ترسيب الإيثانول

يُفصل الحمض النووي عادةً عن مكونات الخلية الأخرى في محلول ثنائي الطور من الفينول والماء. ونظرًا لهيكله الفوسفاتي عالي الشحنة ، يكون الحمض النووي قطبيًا ويتركز في الطور المائي، بينما تتركز الدهون والبروتينات في طور الفينول.

لترسيب الحمض النووي من الماء، تُعادل شحنة مجموعات الفوسفات السالبة في هيكل الحمض النووي بإضافة أيونات موجبة الشحنة من الملح. ولكن نظرًا لقطبية الماء العالية، والتي تتجلى في ثابت العزل الكهربائي العالي الذي يبلغ 80.1 (عند 20  درجة مئوية)، فإن الأيونات الموجبة الشحنة تكون محجوبة وغير قادرة على التفاعل مع مجموعات الفوسفات السالبة الشحنة في الحمض النووي ومعادلتها. ^{[ 1 ]}

تنعكس هذه العلاقة في قانون كولوم ، الذي يمكن استخدامه لحساب القوة المؤثرة على شحنتين${\displaystyle q_{1}}$و${\displaystyle q_{2}}$يفصل بينهما مسافة${\displaystyle r}$باستخدام ثابت العزل الكهربائي${\displaystyle \varepsilon _{r}}$(وتسمى أيضًا السماحية الساكنة النسبية) للوسط في مقام المعادلة (${\displaystyle \varepsilon _{0}}$ثابت كهربائي ):

${\displaystyle F={\frac {1}{4\pi \varepsilon _{r}\varepsilon _{0}}}{\frac {q_{1}q_{2}}{r^{2}}}}$

على المستوى الذري، ينتج انخفاض القوة المؤثرة على الشحنة عن تكوين جزيئات الماء غلافًا مائيًا حولها. هذه الحقيقة تجعل الماء مذيبًا ممتازًا للمركبات المشحونة كالأملاح.

الإيثانول أقل قطبية بكثير من الماء، حيث تبلغ ثابت عزله الكهربائي 24.3 (عند 25  درجة مئوية). هذا يعني أن إضافة الإيثانول إلى المحلول تُعطّل حجب الشحنات بواسطة الماء. عند إضافة كمية كافية من الإيثانول، يصبح التجاذب الكهربائي بين مجموعات الفوسفات وأي أيونات موجبة موجودة في المحلول قويًا بما يكفي لتكوين روابط أيونية مستقرة ، مما يؤدي إلى ترسب الحمض النووي DNA من المحلول. يحدث هذا عادةً عندما يشكل الإيثانول أكثر من 64% من المحلول. وكما تشير الآلية، يجب أن يحتوي المحلول على أيونات موجبة لحدوث الترسيب؛ وعادةً ما تلعب أيونات الصوديوم (Na ⁺⁾ أو الأمونيوم (NH4 ₊ ⁾ أو الليثيوم (Li ⁺⁾ هذا الدور. ^{[ 2 ]}

يتم ترسيب الحمض النووي (DNA) أولاً بالتأكد من وجود التركيز الصحيح للأيونات الموجبة في المحلول (زيادة التركيز تؤدي إلى ترسب كمية كبيرة من الملح مع الحمض النووي، ونقص التركيز يؤدي إلى استخلاص غير كامل للحمض النووي)، ثم إضافة حجمين إلى ثلاثة أحجام من الإيثانول بتركيز 95% على الأقل. تنصح العديد من البروتوكولات بتخزين الحمض النووي في درجة حرارة منخفضة في هذه المرحلة، ولكن هناك ملاحظات تشير إلى أن ذلك قد لا يحسن استخلاص الحمض النووي، بل قد يقلل من كفاءة الترسيب عند استخدام فترة حضانة ليلية. ^{[ 3 ] [ 4 ]} لذلك، يمكن تحقيق كفاءة جيدة في درجة حرارة الغرفة، ولكن عند أخذ احتمالية التحلل في الاعتبار، يُفضل على الأرجح حضانة الحمض النووي على جليد رطب. يعتمد وقت الحضانة الأمثل على طول الحمض النووي وتركيزه. تتطلب القطع الأصغر والتركيزات المنخفضة أوقاتًا أطول لتحقيق استخلاص مقبول. بالنسبة للأطوال الصغيرة جدًا والتركيزات المنخفضة، يُنصح بالحضانة الليلية.

أثناء الحضانة، يترسب الحمض النووي وبعض الأملاح من المحلول. في الخطوة التالية، يُجمع هذا الراسب بالطرد المركزي في أنبوب طرد مركزي دقيق بسرعة عالية (حوالي 12000 دورة في الدقيقة ). يؤثر كل من وقت وسرعة الطرد المركزي بشكل كبير على معدلات استخلاص الحمض النووي. وكما ذكرنا سابقًا، تتطلب الشظايا الأصغر حجمًا والتخفيفات الأعلى طردًا مركزيًا أطول وأسرع. يمكن إجراء الطرد المركزي إما في درجة حرارة الغرفة أو عند 4  درجات مئوية أو 0  درجة مئوية. أثناء الطرد المركزي، يجب أن يتحرك الحمض النووي المترسب عبر محلول الإيثانول إلى قاع الأنبوب. تؤدي درجات الحرارة المنخفضة إلى زيادة لزوجة المحلول، بينما تؤدي الأحجام الأكبر إلى زيادة المسافة، لذا فإن هذين العاملين يقللان من كفاءة هذه العملية، مما يتطلب طردًا مركزيًا أطول للحصول على نفس النتيجة. ^{[ 3 ] [ 4 ]} بعد الطرد المركزي، يُزال المحلول الطافي، تاركًا راسبًا من الحمض النووي الخام. يعتمد وضوح الراسب على كمية الحمض النووي ونقائه (فالرواسب الأقل نقاءً أسهل في الرؤية)، أو على استخدام عوامل مساعدة في الترسيب. ويمكن أن يُحسّن استخدام مواد حاملة مثل الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) أو الجليكوجين أو البولي أكريلاميد الخطي عملية الاستخلاص بشكل كبير، إذ تُسهّل رؤية راسب الحمض النووي بصريًا.

في الخطوة التالية، يُضاف الإيثانول بتركيز 70% إلى الراسب، ويُخلط برفق لتفكيكه وغسله. يُزيل هذا بعض الأملاح الموجودة في السائل الطافي المتبقي والمرتبطة براسب الحمض النووي، مما يجعل الحمض النووي النهائي أنقى. يُعاد تدوير هذا المعلق لفصل الحمض النووي مرة أخرى، ثم يُزال السائل الطافي. تُكرر هذه الخطوة مرة أخرى.

أخيرًا، تُجفف العينة بالهواء، ثم يُعاد تعليق الحمض النووي في الماء أو أي محلول منظم آخر مرغوب فيه . من المهم عدم تجفيف العينة أكثر من اللازم، لأن ذلك قد يؤدي إلى تمسخ الحمض النووي ويجعل إعادة تعليقه أكثر صعوبة.

يمكن استخدام الإيزوبروبانول بدلاً من الإيثانول؛ إذ يتميز الإيزوبروبانول بكفاءة ترسيب أعلى، مما يجعل حجماً واحداً منه كافياً للترسيب. مع ذلك، فإن الإيزوبروبانول أقل تطايراً من الإيثانول، ويحتاج إلى وقت أطول ليجف في الهواء في المرحلة النهائية. كما قد لا تلتصق الحبيبات بالأنبوب بإحكام عند استخدام الإيزوبروبانول. ^{[ 2 ]}