هناك طريقة أخرى تُسمى "التسلسل الفرعي"، والتي بدلاً من سرد التسلسل الكامل للببتيدات المحتملة، تُطابق تسلسلات قصيرة من الببتيدات التي تُمثل جزءًا فقط من الببتيد الكامل. عند العثور على تسلسلات تُطابق أيونات التجزئة في الطيف التجريبي بدرجة عالية، يتم توسيعها بإضافة بقايا الأحماض الأمينية واحدة تلو الأخرى للعثور على أفضل تطابق. ^{[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

في الطريقة الثالثة، يُستخدم عرض البيانات بيانيًا، حيث تُربط أيونات التجزئة التي لها نفس فرق الكتلة لحمض أميني واحد بخطوط. بهذه الطريقة، يسهل الحصول على صورة واضحة لسلسلة الأيونات من النوع نفسه. قد تكون هذه الطريقة مفيدة للتسلسل اليدوي للببتيدات من الصفر، لكنها لا تُجدي نفعًا في ظروف الإنتاجية العالية. ^{[ 23 ]}

الطريقة الرابعة، والتي تُعتبر ناجحة، هي نظرية الرسم البياني. وقد أشار بارتلز لأول مرة إلى تطبيق نظرية الرسم البياني في تسلسل الببتيدات من الصفر. ^{[ 24 ]} تُحوّل قمم الطيف إلى رؤوس في رسم بياني يُسمى "رسم بياني للطيف". إذا كان لرأسين نفس فرق الكتلة لحمض أميني واحد أو أكثر، فسيتم تطبيق حافة موجهة. ومن أمثلة هذا النوع خوارزمية SeqMS، ^{[ 25 ]} وخوارزمية Lutefisk، ^{[ 26 ]} وخوارزمية Sherenga. ^{[ 27 ]}

في الآونة الأخيرة، طُبقت تقنيات التعلم العميق لحل مشكلة تسلسل الببتيدات من الصفر. كان أول إنجازٍ بارزٍ هو DeepNovo، الذي اعتمد بنية الشبكة العصبية الالتفافية ، وحقق تحسيناتٍ كبيرةً في دقة التسلسل، ومكّن من تجميع تسلسل البروتين بالكامل دون الحاجة إلى قواعد بيانات مساعدة ^{[ 28 ].} لاحقًا، تم اعتماد هياكل شبكية إضافية، مثل PointNet (PointNovo ^{[ 29 ]} )، لاستخراج الميزات من الطيف الخام. تُصاغ مشكلة تسلسل الببتيدات من الصفر حينها كمشكلة تنبؤ بالتسلسل. بالنظر إلى تسلسل ببتيد جزئي مُتنبأ به مسبقًا، تُولّد نماذج تسلسل الببتيدات من الصفر القائمة على الشبكات العصبية الحمض الأميني التالي الأكثر احتمالًا بشكلٍ متكرر حتى تتطابق كتلة الببتيد المُتنبأ به مع كتلة الببتيد الأولي. عند الاستدلال، يمكن اعتماد استراتيجيات بحث مثل البحث الشعاعي لاستكشاف مساحة بحث أكبر مع الحفاظ على انخفاض التكلفة الحسابية. بالمقارنة مع الطرق السابقة، أظهرت النماذج القائمة على الشبكات العصبية دقةً وحساسيةً أفضل بشكلٍ ملحوظ. ^{[ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]} علاوة على ذلك، مع تصميم نموذج دقيق، يمكن لخوارزميات تسلسل الببتيدات الجديدة القائمة على التعلم العميق أن تكون سريعة بما يكفي لتحقيق تسلسل الببتيدات الجديد في الوقت الفعلي. ^{[ 29 ]} يدمج برنامج PEAKS هذا التعلم الشبكي العصبي في خوارزميات التسلسل الجديدة الخاصة به.

كما وصفه أندريوتي وآخرون في عام 2012، ^{[ 31 ]} فإن برنامج Antilope هو مزيج من الاسترخاء اللاغرانجي وتعديل لخوارزمية أقصر المسارات k لـ Yen. وهو يعتمد على طريقة "الرسم البياني الطيفي" ويحتوي على دوال تسجيل مختلفة، ويمكن مقارنته من حيث وقت التشغيل والدقة مع " البرامج الحديثة والشائعة " PepNovo وNovoHMM.

قدم غروسمان وآخرون ^{[ 32 ]} برنامج AUDENS في عام 2005 كأداة تسلسل الببتيدات الآلية الجديدة التي تحتوي على وحدة معالجة مسبقة يمكنها التعرف على قمم الإشارة وقمم الضوضاء.

يستطيع برنامج Lutefisk تحديد التسلسل من الصفر انطلاقًا من أطياف الكتلة الناتجة عن التفكك الناجم عن التصادم (CID). في هذه الخوارزمية، تُحدد الأيونات المهمة أولًا، ثم تُحدد قائمة الأدلة الطرفية N وC. بناءً على قائمة التسلسل، يُولد البرنامج تسلسلات كاملة في الأطياف ويُقارنها بالطيف التجريبي. مع ذلك، قد تتضمن النتيجة عدة تسلسلات مرشحة ذات اختلافات طفيفة، مما يُصعّب إيجاد تسلسل الببتيد الصحيح. يُمكن استخدام برنامج آخر، CIDentify، وهو نسخة مُعدّلة من خوارزمية FASTA لبيل بيرسون، من قِبل أليكس تايلور، لتمييز هذه التسلسلات المرشحة المتشابهة غير المؤكدة.

قدّم مو وزملاؤه خوارزمية MSNovo في عام 2007، وأثبتوا أنها تتفوق على أدوات de novo الموجودة على مجموعات بيانات متعددة. ^{[ 33 ]} تستطيع هذه الخوارزمية تفسير تسلسل de novo لأجهزة قياس الطيف الكتلي LCQ وLTQ، وللأيونات أحادية الشحنة وثنائية الشحنة وثلاثية الشحنة. وبخلاف الخوارزميات الأخرى، فقد طبّقت دالة تسجيل جديدة، واستخدمت مصفوفة كتل بدلاً من رسم بياني للطيف.

اقترح فيشر وآخرون ^{[ 34 ]} طريقة NovoHMM للتسلسل من الصفر. يُطبَّق نموذج ماركوف المخفي (HMM) كطريقة جديدة لحل مشكلة التسلسل من الصفر ضمن إطار بايزي. بدلاً من تقييم الرموز الفردية للتسلسل، تأخذ هذه الطريقة في الاعتبار الاحتمالات اللاحقة للأحماض الأمينية. في هذه الورقة، أُثبت أن هذه الطريقة تتفوق في الأداء على طرق التسلسل الشائعة الأخرى للببتيدات من الصفر، مثل PepNovo، وذلك من خلال العديد من الأمثلة الطيفية.

يُعدّ برنامج PEAKS حزمة برمجية متكاملة لتفسير أطياف الكتلة للببتيدات. يحتوي البرنامج على وظائف التسلسل من الصفر، والبحث في قواعد البيانات، وتحديد التعديلات ما بعد الترجمة، والبحث عن التشابه، والقياس الكمي في تحليل البيانات. وقد وصف ما وزملاؤه نموذجًا وخوارزمية جديدين للتسلسل من الصفر في برنامج PEAKS، وقارنوا أداءه مع برنامج Lutefisk لعدة ببتيدات ناتجة عن هضم التربسين لبروتينات قياسية، باستخدام مطياف الكتلة رباعي الأقطاب ذي زمن الطيران (Q-TOF). ^{[ 35 ]}

PepNovo أداةٌ عالية الإنتاجية لتسلسل الببتيدات من الصفر، وتستخدم شبكة احتمالية كطريقة للتقييم. عادةً ما يستغرق تفسير طيف واحد أقل من 0.2 ثانية. وكما وصفها فرانك وآخرون، فإن PepNovo تتفوق على العديد من الخوارزميات الشائعة مثل Sherenga وPEAKS وLutefisk. ^{[ 36 ]} يتوفر الآن إصدار جديد PepNovo+.

قدم تشي وآخرون برنامج pNovo+ في عام 2013 كأداة جديدة لتسلسل الببتيدات من الصفر باستخدام أطياف الكتلة الترادفية HCD وETD التكميلية. ^{[ 37 ]} في هذه الطريقة، تعمل خوارزمية مكونة، pDAG، على تسريع وقت الحصول على تسلسل الببتيدات بشكل كبير إلى 0.018 ثانية في المتوسط، وهو أسرع بثلاث مرات من برامج التسلسل الأخرى الشائعة من الصفر.

كما وصف جيونغ وآخرون ، بالمقارنة مع أدوات تسلسل الببتيدات الجديدة الأخرى، التي تعمل بكفاءة على أنواع معينة فقط من الأطياف، يُعدّ UniNovo أداةً أكثر شموليةً ذات أداءٍ جيد على أنواعٍ مختلفة من الأطياف أو أزواج الأطياف مثل CID وETD وHCD وCID/ETD، وغيرها. ويتميز بدقةٍ أعلى من PepNovo+ أو PEAKS. علاوةً على ذلك، يُولّد UniNovo معدل الخطأ لتسلسلات الببتيدات المُبلغ عنها. ^{[ 38 ]}

نشر ما برنامج نوفور عام 2015 كمحرك تسلسل ببتيدات جديد في الوقت الفعلي. ويهدف البرنامج إلى تحسين سرعة التسلسل الجديد بمقدار عشرة أضعاف مع الحفاظ على دقة مماثلة لأدوات التسلسل الجديد الأخرى المتوفرة في السوق. وقد حقق نوفور على جهاز ماك بوك برو أكثر من 300 طيف MS/MS في الثانية. ^{[ 39 ]}

قارن بيفتسوف وزملاؤه أداء خوارزميات التسلسل الجديدة الخمس المذكورة أعلاه: AUDENS، وLutefisk، وNovoHMM، وPepNovo، وPEAKS. استُخدمت بيانات مطياف الكتلة QSTAR وLCQ في التحليل، وقُيّمت باستخدام قيمة المسافة التسلسلية النسبية (RSD)، وهي نسبة التشابه بين تسلسل الببتيد الجديد وتسلسل الببتيد الحقيقي، محسوبة باستخدام طريقة البرمجة الديناميكية . أظهرت النتائج أن جميع الخوارزميات حققت أداءً أفضل على بيانات QSTAR مقارنةً ببيانات LCQ، حيث حققت PEAKS، باعتبارها الأفضل، معدل نجاح بلغ 49.7% على بيانات QSTAR، بينما حققت NovoHMM، باعتبارها الأفضل، معدل نجاح بلغ 18.3% على بيانات LCQ. وكان ترتيب الأداء على بيانات QSTAR كالتالي: PEAKS > Lutefisk، PepNovo > AUDENS، NovoHMM، بينما كان على بيانات LCQ كالتالي: NovoHMM > PepNovo، PEAKS > Lutefisk > AUDENS. بالمقارنة ضمن نطاق جودة الطيف، أظهرت خوارزميتا PEAKS وNovoHMM أفضل أداء في كلتا مجموعتي البيانات من بين الخوارزميات الخمس. كما تميزت هاتان الخوارزميتان بأعلى حساسية في بيانات QSTAR وLCQ. مع ذلك، لم تتجاوز أي من الخوارزميات المُقَيَّمة نسبة 50% من التحديد الدقيق لكلا مجموعتي البيانات. ^{[ 40 ]}

أتاح التقدم الأخير في أجهزة قياس الطيف الكتلي إمكانية توليد أطياف كتلية ذات دقة فائقة.أدى تحسن الدقة، إلى جانب زيادة كمية بيانات قياس الطيف الكتلي المُولَّدة، إلى زيادة الاهتمام بتطبيق تقنيات التعلم العميق على تسلسل الببتيدات من الصفر. في عام 2017، اقترح تران وزملاؤه برنامج DeepNovo، وهو أول برنامج لتسلسل الببتيدات من الصفر يعتمد على التعلم العميق. أظهر تحليل المقارنة المعيارية في المنشور الأصلي تفوق DeepNovo بشكل ملحوظ على الطرق السابقة، بما في ذلك PEAKS وNovor وPepNovo. تم ​​تنفيذ DeepNovo بلغة بايثون باستخدام إطار عمل Tensorflow . ^{[ 41 ]} لتمثيل طيف الكتلة كمدخل ثابت الأبعاد للشبكة العصبية، قام DeepNovo بتقسيم كل طيف إلى متجه طوله 150,000. هذا التمثيل الطيفي الكبير غير الضروري، واستخدام وحدة المعالجة المركزية أحادية الخيط في التنفيذ الأصلي، يمنع DeepNovo من إجراء تسلسل الببتيدات في الوقت الفعلي. ولزيادة تحسين كفاءة نماذج تسلسل الببتيدات من الصفر، قام كياو وزملاؤه... تم اقتراح PointNovo في عام 2020. PointNovo هو برنامج مكتوب بلغة بايثون ومُنفذ باستخدام إطار عمل PyTorch ^{[ 42 ]} ، ويتخلص من تمثيل الطيف المتجهي الذي يستهلك مساحة كبيرة والذي اعتمده DeepNovo. بالمقارنة مع DeepNovo، تمكن PointNovo من تحقيق دقة وكفاءة أفضل في آن واحد من خلال تمثيل الطيف مباشرةً كمجموعة من أزواج m/z والشدة.