لطخة ويسترن

📅 آخر تحديث: ٢٤ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٤ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 9 صور
الموسوعة الحرة
سير عمل لطخة ويسترن

يُعدّ التحليل المناعي الغربي (ويُسمى أحيانًا التحليل المناعي للبروتين )، أو التحليل المناعي الغربي ، تقنية تحليلية شائعة الاستخدام في البيولوجيا الجزيئية وعلم المناعة الوراثية للكشف عن بروتينات محددة في عينة من متجانس الأنسجة أو المستخلص، [ 1 ] ولتصوير وتمييز وتحديد كمية البروتينات المختلفة في تركيبة بروتينية معقدة. [ 2 ]

تعتمد تقنية التلطيخ الغربي على ثلاثة عناصر لفصل بروتين معين من مُركّب بروتيني: الفصل حسب الحجم، ونقل البروتين إلى دعامة صلبة، ووسم البروتين المستهدف باستخدام جسم مضاد أولي وثانوي لتصويره. [ 1 ] يُصنع جسم مضاد اصطناعي أو حيواني ( يُعرف بالجسم المضاد الأولي ) يتعرف على البروتين المستهدف ويرتبط به. تُغسل غشاء الرحلان الكهربائي بمحلول يحتوي على الجسم المضاد الأولي، ثم يُزال الجسم المضاد الزائد. [ 3 ] يُضاف جسم مضاد ثانوي يتعرف على الجسم المضاد الأولي ويرتبط به. يُصوَّر الجسم المضاد الثانوي باستخدام طرق مختلفة مثل التلوين ، والتألق المناعي ، والنشاط الإشعاعي، مما يسمح بالكشف غير المباشر عن البروتين المستهدف. [ 3 ]

وتشمل التقنيات الأخرى ذات الصلة تحليل البقعة النقطية ، والبقعة النقطية الكمية ، والكيمياء المناعية النسيجية والكيمياء المناعية الخلوية ، حيث يتم استخدام الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات في الأنسجة والخلايا عن طريق التلوين المناعي ، واختبار الإليزا المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

اسم "Western blot" هو تورية على " Southern blot" ، وهي تقنية للكشف عن الحمض النووي (DNA) سُميت نسبةً إلى مخترعها، عالم الأحياء الإنجليزي إدوين ساذرن . وبالمثل، يُطلق على الكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA) اسم " Northern blot" . [ 4 ] وقد أطلق دبليو. نيل بورنيت مصطلح " Western blot" عام 1981، [ 5 ] على الرغم من أن الطريقة، وليس الاسم، طُوّرت بشكل مستقل عام 1979 من قِبل خايمي رينارت، وجاكوب رايزر، وجورج ستارك ، [ 6 ] وهاري تاوبين، وثيوفيل ستيهلين، وجوليان جوردون في معهد فريدريش ميشر في بازل ، سويسرا . [ 7 ] كما استخدمت مجموعة تاوبين الأجسام المضادة الثانوية للكشف، مما يُشابه الطريقة الفعلية المُستخدمة عالميًا تقريبًا اليوم. بين عامي 1979 و2019، "ذُكرت في عناوين وملخصات وكلمات مفتاحية لأكثر من 400,000 منشور مُدرج في PubMed "، وربما لا تزال أكثر تقنيات تحليل البروتينات استخدامًا. [ 8 ]

التطبيقات

اختبار ويسترن بلوت لفيروس نقص المناعة البشرية ، حيث يمثل الشريطين الأولين عنصرين تحكم سلبي وإيجابي، يليهما الاختبارات الفعلية.

يُستخدم تحليل ويسترن بلوت على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية للكشف النوعي عن البروتينات المفردة وتعديلاتها (مثل التعديلات ما بعد الترجمة ). وتشير التقديرات إلى أن ما لا يقل عن 8-9% من جميع المنشورات المتعلقة بالبروتينات تستخدم تحليل ويسترن بلوت. [ 8 ] يُستخدم هذا التحليل كطريقة عامة لتحديد وجود بروتين معين ضمن خليط معقد من البروتينات. ويمكن الحصول على تقدير شبه كمي للبروتين من خلال حجم وشدة لون حزمة البروتين على غشاء التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام سلسلة تخفيف لبروتين نقي بتراكيز معروفة للحصول على تقدير أكثر دقة لتركيز البروتين. ويُستخدم تحليل ويسترن بلوت بشكل روتيني للتحقق من إنتاج البروتين بعد الاستنساخ الجزيئي .

تُستخدم تقنية ويسترن بلوت أيضًا في التشخيص الطبي، على سبيل المثال، في اختبار فيروس نقص المناعة البشرية [ 9 ] واختبار جنون البقر . كان اختبار تأكيد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية يعتمد سابقًا على تقنية ويسترن بلوت للكشف عن الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في عينة مصل بشري . تُفصل البروتينات من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وتُنقل إلى غشاء كما ذُكر سابقًا. بعد ذلك، يُضاف المصل المراد اختباره في خطوة حضانة الأجسام المضادة الأولية؛ حيث تُغسل الأجسام المضادة الحرة، ثم يُضاف جسم مضاد ثانوي مضاد للبشر مرتبط بإشارة إنزيمية. تُشير الحزم المصبوغة بعد ذلك إلى البروتينات التي يحتوي مصل المريض على أجسام مضادة لها. [ 10 ] كما تُستخدم تقنية ويسترن بلوت كاختبار نهائي لمرض كروتزفيلد-جاكوب المتغير ، وهو نوع من أمراض البريون المرتبطة بتناول لحوم الأبقار الملوثة المصابة باعتلال الدماغ الإسفنجي البقري (جنون البقر). [ 11 ] ومن تطبيقاتها الأخرى تشخيص التولاريميا . أظهر تقييم قدرة اختبار ويسترن بلوت على الكشف عن الأجسام المضادة لبكتيريا فرانسيسلا تولارينسيس حساسية تقارب 100% وخصوصية تصل إلى 99.6%. [ 12 ] تستخدم بعض طرق تشخيص داء لايم اختبار ويسترن بلوت. [ 13 ] كما يُستخدم اختبار ويسترن بلوت كاختبار تأكيدي لعدوى التهاب الكبد ب [ 14 ] وعدوى فيروس الهربس البسيط من النوع الثاني (HSV-2). [ 15 ] وفي الطب البيطري، يُستخدم اختبار ويسترن بلوت أحيانًا لتأكيد الإصابة بفيروس نقص المناعة لدى القطط (FIV ). [ 16 ]

تشمل التطبيقات الأخرى لتقنية ويسترن بلوت استخدامها من قبل الوكالة العالمية لمكافحة المنشطات (WADA). يُعرف تنشيط الدم بأنه إساءة استخدام تقنيات و/أو مواد معينة لزيادة كتلة خلايا الدم الحمراء، مما يسمح للجسم بنقل المزيد من الأكسجين إلى العضلات، وبالتالي زيادة القدرة على التحمل والأداء. هناك ثلاث مواد أو طرق معروفة على نطاق واسع تُستخدم لتنشيط الدم، وهي: الإريثروبويتين (EPO)، وناقلات الأكسجين الاصطناعية ، وعمليات نقل الدم. كل منها محظور بموجب قائمة المواد والطرق المحظورة لدى الوكالة العالمية لمكافحة المنشطات. استُخدمت تقنية ويسترن بلوت خلال بطولة كأس العالم لكرة القدم 2014 في حملة مكافحة المنشطات لتلك البطولة. [ 17 ] في المجمل، جُمع أكثر من 1000 عينة وحُللت بواسطة رايشل وآخرون [ 18 ] في مختبر لوزان ، سويسرا ، المعتمد من الوكالة العالمية لمكافحة المنشطات. أظهرت الأبحاث الحديثة التي تستخدم تقنية ويسترن بلوت تحسنًا في الكشف عن الإريثروبويتين في الدم والبول باستخدام هلامات Velum SAR الأفقية مسبقة الصب والمُحسّنة للتحليل الروتيني. [ 19 ] مع اعتماد SAR-PAGE الأفقي بالاشتراك مع هلامات Velum SAR المدعومة بفيلم مسبق الصب، تم تعزيز القدرة التمييزية لتطبيق الجرعات الصغيرة من rEPO بشكل كبير.

تحديد موقع البروتين عبر الخلايا

في تطوير الأدوية، وتحديد الأهداف العلاجية، والبحوث البيولوجية، من الضروري فهم مواقع البروتينات داخل الخلية. [ 2 ] [ 20 ] ترتبط مواقع البروتينات داخل الخلية ووظائفها ارتباطًا وثيقًا. تشير العلاقة بين وظيفة البروتين وموقعه إلى أنه عند انتقال البروتينات، قد تتغير وظائفها أو تكتسب خصائص جديدة. يمكن تحديد موقع البروتين داخل الخلية باستخدام طرق متنوعة. وقد طُوّرت واستُخدمت العديد من الأدوات والاستراتيجيات الحاسوبية الفعّالة والموثوقة لتحديد موقع البروتين داخل الخلية. [ 21 ] وبمساعدة طرق تجزئة المكونات الخلوية، لا يزال التلطيخ الغربي (WB) طريقة أساسية مهمة لدراسة وفهم موقع البروتين. [ 2 ]

تحديد مواقع الإبيتوب

نظراً لتعدد مواقع ارتباط الأجسام المضادة (الإبيتوبات )، فقد حظيت باهتمام متزايد في البحوث الأساسية والسريرية. ويُعدّ تحديد مواقع ارتباط الأجسام المضادة (الإبيتوبات) على البروتين المستهدف أساساً لتوصيفها والتحقق من صحتها. وتُعرف عملية تحديد مواقع ارتباط الجسم المضاد (الإبيتوبات) على البروتين المستهدف باسم "تحديد مواقع الارتباط". ويُعدّ العثور على موقع ارتباط الجسم المضاد أمراً بالغ الأهمية لاكتشاف وتطوير لقاحات وتشخيصات وعلاجات جديدة. [ 2 ] ونتيجةً لذلك، تم ابتكار طرق متنوعة لتحديد مواقع ارتباط الأجسام المضادة. وفي هذا السياق، تُعدّ خصوصية تقنية التلطيخ الغربي (Western blotting) السمة الرئيسية التي تميزها عن تقنيات تحديد مواقع الارتباط الأخرى. وهناك العديد من تطبيقات التلطيخ الغربي لتحديد مواقع الارتباط على عينات من جلد الإنسان، وفيروسات الأمراض النزفية. [ 2 ] [ 22 ] [ 23 ]

إجراء

من الهلام إلى النشر

تتكون طريقة Western blot من الفصل الكهربائي الهلامي لفصل البروتينات الأصلية حسب البنية ثلاثية الأبعاد أو البروتينات المتغيرة حسب طول عديد الببتيد، متبوعًا بنقل كهربائي إلى غشاء (غالبًا PVDF أو نيتروسليلوز ) وإجراء التلوين المناعي لتصوير بروتين معين على غشاء اللطخة.

يُستخدم الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد مع كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE) عادةً لفصل البروتينات كهربائيًا في ظروف مُفسِخة. تُستخدم كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) عادةً كمحلول منظم (وكذلك في الهلام) لإعطاء جميع البروتينات الموجودة شحنة سالبة موحدة، نظرًا لأن البروتينات قد تكون موجبة أو سالبة أو متعادلة الشحنة. قبل الفصل الكهربائي، تُغلى عينات البروتين غالبًا لتفكيك البروتينات الموجودة. يضمن ذلك فصل البروتينات بناءً على حجمها ويمنع البروتيازات (الإنزيمات التي تُحلل البروتينات) من تحليل العينات. بعد الفصل الكهربائي، تُنقل البروتينات إلى غشاء (عادةً من النيتروسليلوز أو PVDF). يُصبغ الغشاء غالبًا بصبغة بونسو إس لتصوير البروتينات على اللطخة والتأكد من اكتمال النقل. بعد ذلك، تُحجب البروتينات بالحليب (أو عوامل حجب أخرى) لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير النوعية، ثم تُصبغ بأجسام مضادة نوعية للبروتين المستهدف. [ 7 ] [ 6 ] أخيرًا، تُصبغ الأغشية بأجسام مضادة ثانوية تتعرف على صبغة الأجسام المضادة الأولية، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك للكشف باستخدام طرق متنوعة. تُدمج خطوة الفصل الكهربائي الهلامي في تحليل ويسترن بلوت لحل مشكلة التفاعل المتبادل للأجسام المضادة.

تحضير العينة

تُعدّ عملية تحضير العينة خطوةً أساسيةً في إجراء تحليل ويسترن بلوت، إذ يتأثر تفسير نتائج هذا التحليل بتحضير البروتين، الذي يشمل عمليات استخلاص البروتين وتنقيته. [ 24 ] [ 3 ] ولتحقيق استخلاص بروتين فعّال، يجب اختيار طريقة تجانس مناسبة، لأنها مسؤولة عن تمزيق غشاء الخلية وإطلاق المكونات الخلوية. [ 3 ] [ 25 ] إضافةً إلى ذلك، يُعدّ استخدام محلول التحلل المثالي ضروريًا للحصول على كميات كبيرة من البروتين المستهدف، حيث يُسهم هذا المحلول في إذابة البروتين ومنع تحلّله. بعد إتمام تحضير العينة، يصبح البروتين جاهزًا للفصل باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي. [ 3 ]

الرحلان الكهربائي الهلامي

الفصل الكهربائي SDS-PAGE

تُفصل بروتينات العينة باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي . ويمكن فصل البروتينات بناءً على نقطة التساوي الكهربائي (pI)، أو الوزن الجزيئي ، أو الشحنة الكهربائية، أو مزيج من هذه العوامل. وتعتمد طبيعة الفصل على معالجة العينة ونوع الهلام.

يُعدّ الفصل الكهربائي الهلامي باستخدام هلامات البولي أكريلاميد ومحاليل منظمة محملة بكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) النوع الأكثر شيوعًا. يحافظ الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE (الفصل الكهربائي الهلامي باستخدام بولي أكريلاميد SDS) على عديدات الببتيد في حالة غير طبيعية بعد معالجتها بعوامل اختزال قوية لإزالة بنيتها الثانوية والثالثية (مثل روابط ثنائي الكبريتيد [SS] مع مجموعات السلفهيدريل [SH وSH])، مما يسمح بفصل البروتينات حسب كتلتها الجزيئية . تُغطى البروتينات المأخوذة من العينة بـ SDS سالب الشحنة، فتصبح أيونية سالبة ، وتهاجر نحو المصعد موجب الشحنة (ذي الجهد الأعلى) (عادةً ما يكون سلكه أحمر) عبر شبكة الأكريلاميد في الهلام. تهاجر البروتينات الأصغر حجمًا بسرعة أكبر عبر هذه الشبكة، وبالتالي يتم فصل البروتينات وفقًا لحجمها (يُقاس عادةً بالكيلودالتون، kDa ). يُحدد تركيز الأكريلاميد دقة الفصل في الهلام؛ فكلما زاد تركيز الأكريلاميد، تحسّن فصل البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، وكلما انخفض تركيز الأكريلاميد، تحسّن فصل البروتينات ذات الوزن الجزيئي المرتفع. تتحرك البروتينات في بُعد واحد فقط على طول الهلام في معظم عمليات الفصل.

تُوضع العينات في حُفر الهلام. يُخصص عادةً مسار واحد لعلامة أو مُرَشِّح ، وهو عبارة عن مزيج متوفر تجاريًا من البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المعروفة، ويُصبغ عادةً لتكوين نطاقات ملونة مرئية. عند تطبيق جهد كهربائي على طول الهلام، تهاجر البروتينات عبره بسرعات مختلفة تبعًا لحجمها. هذه السرعات المختلفة للتقدم ( الحركية الكهربائية المختلفة ) تُفصل إلى نطاقات داخل كل مسار . يمكن بعد ذلك مقارنة نطاقات البروتين بنطاقات المُرَشِّح، مما يسمح بتقدير الوزن الجزيئي للبروتين.

من الممكن أيضاً استخدام هلام ثنائي الأبعاد ينشر البروتينات من عينة واحدة في بعدين. تُفصل البروتينات وفقاً لنقطة التعادل الكهربائي ( الرقم الهيدروجيني الذي تكون عنده شحنتها الصافية متعادلة) في البعد الأول، ووفقاً لوزنها الجزيئي في البعد الثاني.

تحويل

نقل لطخة ويسترن

لجعل البروتينات متاحة للكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة، تُنقل من داخل الهلام إلى غشاء، وهو دعامة صلبة تُعدّ جزءًا أساسيًا من العملية. يوجد نوعان من الأغشية: النيتروسليلوز (NC) أو بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد (PVDF ). يتميز غشاء النيتروسليلوز بألفة عالية للبروتين وقدرته على الاحتفاظ به. مع ذلك، فإن غشاء النيتروسليلوز هشّ، ولا يسمح بإعادة استخدام الغشاء في التحليل، بينما يسمح غشاء بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد بإعادة التحليل. [ 1 ] تُعرف الطريقة الأكثر شيوعًا لنقل البروتينات باسم النقل الكهربائي . يستخدم النقل الكهربائي تيارًا كهربائيًا لسحب البروتينات سالبة الشحنة من الهلام نحو المصعد موجب الشحنة، وإلى غشاء بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد أو النيتروسليلوز. تنتقل البروتينات من داخل الهلام إلى الغشاء مع الحفاظ على تنظيمها داخل الهلام. تتضمن طريقة نقل أقدم وضع غشاء فوق الهلام، ثم مجموعة من أوراق الترشيح فوقه. تُوضع المجموعة بأكملها في محلول منظم ينتقل عبر الورقة بفعل الخاصية الشعرية ، حاملاً معه البروتينات. عملياً، لا تُستخدم هذه الطريقة بشكل شائع نظراً لطول مدة الإجراء.

نتيجةً لأيٍّ من عمليتي النقل، تُعرَض البروتينات على طبقة رقيقة من الغشاء للكشف عنها. يُختار كلا نوعي الأغشية لخصائصهما في الارتباط غير النوعي بالبروتينات (أي ارتباطهما بجميع البروتينات بكفاءة متساوية). يعتمد ارتباط البروتين على التفاعلات الكارهة للماء، بالإضافة إلى التفاعلات المشحونة بين الغشاء والبروتين. أغشية النيتروسليلوز أرخص من أغشية PVDF، لكنها أكثر هشاشةً بكثير ولا تتحمل عمليات الفحص المتكررة.

تلوين البروتين الكلي

ارتباط ويسترن بلوت

يُتيح تلوين البروتين الكلي رؤية البروتين الكلي الذي نُقل بنجاح إلى الغشاء، مما يسمح للمستخدم بالتحقق من تجانس نقل البروتين وإجراء معايرة لاحقة للبروتين المستهدف مع كمية البروتين الفعلية لكل مسار. كانت المعايرة باستخدام ما يُسمى "التحكم في التحميل" تعتمد على التلوين المناعي لبروتينات التدبير المنزلي في الإجراء التقليدي، ولكنها تتجه مؤخرًا نحو تلوين البروتين الكلي نظرًا لفوائدها المتعددة. [ 26 ] وُصفت سبع طرق مختلفة على الأقل لتلوين البروتين الكلي لمعايرة لطخة ويسترن: بونسو إس ، والتقنيات الخالية من التلوين، وسيبرو روبي، وإبيكوكوكونون ، وكوماسي آر-350 ، وأميدو بلاك ، وسي 5. [ 26 ] لتجنب تشويش الإشارة، يجب إجراء تلوين البروتين الكلي قبل حجب الغشاء. ومع ذلك، وُصفت أيضًا عمليات التلوين بعد استخدام الأجسام المضادة. [ 27 ]

الحجب

بما أن الغشاء قد تم اختياره لقدرته على الارتباط بالبروتين، ولأن كلاً من الأجسام المضادة والبروتين المستهدف عبارة عن بروتينات، فلا بد من اتخاذ خطوات لمنع التفاعلات بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم للكشف عن البروتين المستهدف. ويتم حجب الارتباط غير النوعي بوضع الغشاء في محلول مخفف من البروتين - عادةً ما يكون 3-5% من ألبومين مصل البقر (BSA) أو حليب مجفف خالي الدسم (وكلاهما غير مكلف) في محلول ملحي منظم بالتروميثامين (TBS) أو محلول I-Block، مع نسبة ضئيلة (0.1%) من منظف مثل توين 20 أو تريتون X-100 . وعلى الرغم من تفضيل الحليب المجفف خالي الدسم لسهولة توفره، إلا أن استخدام محلول حجب مناسب ضروري لأن ليس كل البروتينات الموجودة في الحليب متوافقة مع جميع نطاقات الكشف. [ 1 ] يرتبط البروتين الموجود في المحلول المخفف بالغشاء في جميع المواضع التي لم ترتبط بها البروتينات المستهدفة. وبالتالي، عند إضافة الجسم المضاد، لا يمكنه الارتباط بالغشاء، ولذلك فإن موقع الارتباط الوحيد المتاح هو موقع ارتباط البروتين المستهدف المحدد. يؤدي هذا إلى تقليل الخلفية في المنتج النهائي للتلطيخ الغربي، مما يؤدي إلى نتائج أكثر وضوحًا، ويقضي على النتائج الإيجابية الكاذبة.

حضانة

عملية الفحص

أثناء عملية الكشف، يتم فحص الغشاء بحثًا عن البروتين المطلوب باستخدام جسم مضاد مُعدَّل مرتبط بإنزيم مُخبِر؛ فعند تعريضه لركيزة مناسبة، يُحفِّز هذا الإنزيم تفاعلًا لونيًا ينتج عنه لون. ولأسبابٍ عديدة، تتم هذه العملية تقليديًا على مرحلتين، مع وجود طرق كشف أحادية المرحلة متاحة الآن لبعض التطبيقات.

الجسم المضاد الأولي

تُنتَج الأجسام المضادة الأولية عند تعريض الكائن المضيف أو مزرعة الخلايا المناعية للبروتين المستهدف (أو جزء منه). عادةً، يُعدّ هذا جزءًا من الاستجابة المناعية، بينما في هذه الحالة، تُستخلص هذه الأجسام المضادة وتُستخدم كأدوات كشف حساسة ودقيقة ترتبط بالبروتين مباشرةً.

بعد عملية الحجب، يُحضن محلول من الأجسام المضادة الأولية (بتركيز يتراوح عادةً بين 0.5 و 5 ميكروغرام/مل) مخفف في محلول غسيل PBS أو TBST مع الغشاء مع التحريك اللطيف لمدة ساعة تقريبًا في درجة حرارة الغرفة، أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ويمكن أيضًا تحضينه في درجات حرارة مختلفة، حيث ترتبط درجات الحرارة المنخفضة بزيادة الارتباط، سواءً كان ارتباطًا نوعيًا (بالبروتين المستهدف، "الإشارة") أو غير نوعي ("التشويش"). بعد التحضين، يُغسل الغشاء عدة مرات بمحلول الغسيل لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة، وبالتالي تقليل التشويش الخلفي. [ 1 ] يتكون محلول الغسيل عادةً من محلول ملحي منظم مع نسبة صغيرة من المنظف، وأحيانًا مع مسحوق الحليب أو ألبومين المصل البقري (BSA).

الجسم المضاد الثانوي

بعد شطف الغشاء لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة، يُعرَّض الغشاء لجسم مضاد آخر يُعرف بالجسم المضاد الثانوي . تُستخلص الأجسام المضادة من مصادر حيوانية (أو من مزارع الخلايا الهجينة الحيوانية ). يتعرف الجسم المضاد الثانوي على الجزء الخاص بالنوع من الجسم المضاد الأولي ويرتبط به. لذلك، سيرتبط الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر بأي جسم مضاد أولي تقريبًا من مصدر فأر، ويمكن الإشارة إليه باسم الجسم المضاد "المضاد للنوع" (مثل مضاد للفأر، مضاد للماعز، إلخ). للسماح بالكشف عن البروتين المستهدف، يُربط الجسم المضاد الثانوي عادةً بالبيوتين أو بإنزيم مُخبِر مثل الفوسفاتاز القلوي أو بيروكسيداز الفجل . هذا يعني أن العديد من الأجسام المضادة الثانوية سترتبط بجسم مضاد أولي واحد، مما يُعزز الإشارة، ويسمح بالكشف عن البروتينات ذات التركيز المنخفض جدًا مقارنةً بما يُمكن رؤيته باستخدام تقنية SDS-PAGE وحدها.

يُستخدم إنزيم بيروكسيداز الفجل عادةً مع الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن البروتين المستهدف بتقنية التلألؤ الكيميائي . يقوم هذا الإنزيم بفصل الركيزة المتألقة كيميائيًا، مما ينتج عنه إضاءة . وبالتالي، تتناسب كمية الإضاءة الناتجة طرديًا مع كمية الجسم المضاد الثانوي المرتبط بإنزيم بيروكسيداز الفجل، ومن ثم، فهي تقيس وجود البروتين المستهدف بشكل غير مباشر. توضع شريحة حساسة من فيلم التصوير الفوتوغرافي على الغشاء، ويؤدي تعريضها لضوء التفاعل إلى تكوين صورة للأجسام المضادة المرتبطة باللطخة. هناك طريقة أخرى أقل تكلفة ولكنها أقل حساسية، وهي استخدام صبغة 4-كلورونافثول مع 1% من بيروكسيد الهيدروجين ؛ حيث ينتج عن تفاعل جذور البيروكسيد مع 4-كلورونافثول صبغة أرجوانية داكنة يمكن تصويرها دون الحاجة إلى فيلم تصوير فوتوغرافي متخصص.

كما هو الحال مع إجراءات ELISPOT و ELISA ، يمكن تزويد الإنزيم بجزيء ركيزة سيتم تحويله بواسطة الإنزيم إلى منتج تفاعل ملون سيكون مرئيًا على الغشاء (انظر الشكل أدناه مع الأشرطة الزرقاء).

تعتمد طريقة أخرى للكشف عن الأجسام المضادة الثانوية على استخدام جسم مضاد مرتبط بفلوروفور قريب من الأشعة تحت الحمراء. يكون الضوء الناتج عن إثارة صبغة فلورية ثابتًا، مما يجعل الكشف الفلوري مقياسًا أكثر دقة وفعالية للفرق في الإشارة الناتجة عن الأجسام المضادة الموسومة والمرتبطة بالبروتينات في لطخة ويسترن. يمكن تحديد كمية البروتينات بدقة لأن الإشارة الناتجة عن الكميات المختلفة من البروتينات على الأغشية تُقاس في حالة ثابتة، على عكس التلألؤ الكيميائي الذي يُقاس فيه الضوء في حالة ديناميكية. [ 28 ]

ثمة بديل ثالث يتمثل في استخدام علامة مشعة بدلاً من إنزيم مرتبط بالأجسام المضادة الثانوية، مثل وسم بروتين رابط للأجسام المضادة، كبروتين A الخاص بالمكورات العنقودية أو الستربتافيدين، بنظير مشع من اليود. ونظرًا لوجود طرق أخرى أكثر أمانًا وسرعةً وأقل تكلفة، فإن هذه الطريقة نادرًا ما تُستخدم حاليًا؛ إلا أن من مزاياها حساسية التصوير القائم على التصوير الإشعاعي الذاتي، مما يُمكّن من تحديد كمية البروتين بدقة عالية عند دمجه مع برامج بصرية (مثل Optiquant).

خطوة واحدة

تاريخيًا، كانت عملية التحليل تتم على مرحلتين نظرًا لسهولة إنتاج الأجسام المضادة الأولية والثانوية في عمليات منفصلة. وهذا يمنح الباحثين والشركات مزايا هائلة من حيث المرونة، وخفض التكاليف، وإضافة خطوة تضخيم إلى عملية الكشف. مع ذلك، ومع ظهور تحليل البروتينات عالي الإنتاجية وانخفاض حدود الكشف، ازداد الاهتمام بتطوير أنظمة تحليل أحادية المرحلة تسمح بإتمام العملية بشكل أسرع وباستخدام مواد استهلاكية أقل. يتطلب هذا جسمًا مضادًا يتعرف على البروتين المراد تحليله ويحتوي على علامة قابلة للكشف، وهي مجسات متوفرة غالبًا لعلامات البروتينات المعروفة . يُحضن المجس الأولي مع الغشاء بطريقة مشابهة لتلك المستخدمة مع الجسم المضاد الأولي في عملية من مرحلتين، ثم يصبح جاهزًا للكشف المباشر بعد سلسلة من خطوات الغسل.

الكشف والتصوير

الكشف الكيميائي الضوئي باستخدام تقنية ويسترن بلوت

بعد غسل المجسات غير المرتبطة، يصبح جهاز ويسترن بلوت جاهزًا للكشف عن المجسات الموسومة والمرتبطة بالبروتين المستهدف. عمليًا، لا تُظهر جميع فحوصات ويسترن بلوت البروتين في حزمة واحدة فقط على الغشاء. تُؤخذ تقديرات الحجم بمقارنة الحزم المصبوغة بحجم العلامة أو السلم المُحمّل أثناء الفصل الكهربائي. تُكرر هذه العملية عادةً للبروتينات البنيوية، مثل الأكتين أو التوبولين ، التي لا ينبغي أن تتغير بين العينات. تُعاير كمية البروتين المستهدف بالنسبة للبروتين البنيوي للتحكم بين المجموعات. تتمثل الاستراتيجية الأفضل في المعايرة بالنسبة للبروتين الكلي المرئي باستخدام ثلاثي كلورو الإيثانول [ 29 ] [ 30 ] أو الإيبكوكونون [ 31 ] . تضمن هذه الممارسة تصحيح كمية البروتين الكلي على الغشاء في حالة حدوث أخطاء أو عمليات نقل غير مكتملة. (انظر: معايرة ويسترن بلوت )

الكشف اللوني

تعتمد طريقة الكشف اللوني على حضانة لطخة ويسترن مع مادة أساسية تتفاعل مع الإنزيم المُخبِر (مثل البيروكسيداز ) المرتبط بالأجسام المضادة الثانوية. يؤدي هذا التفاعل إلى تحويل الصبغة الذائبة إلى شكل غير ذائب بلون مختلف يترسب بجوار الإنزيم، وبالتالي يصبغ الغشاء. بعد ذلك، يتم إيقاف عملية التلوين بغسل الصبغة الذائبة. تُقاس مستويات البروتين باستخدام قياس الكثافة الضوئية (شدة الصبغة) أو قياس الطيف الضوئي .

الكشف الكيميائي الضوئي

تعتمد طرق الكشف الكيميائي الضوئي على حضانة لطخة ويسترن مع مادة تتوهج عند تعرضها للمؤشر الموجود على الجسم المضاد الثانوي. ثم يُكشف الضوء بواسطة كاميرات CCD التي تلتقط صورة رقمية لللطخة أو فيلمًا فوتوغرافيًا. يتلاشى استخدام الفيلم في الكشف عن لطخة ويسترن تدريجيًا بسبب عدم خطية الصورة (عدم دقة القياس الكمي). تُحلل الصورة باستخدام قياس الكثافة الضوئية، الذي يُقيّم الكمية النسبية لتلوين البروتين ويُحدد النتائج كميًا من حيث الكثافة الضوئية. تسمح البرامج الحديثة بتحليلات بيانات إضافية، مثل تحليل الوزن الجزيئي، عند استخدام معايير مناسبة.

الكشف عن المواد المشعة

لا تتطلب العلامات المشعة ركائز إنزيمية، بل تسمح بوضع فيلم الأشعة السينية الطبية مباشرةً على لطخة ويسترن، حيث تتطور عند تعرضها للعلامة، مُكوّنةً مناطق داكنة تُطابق نطاقات البروتين المطلوبة (انظر الصورة أعلاه). تتضاءل أهمية طرق الكشف الإشعاعي نظرًا لخطورة الإشعاع الناتج عنها ، وتكلفتها الباهظة، ومخاطرها الصحية والسلامة العالية، ويُوفر التلألؤ الكيميائي المُعزز (ECL) بديلاً فعالاً.

الكشف الفلوري

تم إجراء تحليل ويسترن بلوت باستخدام جسم مضاد أولي مضاد لحمض الليبويك وجسم مضاد ثانوي موسوم بصبغة الأشعة تحت الحمراء في مستخلصات الليشمانيا الكبيرة

يُثار المجس الموسوم بالفلورة بواسطة الضوء، ثم يُكشف انبعاث الإثارة بواسطة مستشعر ضوئي، مثل كاميرا CCD مزودة بمرشحات انبعاث مناسبة، والتي تلتقط صورة رقمية للتلطيخ الغربي، مما يسمح بإجراء تحليلات بيانات إضافية، مثل تحليل الوزن الجزيئي والتحليل الكمي للتلطيخ الغربي. يُعتبر التألق أحد أفضل طرق التحديد الكمي، ولكنه أقل حساسية من التلألؤ الكيميائي. [ 32 ]

التحقيق الثانوي

يتمثل أحد الفروق الرئيسية بين أغشية النيتروسليلوز وأغشية PVDF في قدرة كل منهما على إزالة الأجسام المضادة وإعادة استخدام الغشاء في تجارب لاحقة. فبينما توجد بروتوكولات راسخة لإزالة الأجسام المضادة من أغشية النيتروسليلوز، فإن أغشية PVDF الأكثر متانة تُسهّل عملية الإزالة، وتتيح إعادة استخدام أكبر قبل أن يُعيق التشويش الخلفي التجارب. ويكمن فرق آخر في أن أغشية PVDF، على عكس أغشية النيتروسليلوز، يجب نقعها في محلول إيثانول بنسبة 95% أو إيزوبروبانول أو ميثانول قبل الاستخدام. كما تميل أغشية PVDF إلى أن تكون أكثر سمكًا وأكثر مقاومة للتلف أثناء الاستخدام. [ 33 ]

الحد الأدنى من متطلبات مواصفات اختبار ويسترن بلوت

لضمان قابلية تكرار نتائج لطخات ويسترن، من المهم الإبلاغ عن مختلف المعايير المذكورة أعلاه، بما في ذلك تحضير العينة، وتركيز البروتين المستخدم للتحميل، ونسبة الجل وظروف التشغيل، وطرق النقل المختلفة، وظروف محاولة الحجب، وتركيز الأجسام المضادة، وطرق التحديد الكمي والتعريفي. لا تغطي العديد من المقالات المنشورة جميع هذه المتغيرات. لذا، من الضروري وصف الظروف أو المعايير التجريبية المختلفة لزيادة قابلية تكرار لطخات ويسترن ودقتها. وبالتالي، يتطلب تحسين قابلية تكرار لطخات ويسترن وضع معايير إبلاغ دنيا. [ 2 ] [ 34 ]

الرحلان الكهربائي الهلامي ثنائي الأبعاد

تعتمد تقنية الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد SDS-PAGE على المبادئ والتقنيات المذكورة أعلاه. وكما يوحي الاسم، تتضمن هذه التقنية هجرة عديدات الببتيد في بُعدين. ففي البُعد الأول، تُفصل عديدات الببتيد وفقًا لنقطة التعادل الكهربائي ، بينما في البُعد الثاني، تُفصل وفقًا لوزنها الجزيئي . وتُحدد نقطة التعادل الكهربائي لبروتين معين من خلال النسبة بين الأحماض الأمينية الموجبة (مثل الليسين والأرجينين) والسالبة (مثل الغلوتامات والأسبارتات)، حيث تُساهم الأحماض الأمينية السالبة في انخفاض نقطة التعادل الكهربائي، بينما تُساهم الأحماض الأمينية الموجبة في ارتفاعها. ويمكن أيضًا فصل العينات أولًا في ظروف غير مُختزلة باستخدام SDS-PAGE، ثم في ظروف مُختزلة في البُعد الثاني، مما يُؤدي إلى كسر روابط ثنائي الكبريتيد التي تربط الوحدات الفرعية معًا. كما يُمكن دمج SDS-PAGE مع تقنية الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد باستخدام اليوريا (urea-PAGE) للحصول على هلام ثنائي الأبعاد.

من حيث المبدأ، تسمح هذه الطريقة بفصل جميع البروتينات الخلوية على هلام واحد كبير. ومن أهم مزاياها أنها غالباً ما تميز بين الأشكال المختلفة لبروتين معين، مثل البروتين المُفسفر (بإضافة مجموعة سالبة الشحنة). ويمكن استخلاص البروتينات المفصولة من الهلام وتحليلها باستخدام مطياف الكتلة ، الذي يحدد وزنها الجزيئي.

مشاكل

مشاكل الكشف

قد تظهر إشارة ضعيفة أو غائبة في الشريط لعدة أسباب تتعلق بكمية الأجسام المضادة والمستضدات المستخدمة. يمكن حل هذه المشكلة باستخدام التركيزات والتخفيفات المثالية للمستضدات والأجسام المضادة المحددة في ورقة بيانات المورد. كما يمكن معالجة ضعف الأشرطة الناتج عن انخفاض تركيزات العينة والأجسام المضادة عن طريق زيادة فترة التعريض في برنامج نظام الكشف. [ 2 ]

مشاكل متعددة في نطاقات الصوت

عندما يتحلل البروتين بواسطة البروتيازات، قد تظهر عدة نطاقات أخرى غير النطاقات المتوقعة ذات الوزن الجزيئي المنخفض. يمكن منع ظهور العديد من النطاقات بتحضير عينات البروتين بشكل صحيح باستخدام كمية كافية من مثبطات البروتياز. قد تظهر نطاقات متعددة في منطقة الوزن الجزيئي العالي لأن بعض البروتينات تُشكّل ثنائيات وثلاثيات ومتعددات؛ ويمكن حل هذه المشكلة بتسخين العينة لفترات أطول. تتسبب البروتينات ذات التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) أو الأشكال المتغايرة المتعددة في ظهور عدة نطاقات في مناطق أوزان جزيئية مختلفة. يمكن إزالة التعديلات ما بعد الترجمة من العينة باستخدام مواد كيميائية محددة، والتي تزيل أيضًا النطاقات الإضافية. [ 2 ]

خلفية عالية

قد تؤدي التركيزات العالية للأجسام المضادة، وعدم كفاية عملية الحجب، وعدم كفاية الغسل، وطول مدة التعريض أثناء التصوير إلى ظهور خلفية عالية في اللطخات. ويمكن تجنب هذه الخلفية العالية بمعالجة هذه المشكلات. [ 2 ]

أشرطة غير منتظمة وغير متساوية

يُزعم ظهور مجموعة متنوعة من الحزم غير المنتظمة وغير المتساوية، بما في ذلك النقاط السوداء والبقع أو الحزم البيضاء والحزم المنحنية. تُزال النقاط السوداء من اللطخات عن طريق الحجب الفعال. تتكون البقع البيضاء نتيجةً للفقاعات بين الغشاء والهلام. تظهر الحزم البيضاء في اللطخات عند وجود الأجسام المضادة الرئيسية والثانوية بتراكيز عالية. بسبب الجهد العالي المستخدم أثناء تشغيل الهلام والهجرة السريعة للبروتين، تظهر حزم مبتسمة في اللطخات. تُحل مشكلة الحزم غير المنتظمة في اللطخة بحل هذه المشكلات. [ 2 ]

إجراءات التخفيف

أثناء عملية التلطيخ الغربي، قد تظهر عدة مشاكل تتعلق بخطواتها المختلفة. قد تنشأ هذه المشاكل من خطوة تحليل البروتين، مثل الكشف عن البروتينات ذات التعديلات الطفيفة أو المعدلة بعد الترجمة. إضافةً إلى ذلك، قد تعتمد هذه المشاكل على اختيار الأجسام المضادة، إذ تلعب جودتها دورًا هامًا في الكشف عن البروتينات بدقة. [ 3 ] ونظرًا لوجود هذه المشاكل، تُجرى تحسينات متنوعة في مجالي تحضير مستخلصات الخلايا وإجراءات التلطيخ للحصول على نتائج موثوقة. علاوةً على ذلك، ولتحقيق تحليل أكثر حساسية والتغلب على المشاكل المرتبطة بالتلطيخ الغربي، طُوّرت واستُخدمت تقنيات مختلفة، مثل التلطيخ الغربي البعيد ، والتلطيخ بالانتشار، والتلطيخ الغربي بدقة الخلية الواحدة ، والتلطيخ الغربي الآلي بتقنية الموائع الدقيقة . [ 3 ]

عرض تقديمي

يستخدم الباحثون برامج مختلفة لمعالجة وتنسيق مقاطع الصور لعرض نتائج لطخة ويسترن بشكل أنيق. ومن الأدوات الشائعة: Adobe Illustrator و GIMP و ImageJ و Microsoft PowerPoint و Sciugo .

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 محمود ت، يانغ ب.س. (سبتمبر 2012). "التلطيخ الغربي: التقنية، النظرية، وحل المشكلات" . مجلة أمريكا الشمالية للعلوم الطبية . 4 (9): 429-434 . doi : 10.4103/1947-2714.100998 (غير نشط في 12 يوليو 2025). PMC 3456489. PMID 23050259 .  {{cite journal}}: صيانة CS1: رقم التعريف الرقمي غير نشط اعتبارًا من يوليو 2025 ( رابط )
  2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 بيجوم هـ، موروجيسان ب، تانجوتور أ.د. (يونيو 2022). "التلطيخ الغربي: أداة أساسية في البحث العلمي والطبي الحيوي" . تقنيات حيوية . 73 (1): 58-69 . doi : 10.2144/btn-2022-0003 . PMID 35775367. S2CID 250175915 .  
  3. 1 2 3 4 5 6 7 ميشرا م، تيواري س، غوميز أ.ف. (نوفمبر 2017). "تنقية البروتين وتحليله: تقنيات الجيل التالي للتلطيخ الغربي" . مراجعة الخبراء في علم البروتينات . 14 (11): 1037-1053 . doi : 10.1080/14789450.2017.1388167 . PMC 6810642. PMID 28974114 .  
  4. ↑ ألوين، جيه سي، وكيمب، دي جيه، وستارك، جي آر (ديسمبر 1977). "طريقة للكشف عن أنواع محددة من الحمض النووي الريبي (RNA) في هلامات الأغاروز عن طريق النقل إلى ورق ديازوبنزيلوكسي ميثيل والتهجين مع مجسات الحمض النووي (DNA)" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 74 (12): 5350-5354 . Bibcode : 1977PNAS...74.5350A . doi : 10.1073/pnas.74.12.5350 . PMC 431715. PMID 414220 .  
  5. ↑ بورنيت دبليو إن (أبريل 1981). ""التلطيخ الغربي": النقل الكهربائي للبروتينات من هلامات دوديسيل كبريتات الصوديوم-بولي أكريلاميد إلى غشاء نيتروسليلوز غير معدل، والكشف الإشعاعي باستخدام الأجسام المضادة والبروتين A المشع باليود. الكيمياء الحيوية التحليلية . 112 (2): 195-203 . doi : 10.1016/0003-2697(81)90281-5 . PMID 6266278 . 
  6. 1 2 رينارت ج، ريزر ج، ستارك جي آر (يوليو 1979). "نقل البروتينات من الهلام إلى ورق ديازوبنزيلوكسي ميثيل والكشف عنها باستخدام الأمصال المضادة: طريقة لدراسة خصوصية الأجسام المضادة وبنية المستضد" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 76 (7): 3116-3120 . Bibcode : 1979PNAS...76.3116R . doi : 10.1073 / pnas.76.7.3116 . PMC 383774. PMID 91164 .  
  7. 1 2 تاوبين هـ، ستيهلين ت، جوردون ج (سبتمبر 1979). "النقل الكهربائي للبروتينات من هلامات البولي أكريلاميد إلى أغشية النيتروسليلوز: الإجراء وبعض التطبيقات" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 76 (9): 4350-4354 . Bibcode : 1979PNAS...76.4350T . doi : 10.1073/pnas.76.9.4350 . PMC 411572. PMID 388439 .  
  8. 1 2 موريتز سي بي (فبراير 2020). "40 عامًا على تقنية ويسترن بلوت: نخب علمي بمناسبة عيد ميلادها" . مجلة البروتينات . 212 103575. doi : 10.1016/j.jprot.2019.103575 . PMID 31706026 . 
  9. ↑ ألكسندر تي إس (أبريل 2016). باسيتي إم إف (محرر). "الاختبارات التشخيصية لفيروس نقص المناعة البشرية: 30 عامًا من التطور" . علم المناعة السريري واللقاحات . 23 (4): 249-253 . doi : 10.1128/CVI.00053-16 . PMC 4820517. PMID 26936099 .  
  10. ↑ سودها ت، لاكشمي ف، تيا في دي (2006). "النمط المناعي الغربي في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية" . المجلة الهندية للأمراض الجلدية والتناسلية والجذام . 72 (5): 357-360 . doi : 10.4103/0378-6323.27752 . PMID 17050930 . 
  11. ↑ إنجروسو إل، فيتروجنو في، كاردوني إف، بوتشياري إم (يونيو 2002). "التشخيص الجزيئي لاعتلالات الدماغ الإسفنجية المعدية". اتجاهات في الطب الجزيئي . 8 (6): 273-280 . doi : 10.1016/S1471-4914(02)02358-4 . PMID 12067613 . 
  12. ↑ شميت ب، سبلتستوسر و، بورش-أوزكوروميز م، فينكه إي ج، غرونو ر (أغسطس 2005). "اختبار ELISA جديد للكشف المبكر واختبار Western blot تأكيدي مفيدان لتشخيص ودراسات وبائية لداء التولاريميا" . علم الأوبئة والعدوى . 133 (4): 759-766 . doi : 10.1017/s0950268805003742 . PMC 2870305. PMID 16050523 .  
  13. ↑ أرتسوب ، هـ. (مارس 1993). "اختبار ويسترن بلوت كاختبار تأكيدي لداء لايم" . المجلة الكندية للأمراض المعدية . 4 (2): 115-116 . doi : 10.1155/1993/796390 . PMC 3250769. PMID 22346434 .  
  14. ↑ دي كاسترو إل، يوشيدا سي إف، غاسبار إيه إم، غوميز إس إيه (ديسمبر 1996). "تحليل لطخة ويسترن للتفاعل بين البروتينات الغلافية لفيروسات التهاب الكبد ب من حاملي الفيروس البرازيليين والأجسام المضادة المُنتجة ضد لقاحات التهاب الكبد ب المُعاد تركيبها". مجلة أكتا فيرولوجيكا . 40 ( 5-6 ): 251-258 . PMID 9171452 . 
  15. ↑ جولدن إم آر، آشلي-مورو آر، سوينسون بي، هوغريف دبليو آر، هاندزفيلد إتش إتش، والد إيه (ديسمبر 2005). "الاختبار التأكيدي لفيروس الهربس البسيط من النوع الثاني (HSV-2) باستخدام تقنية ويسترن بلوت لدى الرجال الذين ثبتت إصابتهم بفيروس HSV-2 باستخدام اختبار المقايسة المناعية الإنزيمية المرتبطة بالإنزيم (ELISA ) في عيادة للأمراض المنقولة جنسيًا" . الأمراض المنقولة جنسيًا . 32 (12): 771-777 . doi : 10.1097/01.olq.0000175377.88358.f3 . PMID 16314775. S2CID 10591513 .  
  16. ↑ "اختبار فيروس نقص المناعة لدى القطط - أيها يُستخدم؟" . كات وورك . تم الاطلاع عليه بتاريخ 6 ديسمبر 2020 .
  17. ↑ بوم ن، جان ن، إيمري س، ماندانس ب، شفايتزر س، جيرو س، وآخرون . (مايو 2015). " برنامج مكافحة المنشطات والرصد البيولوجي قبل وأثناء كأس العالم لكرة القدم 2014 في البرازيل" . المجلة البريطانية للطب الرياضي . 49 (9): 614-622 . doi : 10.1136/bjsports-2015-094762 . PMC 4413745. PMID 25878079 .   
  18. ↑ رايشل سي، بينيتكا دبليو، لورينك بي، ثيفيس إم (نوفمبر 2016). "تقييم الجسم المضاد لإريثروبويتين من سلالة AMGEN 9G8A لاستخدامه في مكافحة المنشطات". اختبار الأدوية وتحليلها . 8 ( 11-12 ): 1131-1137 . doi : 10.1002/dta.2057 . PMID 27552163 . 
  19. ↑ Schwenke D (2015). "ملاحظة تطبيقية: تحسين الكشف عن EPO في الدم والبول بناءً على هلامات Velum SAR الأفقية المصبوبة مسبقًا والمحسّنة للتحليل الروتيني" (PDF) .
  20. ↑ لي واي إتش، تان إتش تي، تشونغ إم سي (نوفمبر 2010). "طرق واستراتيجيات تجزئة المكونات الخلوية لعلم البروتينات" . علم البروتينات . 10 (22): 3935-3956 . doi : 10.1002/pmic.201000289 . PMID 21080488. S2CID 29256675 .  
  21. ↑ باربيريس إي، مارينغو إي، مانفريدي إم (2021). "التنبؤ بموقع البروتين داخل الخلية". في سيكوني دي (محرر). تحليل بيانات البروتينات . مناهج في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 2361. نيويورك، نيويورك: سبرينغر الولايات المتحدة. الصفحات 197-212 . doi : 10.1007/978-1-0716-1641-3_12 . ISBN   978-1-0716-1640-6PMID 34236663 . S2CID 235768807 .​  
  22. ↑ ماير آر إتش، ماير سي جيه، ريد آر، هينتنر إتش، باور جيه دبليو، أوندر كيه (أبريل 2010). " تحديد مواقع المستضدات للأجسام المضادة باستخدام مكتبة عديدات الببتيد القائمة على مصفوفة الخلايا" . مجلة الفحص الجزيئي الحيوي . 15 (4): 418-426 . doi : 10.1177/1087057110363821 . PMID 20233905. S2CID 210137 .  
  23. ↑ كونغ د، ليو ج، جيانغ كيو، يو زد، هو إكس، غو د، وآخرون . (فبراير 2016). "إنتاج وتوصيف وتحديد مواقع المستضدات للأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد أنواع فرعية مختلفة من فيروس مرض النزف الأرنبي (RHDV)" . التقارير العلمية . 6 (1) 20857. Bibcode : 2016NatSR...620857K . doi : 10.1038/srep20857 . PMC 4754648. PMID 26878800 .   
  24. ↑ مورفي آر إم، لامب جي دي (ديسمبر 2013). "اعتبارات هامة لتحليلات البروتين باستخدام التقنيات القائمة على الأجسام المضادة: تصغير حجم لطخة ويسترن يُحسّن النتائج" . مجلة علم وظائف الأعضاء . 591 (23): 5823-5831 . doi : 10.1113/jphysiol.2013.263251 . PMC 3872754. PMID 24127618 .  
  25. ↑ باس جيه جيه، ويلكنسون دي جيه، رانكين دي، فيليبس بي إي، سزيكزيك إن جيه، سميث كيه، أثيرتون بي جيه (يناير 2017). " نظرة عامة على الاعتبارات التقنية لتطبيقات التلطيخ الغربي في البحوث الفيزيولوجية" . المجلة الإسكندنافية للطب والعلوم في الرياضة . 27 (1): 4-25 . doi : 10.1111/sms.12702 . PMC 5138151. PMID 27263489 .  
  26. 1 2 موريتز سي بي (أكتوبر 2017). "التوبولين أم لا: التوجه نحو تلوين البروتين الكلي كعنصر تحكم في التحميل في لطخات ويسترن" ( ملف PDF) . علم البروتينات . 17 (20) 1600189. doi : 10.1002/pmic.201600189 . PMID 28941183. S2CID 22305461 .  
  27. ↑ ويليندر سي، إيكبلاد إل (مارس 2011). "تلوين كوميسي كعامل تحكم في التحميل في تحليل ويسترن بلوت". مجلة أبحاث البروتينات . 10 (3): 1416-1419 . doi : 10.1021/pr1011476 . PMID 21186791 . 
  28. ↑ أمبروز ك. (2006-09-20). "تحسين دقة القياس الكمي في لطخات ويسترن" (ملف PDF) . تحليل الصور .
  29. ↑ ستينرت إي، أرولد آر (أكتوبر 1973). "[القناة السمعية الخارجية المزدوجة (ترجمة المؤلف)]". مجلة طب الأنف والأذن والحنجرة . 21 (10): 293-296 . PMID 4769330 . 
  30. ↑ جيلدا جيه إي، غوميز إيه في (سبتمبر 2013). "تلوين البروتين الكلي الخالي من الصبغة هو ضابط تحميل أفضل من بيتا-أكتين في لطخات ويسترن" . الكيمياء الحيوية التحليلية . 440 (2): 186-188 . Bibcode : 2013AnBio.440..186G . doi : 10.1016/j.ab.2013.05.027 . PMC 3809032. PMID 23747530 .  
  31. ↑ موريتز سي بي، مارز إس إكس، ريس آر، شولنبورغ تي، فرياوف إي (فبراير 2014). "تلوين إيبيكوكوكونون: أداة تحكم فعّالة لتحميل البروتينات في لطخات ويسترن". بروتيوميكس . 14 ( 2-3 ) : 162-168 . doi : 10.1002/pmic.201300089 . PMID 24339236. S2CID 206368546 .  
  32. ↑ ماثيوز إس تي، بلايسانس إي بي، كيم تي (2009). "أنظمة التصوير للتلطيخ الغربي: الكشف الكيميائي الضوئي مقابل الكشف بالأشعة تحت الحمراء". تلطيخ البروتين والكشف عنه . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 536. دار هومانا للنشر. الصفحات 499-513 . doi : 10.1007/978-1-59745-542-8_51 . ISBN   978-1-934115-73-2PMID 19378087​​ 
  33. ↑ كورين بي تي، سكوفيلد آر إتش (2015). "طرق أخرى بارزة لتلطيخ البروتين: مراجعة موجزة". في كورين بي تي، سكوفيلد آر إتش (محرران). التلطيخ الغربي . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 1312. نيويورك، نيويورك: سبرينغر نيويورك. الصفحات 487-503 . doi : 10.1007/978-1-4939-2694-7_51 . ISBN   978-1-4939-2693-0. PMC 7301620 . PMID 26044032 .  
  34. ↑ جيلدا جيه إي، غوش آر، تشيا جيه إكس، ويست تي إم، بودين إس سي، غوميز إيه في (19 أغسطس 2015). " عدم دقة تقنية ويسترن بلوت مع الأجسام المضادة غير الموثقة: الحاجة إلى معيار أدنى للإبلاغ عن نتائج ويسترن بلوت (WBMRS)" . PLOS ONE . 10 (8) e0135392. Bibcode : 2015PLoSO..1035392G . doi : 10.1371/journal.pone.0135392 . PMC 4545415. PMID 26287535 .