لطخة شمال غربية

📅 آخر تحديث: ٢٩ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٩ يوليو ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

تُعدّ تقنية التلطيخ الشمالي الغربي ، والمعروفة أيضًا باسم اختبار التلطيخ الشمالي الغربي ، تقنية تحليلية هجينة تجمع بين تقنيتي التلطيخ الغربي والتلطيخ الشمالي ، وتُستخدم في البيولوجيا الجزيئية للكشف عن التفاعلات بين الحمض النووي الريبوزي (RNA) والبروتينات . وتُستخدم تقنية التلطيخ الغربي، وهي تقنية مشابهة، للكشف عن بروتين مُحدد، وذلك بنقل البروتينات المفصولة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي إلى غشاء نيتروسليلوز. يتجمع راسب ملون على طول الشريط الموجود على الغشاء الذي يحتوي على البروتين المستهدف. أما التلطيخ الشمالي، فهو تقنية تحليلية مماثلة، ولكنها تُستخدم لدراسة التعبير الجيني عن طريق الكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA) (أو الحمض النووي الريبوزي الرسول المعزول) على غشاء مماثل، بدلاً من الكشف عن بروتين مُحدد. يجمع التلطيخ الشمالي الغربي بين التقنيتين، ويتضمن تحديد الحمض النووي الريبوزي المُوسوم الذي يتفاعل مع البروتينات المُثبتة على غشاء نيتروسليلوز مماثل.

تاريخ

ابتكر إدوين ساذرن تقنية ساوثرن بلوت ، [ 1 ] وهي تقنية تحليلية تُستخدم للكشف عن الحمض النووي. تعتمد هذه التقنية على استخدام الرحلان الكهربائي الهلامي ، وهو أسلوب تحليلي مهم يستخدم مجالًا كهربائيًا، ومن ثمّ هجرة جزيئات الحمض النووي المشحونة (DNA أو RNA أو البروتينات) عبر هذا المجال بناءً على حجمها وشحنتها. [ 2 ] في تقنية ساوثرن بلوت، تُنقل شظايا الحمض النووي المفصولة إلى غشاء ترشيح للكشف عنها. [ 1 ] يتم الكشف عن الجزيئات عندما تظهر حزم على الغشاء وترتبط بجزيء معين. [ 2 ] لاحقًا، طُوّرت تقنيات أخرى مماثلة للكشف عن جزيئات مختلفة أو التفاعلات بينها. تشمل هذه التقنيات: ويسترن بلوت (للكشف عن البروتينات)، ونورثرن بلوت (للكشف عن RNA)، وساوث ويسترن بلوت (للكشف عن تفاعلات الحمض النووي مع البروتينات)، وإيسترن بلوت (للكشف عن التعديلات ما بعد الترجمة)، ونورث ويسترن بلوت (للكشف عن تفاعلات RNA مع البروتينات). [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]

تفاصيل التقنية

تتضمن عملية التلطيخ الشمالي الغربي فصل البروتينات الرابطة للحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي ، حيث يتم فصل هذه البروتينات بناءً على حجمها وشحنتها. يمكن تحميل عينات فردية على هلام الأغاروز أو هلام البولي أكريلاميد (عادةً SDS-PAGE) لتحليل عينات متعددة في الوقت نفسه. [ 5 ] بعد اكتمال الرحلان الكهربائي الهلامي، يُنقل الهلام والبروتينات الرابطة للحمض النووي الريبي المرتبطة به إلى ورق نقل من النيتروسليلوز. [ 7 ]

تُغمر الأغشية المنقولة حديثًا في محلول حاجب؛ يُعد الحليب الخالي من الدسم وألبومين مصل البقر من المحاليل الحاجبة الشائعة. [ 8 ] يساعد هذا المحلول الحاجب على منع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية و/أو الثانوية بغشاء النيتروسليلوز. بعد أن يلامس المحلول الحاجب الغشاء لفترة كافية، يُضاف إليه حمض نووي ريبوزي منافس نوعي ويُترك ليُحضن في درجة حرارة الغرفة. خلال هذه الفترة، يرتبط الحمض النووي الريبوزي المنافس ببروتينات ربط الحمض النووي الريبوزي في العينات الموجودة على الغشاء. قد تختلف مدة التحضين في هذه العملية تبعًا لتركيز الحمض النووي الريبوزي المنافس المُضاف؛ إلا أن مدة التحضين عادةً ما تكون ساعة واحدة. [ 9 ] بعد اكتمال التحضين، يُغسل الغشاء عادةً ثلاث مرات على الأقل، كل غسلة لمدة خمس دقائق، لتخفيف تركيز الحمض النووي الريبوزي في المحلول. تشمل محاليل الغسل الشائعة محلول ملحي مُخفف بالفوسفات (PBS) أو محلول توين 20 بنسبة 10% . [ 10 ] يؤثر الغسل غير السليم أو غير الكافي على وضوح عملية تطوير البقعة. بعد اكتمال الغسل، تُطوّر البقعة عادةً باستخدام الأشعة السينية أو طرق التصوير الإشعاعي الذاتي المماثلة. [ 11 ]

التطبيقات

بعد تحميض اللطخة باستخدام الأشعة السينية أو التصوير الإشعاعي الذاتي، يمكن تحليل النتائج وتفسيرها لتحديد الحجم التقريبي وتركيز بروتين (بروتينات) ربط الحمض النووي الريبي (RNA) محل الاهتمام، وذلك لمزيد من الدراسة. يؤثر موقع وتركيز بروتين ربط الحمض النووي الريبي على اللطخة على النتائج، وقد تظهر حزم بروتينية أحيانًا بعد التحميض. تساعد هذه الحزم الباحثين على تحديد حجم وتركيز بروتين ربط الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. [ 12 ] عند معرفة الحجم التقريبي للبروتين، يمكن تشغيل العينة الأصلية على جهاز كروماتوغرافيا لفصلها حسب الحجم. [ 13 ] إضافةً إلى ذلك، بمجرد عزل البروتين، يمكن هضمه باستخدام التربسين، ويمكن استخدام مطياف الكتلة لتسلسل الببتيدات لتحديد هوية البروتين المحدد. [ 14 ]

المزايا والعيوب

تشمل مزايا تقنية التلطيخ الشمالي الغربي الكشف السريع عن بروتينات محددة ترتبط بالحمض النووي الريبي (RNA)، بالإضافة إلى تقدير الأوزان الجزيئية التقريبية لتلك البروتينات. [ 15 ] تتيح هذه التقنية الكشف عن البروتينات المُحددة بطريقة غير مكلفة. عادةً ما تُعدّ هذه التقنية خطوة أولى في البحث، إذ تُتيح تحديد الأوزان الجزيئية التقريبية، وبمجرد معرفة الوزن الجزيئي، يُمكن إجراء المزيد من الأبحاث أو التنقية باستخدام طرق أخرى مثل الاستشراب. ومن مزاياها الأخرى أنها تُساعد في بناء مكتبات التعبير عن الروابط المتوافقة. [ 16 ]

من أبرز عيوب هذه التقنية أن بعض تفاعلات الحمض النووي الريبوزي مع البروتينات ذات خصائص الارتباط الضعيفة بالحمض النووي الريبوزي قد لا تكون قابلة للكشف بسهولة. [ 15 ] كما أن عملية التلطيخ قد تستغرق من 3 إلى 5 ساعات. وإذا لم تُجرَ العملية بشكل صحيح، فقد ينتج عنها تشويش كبير، مما قد يؤدي إلى تلطيخ غير واضح للبروتينات المُحددة. إضافةً إلى ذلك، تحتاج البروتينات إلى إعادة طيها بعد فصلها ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز. ومن عيوبها الأخرى أن البروتينات يجب أن تتكون من عديد ببتيد واحد أو وحدتين فرعيتين تتحركان معًا في مصفوفة الهلام. [ 17 ]

انظر أيضاً

البروتوكولات

تحليل تفاعل البروتين مع الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام تقنية نورث وسترن بلوت من سنابل الأرز الصغيرة

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل النقل الشمالي

تحليل البروتين

مراجع

  1. 1 2 ساوثرن، إدوين ميلور (5 نوفمبر 1975). "الكشف عن تسلسلات محددة بين شظايا الحمض النووي المفصولة بالهجرة الكهربائية الهلامية". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 98 (3): 503-517 . doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 . ISSN 0022-2836 . PMID 1195397. S2CID 20126741 .   
  2. 1 2 نيلسون، كوكس (2013). مبادئ لينينجر في الكيمياء الحيوية . نيويورك، نيويورك: دبليو إتش فريمان وشركاه. ص 179. ISBN  978-1-4641-0962-1.
  3. ↑ ألبرتس، ب.، جونسون، أ.، لويس، ج.، راف، م.، روبرتس، ك.، والتر، ب. 2008. البيولوجيا الجزيئية للخلية، الطبعة الخامسة. جارلاند ساينس، مجموعة تايلور وفرانسيس، نيويورك، الصفحات 538-539.
  4. ↑ Kevil, CG, Walsh, L., Laroux, FS, Kalogeris, T., Grisham, MB, Alexander, JS (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277-279.
  5. 1 2 رابلي، ر. (2000). دليل بروتوكولات الأحماض النووية . توتوا، نيوجيرسي: دار هومانا للنشر. ص 783. ISBN  978-0-89603-459-4.
  6. ↑ نيكولاس؛ نيلسون (2013). "الشمال، الجنوب، أم الشرق؟ تقنيات التجفيف" . مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية . 133 (e10): e10. doi : 10.1038/jid.2013.216 . PMID 23760052 . 
  7. ↑ فيرينا، بيشيل؛ ألفريد والتز؛ ماتياس بيكل (1997). "تحديد البروتينات التي ترتبط تحديدًا بالمنطقة غير المترجمة 3' من الحمض النووي الريبوزي الرسول لعامل تحفيز مستعمرات الخلايا المحببة/البلعمية" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 25 (12): 2417-2423 . doi : 10.1093/nar/25.12.2417 . PMC 146745. PMID 9171094 .  
  8. ↑ لياو، هيوي-جين؛ ريوجي كوباياشي ومايكل ب. ماثيوز؛ ماثيوز، إم بي (21 يوليو 1998). "أنشطة الحمض النووي الريبي المرتبط بفيروسات الأدينو: تنقية وتوصيف البروتينات الرابطة للحمض النووي الريبي" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 95 (15): 8514-9 . Bibcode : 1998PNAS...95.8514L . doi : 10.1073 / pnas.95.15.8514 . PMC 21107. PMID 9671709 .  
  9. ↑ سي، فرانك؛ غراف دي؛ بارتش إتش؛ باخمان إم (2009). "استخدام طريقة الكشف غير المشعة للتلطيخ الغربي الشمالي والجنوبي". تلطيخ البروتين والكشف عنه . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 536. الصفحات 441-449 . doi : 10.1007/978-1-59745-542-8_44 . ISBN   978-1-934115-73-2PMID 19378081​​ 
  10. ↑ شوماخر، جيل؛ كيسوك لي؛ سوزان إيدلهوف؛ روبرت براون (مايو 1995). "Spnr، بروتين رابط للحمض النووي الريبي في الفئران ، يتمركز في الأنيبيبات الدقيقة السيتوبلازمية" . مجلة بيولوجيا الخلية . 129 (4): 1023-1032 . doi : 10.1083/jcb.129.4.1023 . PMC 2120489. PMID 7744952 .  
  11. ↑ ستولمان، إس. أ.؛ آر. إس. باريك؛ جي. إن. نيلسون؛ إل. إتش. سو؛ إل. إم. ويلتر؛ آر. جيه. دينز (1988). "تفاعل محدد بين الحمض النووي الريبي الرائد لفيروس كورونا وبروتين النيوكليوكابسيد" . مجلة علم الفيروسات . 11. 62 (11): 4288-95 . doi : 10.1128 / JVI.62.11.4288-4295.1988 . PMC 253863. PMID 2845141 .  
  12. ↑ ثانغاسامي، ساميناتان (5 أبريل 2013). "التلطيخ الشمالي الغربي لتفاعل البروتين مع الحمض النووي الريبي من سنابل الأرز الصغيرة" . بروتوكولات بيولوجية . 3 (7): e625. doi : 10.21769/BioProtoc.625 . تاريخ الاسترجاع: 26 مارس 2014 .
  13. ↑ بيرديو، غاري (17 أغسطس 2008). تنظيم التعبير الجيني: الآليات الجزيئية . سبرينغر. ص 129. ISBN  9781597452281.
  14. ↑ غاري هـ. بيرديو؛ جاك ب. فاندن هيوفيل؛ جيفري م. بيترز (2008). تنظيم التعبير الجيني: الآليات الجزيئية . سبرينغر. ص 129. ISBN  9781597452281.
  15. 1 2 سميث، كريستوفر دبليو جيه (1998). تفاعلات الحمض النووي الريبي مع البروتين : منهج عملي . مطبعة جامعة أكسفورد. ص 187. ISBN   9780191591624.
  16. ↑ والدو، كوهين (16 أغسطس 1991). التقدم في أبحاث الأحماض النووية والبيولوجيا الجزيئية . دار النشر الأكاديمية. ص 186. ISBN  9780080863290.
  17. ↑ نيكلسون، ألين و. (2001). الريبونوكليازات، الجزء أ: الأدوار الوظيفية وآليات العمل . دار النشر الأكاديمية. ص 409. ISBN  9780080496917.