مطيافية الرنين المغناطيسي النووي ثنائية الأبعاد

أول تجربة وأكثرها شيوعًا في مجال الرنين النووي المغناطيسي ثنائي الأبعاد هي سلسلة مطيافية الارتباط المتجانس (COSY)، والتي تُستخدم لتحديد اللف المغزلي المرتبط ببعضه البعض. تتكون هذه السلسلة من نبضة تردد راديوي واحدة (p1) متبوعة بفترة زمنية محددة (t1)، ثم نبضة ثانية (p2)، ثم فترة قياس (t2). ^{[ 7 ]}

تعتمد تجربة مطيافية الارتباط على ربط النوى ببعضها البعض عبر اقتران قياسي، يُعرف أيضًا باسم اقتران J. ^{[ 8 ]} هذا الاقتران هو التفاعل بين اللف المغزلي النووي المرتبط بروابط، ويُلاحظ عادةً بين النوى التي تفصل بينها رابطتان أو ثلاث روابط (مثل البروتونات المتجاورة). من خلال رصد هذه التفاعلات، توفر تقنية COSY معلومات حيوية حول الترابط بين الذرات داخل الجزيء، مما يجعلها أداة بالغة الأهمية لتحديد البنية في الكيمياء العضوية.

تُنتج تجربة COSY طيفًا ثنائي الأبعاد بإزاحات كيميائية على طول المحور السيني (الأفقي) والمحور الصادي (الرأسي)، وتتضمن عدة خطوات رئيسية. ^{[ 1 ]} أولًا، تُثار العينة باستخدام سلسلة من نبضات الترددات الراديوية (RF)، مما يؤدي إلى رفع طاقة اللف المغزلي للنوى . بعد النبضة الأولى، يتطور النظام بحرية لفترة زمنية تُسمى t1 _، حيث تدور اللفات المغزلية بترددات تُطابق إزاحاتها الكيميائية. يتم تحقيق الارتباط بين النوى عن طريق تغيير زمن التطور (t1) تدريجيًا _لرصد التفاعلات غير المباشرة. تسمح هذه السلسلة من التجارب، التي تُجرى كل منها بقيمة مختلفة لـ t1 _، بالكشف عن الإزاحات الكيميائية للنوى التي قد لا تُلاحظ مباشرةً في طيف أحادي البعد. مع زيادة t1 _، تظهر قمم متقاطعة في الطيف ثنائي الأبعاد الناتج، تُمثل تفاعلات مثل الاقتران أو التقارب المكاني بين النوى. يساعد هذا النهج في رسم خرائط الروابط الذرية، مما يوفر فهمًا أعمق للبنية الجزيئية ويساعد في تفسير الأنظمة المعقدة.

تنتج قمم التقاطع عن ظاهرة تُسمى انتقال المغنطة ، ويشير وجودها إلى اقتران نواتين لهما إزاحتان كيميائيتان مختلفتان تُشكلان إحداثيات قمة التقاطع. يُنتج كل اقتران قمتين متقاطعتين متناظرتين أعلى وأسفل القطر. أي أن قمة التقاطع تحدث عندما يكون هناك ترابط بين إشارات الطيف على طول كل من المحورين عند هذه القيم. من الطرق البصرية السهلة لتحديد الاقترانات التي تُمثلها قمة التقاطع، إيجاد قمة القطر التي تقع مباشرةً أعلى أو أسفل قمة التقاطع، وقمة القطر الأخرى التي تقع مباشرةً إلى يسار أو يمين قمة التقاطع. النواتان اللتان تُمثلهما هاتان القمتان القطريتان مُقترنتان. ^{[ 7 ]}

بعد ذلك، تُطبَّق نبضة تردد لاسلكي ثانية للسماح بانتقال المغنطة بين النوى المتصلة. تُسجَّل الإشارة الناتجة باستمرار خلال فترة الكشف (t2 ₎ بعد النبضة الثانية. ثم تُعالَج البيانات بتحويل فورييه على طول المحورين t1 _و t2 _، مما يُنشئ طيفًا ثنائي الأبعاد بقمم مرسومة على القطر الرئيسي وخارجه.

عند تفسير طيف COSY، تتوافق القمم القطرية مع الإزاحات الكيميائية أحادية البعد للنوى الفردية، على غرار القمم القياسية في طيف الرنين النووي المغناطيسي أحادي البعد. السمة الرئيسية لطيف COSY هي وجود قمم متقاطعة كما هو موضح في الشكل 1، مما يشير إلى اقتران بين أزواج من النوى. توفر هذه القمم المتقاطعة معلومات بالغة الأهمية حول الترابط داخل الجزيء، حيث تُظهر أن النواتين متصلتان بعدد قليل من الروابط، عادةً رابطتين أو ثلاث روابط.

يُعدّ تحليل COSY مفيدًا للغاية عند التعامل مع الجزيئات المعقدة مثل المنتجات الطبيعية والببتيدات والبروتينات، حيث يُعدّ فهم ترابط النوى المختلفة عبر الروابط أمرًا بالغ الأهمية. في حين أن تحليل الرنين النووي المغناطيسي أحادي البعد (1D NMR) أبسط وأمثل لتحديد السمات البنيوية الأساسية، فإن تحليل COSY يُعزز قدرات الرنين النووي المغناطيسي من خلال توفير رؤى أعمق حول الترابط الجزيئي.

يُظهر الطيف ثنائي الأبعاد الناتج عن تجربة COSY ترددات نظير واحد، وهو الهيدروجين ( ^¹H) في أغلب الأحيان، على طول كلا المحورين. (وقد طُوّرت تقنيات أخرى لتوليد أطياف الارتباط بين النوى غير المتجانسة، حيث يتوافق المحوران مع نظائر مختلفة، مثل ^¹³ C و <sup ^>1 </sup>H). تتوافق القمم القطرية مع القمم في تجربة الرنين النووي المغناطيسي أحادي البعد (1D-NMR)، بينما تشير القمم المتقاطعة إلى اقترانات بين أزواج من النوى (كما يشير انقسام التعددية إلى اقترانات في الرنين النووي المغناطيسي أحادي البعد). ^{[ 7 ]}

يُعدّ COSY-90 أكثر تجارب COSY شيوعًا. في هذا النوع، تُغيّر نبضة p1 زاوية دوران النواة بمقدار 90 درجة. ومن أنواع COSY الأخرى COSY-45 ، حيث تُستخدم نبضة بزاوية 45 درجة بدلًا من نبضة بزاوية 90 درجة للنبضة الثانية p2. وتكمن ميزة COSY-45 في أن قمم القطر أقل وضوحًا، مما يُسهّل مطابقة القمم المتقاطعة القريبة من القطر في الجزيئات الكبيرة. إضافةً إلى ذلك، يُمكن تحديد الإشارات النسبية لثوابت الاقتران (انظر اقتران J# مقدار اقتران J ) من طيف COSY-45، وهو أمر غير ممكن باستخدام COSY-90. ^{[ 9 ]} عمومًا، يُقدّم COSY-45 طيفًا أنقى، بينما يتميّز COSY-90 بحساسية أعلى.

تقنية أخرى ذات صلة بتقنية COSY هي تقنية COSY المُصفّاة كميًا مزدوجًا (DQF). تستخدم هذه التقنية طريقة اختيار التماسك، مثل تدوير الطور أو تدرجات المجال النبضية ، مما يجعل الإشارات الناتجة عن التماسك الكمي المزدوج فقط هي التي تُعطي إشارة قابلة للملاحظة. يؤدي هذا إلى تقليل شدة القمم القطرية وتغيير شكل خطوطها من شكل خط "تشتت" عريض إلى شكل خط "امتصاص" أكثر حدة. كما أنه يُزيل القمم القطرية الناتجة عن النوى غير المقترنة. تتميز هذه التقنيات جميعها بأنها تُعطي طيفًا أنقى، حيث تُمنع القمم القطرية من حجب القمم المتقاطعة، التي تكون أضعف في طيف COSY العادي. ^{[ 10 ]}

تُشبه تجربة TOCSY تجربة COSY في رصد قمم التداخل بين البروتونات المتزاوجة. إلا أن هذه القمم لا تقتصر على النوى المتزاوجة مباشرةً، بل تشمل أيضًا النوى المتصلة بسلسلة من الروابط. وهذا ما يجعلها مفيدةً لتحديد الشبكات المترابطة الأكبر من اقترانات اللف المغزلي. وتتحقق هذه الإمكانية بإدخال سلسلة متكررة من النبضات التي تُحدث مزجًا متساوي الخواص خلال فترة المزج. وتؤدي فترات المزج المتساوي الخواص الأطول إلى انتشار الاستقطاب عبر عدد متزايد من الروابط. ^{[ 11 ]}

في حالة السكريات قليلة الوحدات، يُمثل كل جزء سكري نظام دوران مغزلي معزول، مما يُتيح التمييز بين جميع بروتونات جزء سكري مُحدد. كما يتوفر إصدار أحادي البعد من تقنية TOCSY، حيث يُمكن الكشف عن باقي نظام الدوران المغزلي من خلال تشعيع بروتون واحد. تشمل التطورات الحديثة في هذه التقنية تجربة TOCSY أحادية البعد مع مرشح انتقائي للإزاحة الكيميائية (CSSF)، والتي تُنتج أطيافًا عالية الجودة وتسمح باستخلاص ثوابت الاقتران بدقة واستخدامها للمساعدة في تحديد الكيمياء الفراغية.

يُطلق على تقنية TOCSY أحيانًا اسم "مطيافية هارتمان - هان المتجانسة" (HOHAHA). ^{[ 12 ]}

تُعدّ تقنية INADEQUATE ^{[ 13 ]} طريقةً شائعة الاستخدام للكشف عن اقترانات الكربون ^-13 بين ذرات الكربون المتجاورة. ونظرًا لأنّ وفرة الكربون ^-13 الطبيعية لا تتجاوز 1%، فإنّ 0.01% فقط من الجزيئات قيد الدراسة تحتوي على ذرتي الكربون ^-13 المتجاورتين اللازمتين للحصول على إشارة في هذه التجربة. مع ذلك، تُستخدم طرق اختيار الارتباط (على غرار تقنية DQF COSY) لمنع الإشارات الصادرة من ذرات الكربون ^{-13 المفردة، ما يُسهّل فصل إشارات الكربون -13} المزدوجة . يُعطي كل زوج من النوى المقترنة زوجًا من القمم على طيف INADEQUATE، حيث تتشارك كلتاهما نفس الإحداثي الرأسي، وهو مجموع الإزاحات الكيميائية للنوى؛ بينما يُمثّل الإحداثي الأفقي لكل قمة الإزاحة الكيميائية لكل نواة على حدة. ^{[ 14 ]}

تقنية التماسك الكمي الأحادي غير المتجانس (HSQC) هي تقنية رنين مغناطيسي نووي ثنائية الأبعاد تُستخدم للكشف عن التفاعلات بين أنواع مختلفة من النوى التي تفصل بينها رابطة واحدة، وخاصةً بين بروتون ( ^1H ) ونواة غير متجانسة مثل الكربون ( ^13C ) أو النيتروجين ( ^15N ). ^{[ 17 ]} تُعطي هذه الطريقة قمة واحدة لكل زوج من النوى المتصلة، حيث يُمثل إحداثياها الإزاحة الكيميائية للذرتين المتصلتين. ^{[ 18 ]}

تُسهم هذه الطريقة في توضيح البنية، لا سيما في تحليل المركبات العضوية والمنتجات الطبيعية والجزيئات الحيوية كالبروتينات والأحماض النووية. صُممت تقنية HSQC للكشف عن الارتباطات أحادية الرابطة بين البروتونات والذرات غير المتجانسة، مما يوفر فهمًا أعمق لترابط الهيدروجين والذرات غير المتجانسة من خلال نقل المغنطة.

تتضمن تجربة HSQC سلسلة من الخطوات لتوليد طيف رنين مغناطيسي نووي ثنائي الأبعاد. في البداية، تُثار العينة باستخدام نبضات ترددات راديوية، مما يؤدي إلى إثارة اللف المغزلي النووي وتهيئته لنقل المغنطة. ثم تُنقل المغنطة من البروتون إلى النواة غير المتجانسة عبر اقتران قياسي أحادي الرابطة (اقتران J)، مما يضمن مشاركة النوى المرتبطة مباشرةً فقط في عملية النقل. بعد ذلك، يتطور النظام خلال فترة زمنية تُسمى t1 _، وتُنقل المغنطة مرة أخرى من النواة غير المتجانسة إلى البروتون. تُكتشف الإشارة النهائية، التي تحمل معلومات كل من البروتون والنواة غير المتجانسة، ويُجرى تحويل فورييه لإنشاء طيف ثنائي الأبعاد يربط بين الإزاحات الكيميائية للبروتون والنواة غير المتجانسة.

تعمل تقنية HSQC عن طريق نقل المغنطة من نواة اليود (عادةً البروتون) إلى نواة الكبريت (عادةً الذرة غير المتجانسة) باستخدام تسلسل نبضات INEPT . تُجرى هذه الخطوة الأولى لأن البروتون يتمتع بمغنطة توازن أكبر، وبالتالي تُنتج هذه الخطوة إشارة أقوى. ثم تتطور المغنطة وتُنقل مرة أخرى إلى نواة اليود للملاحظة. يمكن بعد ذلك استخدام خطوة صدى دوران إضافية اختيارية لفصل الإشارة، مما يُبسط الطيف عن طريق دمج المضاعفات في قمة واحدة. تُزال الإشارات غير المرغوب فيها غير المقترنة بإجراء التجربة مرتين مع عكس طور نبضة محددة؛ هذا يعكس إشارات القمم المرغوبة دون غير المرغوبة، لذا فإن طرح الطيفين سيعطي القمم المرغوبة فقط. ^{[ 18 ]}

يعتمد تفسير طيف HSQC على رصد قمم التداخل، مما يشير إلى الترابط المباشر بين البروتونات والكربون أو النيتروجين. تتوافق كل قمة تداخل مع زوج محدد من البروتونات ^(1H - ^13C ) أو ^{البروتونات (1H} - ^15N )، مما يوفر تحديدًا مباشرًا لاتصال 1H-X، حيث X هي النواة غير المتجانسة ^{[ 17 ].} توفر تقنية HSQC العديد من المزايا، بما في ذلك تركيزها على الارتباطات أحادية الرابطة، وزيادة الحساسية نتيجة الكشف المباشر عن البروتونات، وتبسيط الأطياف المزدحمة من خلال فصل الإشارات المتداخلة والمساعدة في تحليل الجزيئات المعقدة.

تُعطي مطيافية الارتباط الكمي المتعدد غير المتجانس (HMQC) طيفًا مطابقًا لطيف مطيافية الارتباط الكمي المتعدد غير المتجانس (HSQC)، ولكن باستخدام طريقة مختلفة. تُعطي الطريقتان نتائج متقاربة الجودة للجزيئات الصغيرة والمتوسطة الحجم، ولكن تُعتبر مطيافية الارتباط الكمي المتعدد غير المتجانس (HSQC) أفضل للجزيئات الأكبر حجمًا. ^{[ 18 ]}

يكشف تحليل HMBC عن الارتباطات بين النوى المختلفة على نطاقات أطول تتراوح بين 2 و 4 روابط. تكمن صعوبة الكشف عن الارتباطات متعددة الروابط في أن تسلسلات HSQC وHMQC تتضمن فترة تأخير محددة بين النبضات، مما يسمح بالكشف فقط عن نطاق حول ثابت اقتران معين. لا يمثل هذا مشكلة بالنسبة لطرق الرابطة الواحدة، لأن ثوابت الاقتران تميل إلى أن تكون ضمن نطاق ضيق، لكن ثوابت اقتران الروابط المتعددة تغطي نطاقًا أوسع بكثير، ولا يمكن رصدها جميعًا في تجربة HSQC أو HMQC واحدة. ^{[ 19 ]}

في تقنية HMBC، تُتغلب على هذه الصعوبة بحذف أحد هذه التأخيرات من تسلسل HMQC. يؤدي ذلك إلى زيادة نطاق ثوابت الاقتران التي يمكن رصدها، ويقلل أيضًا من فقدان الإشارة الناتج عن الاسترخاء. لكن في المقابل، يُلغي هذا إمكانية فصل الطيف، ويُدخل تشوهات طورية في الإشارة. يوجد تعديل على طريقة HMBC يقوم بكبح إشارات الرابطة الواحدة، تاركًا فقط إشارات الروابط المتعددة. ^{[ 19 ]}

في تقنية NOESY، يُستخدم استرخاء أوفرهاوزر النووي المتبادل بين اللف المغزلي النووي خلال فترة المزج لتحديد الارتباطات. يشبه الطيف الناتج طيف COSY، حيث يحتوي على قمم قطرية وقمم متقاطعة، إلا أن القمم المتقاطعة تربط الرنينات من النوى المتقاربة مكانيًا بدلًا من تلك المرتبطة بروابط كيميائية. كما تحتوي أطياف NOESY على قمم محورية إضافية لا تُضيف معلومات جديدة، ويمكن التخلص منها من خلال تجربة مختلفة عن طريق عكس طور النبضة الأولى. ^{[ 20 ]}

أحد تطبيقات تقنية NOESY هو دراسة الجزيئات الحيوية الكبيرة، كما هو الحال في الرنين المغناطيسي النووي للبروتين ، حيث يمكن في كثير من الأحيان تحديد العلاقات باستخدام المشي المتسلسل.

يمكن إجراء تجربة NOESY أحادية البعد عن طريق اختيار رنينات محددة مسبقًا. تُقرأ الأطياف بحيث تُظهر النوى المختارة إشارة سالبة قوية، بينما تُحدد النوى المجاورة بإشارات موجبة أضعف. يكشف هذا فقط عن القمم التي لها تأثيرات NOE قابلة للقياس على الرنين المطلوب، ولكنه يستغرق وقتًا أقل بكثير من التجربة ثنائية الأبعاد الكاملة. بالإضافة إلى ذلك، إذا تغيرت بيئة نواة مختارة مسبقًا خلال الفترة الزمنية للتجربة، فقد تُلاحظ إشارات سالبة متعددة. يوفر هذا معلومات تبادلية مشابهة لطريقة EXSY (مطيافية التبادل) في الرنين النووي المغناطيسي.

تُعد تجارب NOESY أداة مهمة لتحديد الكيمياء الفراغية للجزيء في المذيب، بينما تُستخدم تقنية حيود الأشعة السينية على البلورة المفردة لتحديد الكيمياء الفراغية للجزيء في الحالة الصلبة.

في تقنية HOESY، كما هو الحال في تقنية NOESY، تُستخدم تقنية الاسترخاء المتبادل بين اللف المغزلي النووي. مع ذلك، يمكن لتقنية HOESY أن توفر معلومات حول نوى أخرى نشطة في الرنين المغناطيسي النووي بطريقة ذات صلة مكانية. تشمل الأمثلة أي نوى X{Y} أو X→Y مثل ^1H → ^13C ، و ¹⁹ F→ ^13C ، ^و31 P→ ^13C ، أو ^77Se → ^13C . عادةً ما ترصد التجارب تأثيرات NOE من البروتونات الموجودة على X، أو X{ ^1H }، ولكن ليس بالضرورة أن تشمل البروتونات. ^{[ 21 ]}

تُشبه تقنية ROESY تقنية NOESY، باستثناء اختلاف الحالة الابتدائية. فبدلاً من رصد الاسترخاء المتبادل من حالة ابتدائية للمغنطة في الاتجاه z ، تُدار المغنطة المتوازنة حول المحور x ، ثم تُثبّت دورانيًا بواسطة مجال مغناطيسي خارجي لمنعها من الدوران. تُفيد هذه الطريقة في دراسة جزيئات معينة يقع زمن ارتباطها الدوراني ضمن نطاق يكون فيه تأثير أوفرهاوزر النووي ضعيفًا جدًا بحيث لا يُمكن رصده، وعادةً ما تكون هذه الجزيئات ذات وزن جزيئي يبلغ حوالي 1000 دالتون ، وذلك لأن ROESY تُظهر اعتمادًا مختلفًا بين زمن الارتباط وثابت معدل الاسترخاء المتبادل. ففي NOESY، يتغير ثابت معدل الاسترخاء المتبادل من موجب إلى سالب مع ازدياد زمن الارتباط، مما يُعطي نطاقًا يكون فيه قريبًا من الصفر، بينما في ROESY يكون ثابت معدل الاسترخاء المتبادل موجبًا دائمًا. ^{[ 22 ] [ 23 ]}

يُطلق على تقنية ROESY أحيانًا اسم "الاسترخاء المتقاطع المناسب للجزيئات الصغيرة التي تحاكيها اللفات المقفلة" (CAMELSPIN). ^{[ 23 ]}