التحويل العكسي

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

النقل العكسي هو تقنية لنقل المادة الوراثية إلى الخلايا . ولأن الحمض النووي يُطبع على شريحة زجاجية قبل إضافة الخلايا الملتصقة، فإن ترتيب إضافة الحمض النووي والخلايا الملتصقة يكون معكوسًا لترتيب النقل التقليدي . [ 1 ] ومن هنا جاءت تسمية "العكسي".

عملية

تحضير مزيج النقل الجيني لطباعة الشرائح

يمكن استخدام مزيج من الحمض النووي والجيلاتين للطباعة على شريحة زجاجية. يُذاب مسحوق الجيلاتين أولًا في ماء معقم فائق النقاء (Milli-Q) لتكوين محلول جيلاتين بتركيز 0.2%. ثم يُخلط بلازميد الحمض النووي النقي مع محلول الجيلاتين، مع الحرص على أن يكون تركيز الجيلاتين النهائي أعلى من 0.17%. بالإضافة إلى الجيلاتين، يُعد كل من الأتيلوكولاجين والفيبرونيكتين من نواقل النقل الجيني الناجحة لإدخال الحمض النووي الغريب إلى نواة الخلية.

طباعة شرائح خليط الحمض النووي والجيلاتين

بعد تحضير مزيج الحمض النووي والجيلاتين، يُنقل المزيج باستخدام ماصة إلى سطح شريحة زجاجية، ثم توضع الشريحة في طبق بتري مغطى . يُضاف مُجفف إلى الطبق لتجفيف المحلول. بعد ذلك، تُسكب الخلايا المُستزرعة في الطبق لامتصاص البلازميد. مع ذلك، وبفضل ابتكار أنواع مختلفة من أنظمة طباعة المصفوفات الدقيقة ، أصبح بالإمكان طباعة مئات من مخاليط النقل الجيني (التي تحتوي على أنواع مختلفة من الحمض النووي) على الشريحة نفسها لامتصاص الخلايا للبلازميدات. [ 2 ] يوجد نوعان رئيسيان من أنظمة طباعة المصفوفات الدقيقة تُصنّعهما شركات مختلفة: أنظمة الطباعة التلامسية وأنظمة الطباعة غير التلامسية.

من الأمثلة على أنظمة الطباعة غير التلامسية نظام Piezorray المرن للطباعة الدقيقة غير التلامسية. يستخدم هذا النظام التحكم بالضغط وطوقًا كهرضغطياً لضغط قطرات متجانسة بحجم 333 بيكولتر تقريبًا. لا تلامس موزعات PiezoTip السطح المراد وضع العينة عليه، مما يقلل من احتمالية التلوث ويزيل خطر إتلاف السطح المستهدف. ومن الأمثلة على أنظمة الطباعة التلامسية نظام SpotArray 72 (Perkin Elmer Life Sciences) للطباعة الموضعية. يمكن لرأس الطباعة استيعاب ما يصل إلى 48 دبوسًا، ويُنشئ مصفوفات مضغوطة عن طريق رفع وخفض مجموعات فرعية من الدبابيس بشكل انتقائي أثناء الطباعة. بعد الطباعة، تُغسل الدبابيس بغسالة دبابيس قوية تعمل بنفث الضغط وتُجفف بالتفريغ، مما يمنع انتقال أي شوائب. ومن الأمثلة الأخرى على أنظمة الطباعة التلامسية نظام Qarray (Genetix). يتوفر هذا النظام بثلاثة أنواع: QArray Mini وQArray 2 وQArray Max. بعد الطباعة، يُترك المحلول ليجف، ثم يتم تثبيت الحمض النووي-الجيلاتين بإحكام في مكانه على المصفوفة.

نظام HybriWell في عملية النقل العكسي

أولًا، يُزال اللاصق من جهاز HybriWell، ثم يُلصق الجهاز فوق المنطقة المطبوعة بمحلول الجيلاتين-DNA على الشريحة. ثانيًا، يُسحب 200 ميكرولتر من مزيج النقل الجيني باستخدام ماصة، ويُوضع في أحد منافذ جهاز HybriWell؛ حيث يتوزع المزيج بالتساوي على الشريحة. بعد ذلك، تُحضن الشريحة، وتختلف درجة الحرارة والمدة حسب نوع الخلايا المستخدمة. ثالثًا، يُسحب مزيج النقل الجيني باستخدام ماصة، ويُزال جهاز HybriWell باستخدام ملقط دقيق الطرف . رابعًا، تُوضع الشريحة المطبوعة المعالجة بكاشف النقل الجيني في طبق مربع بحيث يكون الجانب المطبوع متجهًا للأعلى. خامسًا، تُسكب الخلايا المحصودة برفق على الشرائح (وليس على المناطق المطبوعة). أخيرًا، يُوضع الطبق في حاضنة رطبة عند  درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون، ويُحضن طوال الليل.

كواشف أخرى للتحويل العكسي

يُستخدم كاشف إيفيكتين مع المُحسِّن ومحلول تكثيف الحمض النووي (محلول EC) لتحقيق كفاءة عالية في عملية النقل الجيني. في الخطوة الأولى من تكوين مُركَّب إيفيكتين-الحمض النووي ، يتم تكثيف الحمض النووي من خلال تفاعله مع المُحسِّن في نظام محلول مُحدَّد. ثم يُضاف كاشف إيفيكتين إلى الحمض النووي المُكثَّف لإنتاج مُركَّبات إيفيكتين-الحمض النووي المُكثَّفة. تُخلط مُركَّبات إيفيكتين-الحمض النووي مع الوسط وتُضاف مباشرةً إلى الخلايا. يُشكِّل كاشف إيفيكتين تلقائيًا تراكيب ميسيلية لا تُظهر أي اختلاف في الحجم أو بين الدفعات (كما هو الحال مع كواشف الليبوسومات المُصاغة مُسبقًا). تضمن هذه الخاصية إمكانية تكرار تكوين مُركَّب النقل الجيني. تُعد عملية تكثيف جزيئات الحمض النووي بدرجة عالية ثم تغليفها بكاشف إيفيكتين طريقة فعالة لنقل الحمض النووي إلى الخلايا حقيقية النواة .

المزايا والعيوب

تتمثل مزايا النقل العكسي للجينات (مقارنة بالنقل التقليدي للجينات) فيما يلي:

  • إن إضافة الخلايا المستهدفة وربطها بالسطح المحمل بالحمض النووي يمكن أن يؤدي إلى زيادة احتمالية تلامس الخلية مع الحمض النووي، مما قد يؤدي إلى زيادة كفاءة النقل الجيني. [ 3 ]
  • مواد موفرة للجهد (كمية أقل من الحمض النووي مطلوبة)
  • الفحص عالي الإنتاجية؛ يمكن التعبير عن مئات الجينات في الخلايا على شريحة دقيقة واحدة لدراسة التعبير الجيني وتنظيمه. [ 4 ]
  • يؤدي زرع الخلايا بشكل متوازٍ في حجرة واحدة لـ 384 تجربة، دون فصل مادي بين التجارب، إلى تحسين جودة بيانات الفحص . وتحدث اختلافات بين الآبار في التجارب التي تُجرى في أطباق متعددة الجدران.
  • يمكن إنتاج مصفوفات متطابقة تمامًا، حيث يمكن تجفيف نفس لوحة مصدر العينة وطباعتها على شرائح مختلفة لمدة تخزين لا تقل عن 15 شهرًا دون فقدان واضح لكفاءة النقل الجيني.

من عيوب عملية النقل العكسي للجينات ما يلي:

  • تعتبر عملية النقل العكسي أكثر تكلفة لأنها تتطلب نظام طباعة مصفوفة دقيقة وفعال للغاية لطباعة محلول الحمض النووي والجيلاتين على الشرائح.
  • وقد تطلبت التطبيقات التي تستخدم خطوط الخلايا المختلفة (حتى الآن) اختلافات في البروتوكول لتصنيع مصفوفات siRNA أو البلازميد، الأمر الذي ينطوي على تطوير واختبار كبيرين.
  • تزداد احتمالية التلوث المتبادل بين نقاط المصفوفة مع زيادة كثافة النقاط؛ لذلك، فإن تحسين تصميم المصفوفة أمر مهم. [ 5 ]

مراجع

  1. ↑ "التحويل العكسي" . تم الاطلاع عليه بتاريخ 24 أغسطس 2018 .
  2. ↑ الصفحة الرئيسية لعملية النقل العكسي تم استرجاعها في 14-10-2011.
  3. ↑ إيرفلي، هولجر؛ نيومان، بيات؛ ليبل، أوربان؛ روجرز، فيل؛ هيلد، مايكل؛ والتر، توماس؛ إلينبيرج، يان؛ بيبركوك، راينر (فبراير 2007). "التحويل العكسي على مصفوفات الخلايا لفحص المجهر عالي المحتوى" . بروتوكولات الطبيعة . 2 (2): 392-399 . doi : 10.1038/nprot.2006.483 . ISSN 1750-2799 . PMID 17406600 .  
  4. ↑ نيومان، بيات؛ هيلد، مايكل؛ ليبل، أوربان؛ إيرفل، هولجر؛ روجرز، فيل؛ بيبركوك، راينر؛ إيلنبرغ، جان (مايو 2006). "فحص RNAi عالي الإنتاجية باستخدام التصوير الزمني للخلايا البشرية الحية" . Nature Methods . 3 (5): 385–390 . doi : 10.1038/nmeth876 . ISSN 1548-7091 . PMID 16628209 .  
  5. ↑ خطوط الخلايا السرطانية والخلايا الأولية. تم الاطلاع عليه بتاريخ 14-10-2011.