تقنية المصفوفات المتنوعة

📅 آخر تحديث: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

تقنية المصفوفات المتنوعة (DArT) هي تقنية عالية الإنتاجية للعلامات الجينية، قادرة على كشف الاختلافات الأليلية لتوفير تغطية جينومية شاملة دون الحاجة إلى معلومات تسلسل الحمض النووي، وذلك لأغراض التنميط الجيني والتحليلات الجينية الأخرى. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] تتضمن الخطوات العامة تقليل تعقيد الحمض النووي الجينومي باستخدام إنزيمات تقييد محددة ، واختيار أجزاء متنوعة لتمثيل الجينومات الأصلية، وتضخيمها عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وإدخال هذه الأجزاء في ناقل لوضعها كمجسات ضمن مصفوفة دقيقة ، ثم السماح للأهداف الفلورية من تسلسل مرجعي بالتهجين مع المجسات وإخضاعها لنظام تصوير. [ 1 ] [ 2 ] الهدف هو تحديد وقياس أشكال تعدد أشكال الحمض النووي المختلفة ضمن الحمض النووي الجينومي للأنواع التي تم أخذ عينات منها. [ 1 ]

تم الإبلاغ عن تقنية DArT لأول مرة عام 2001 من قبل داميان جاكود، وأندريه كيليان، وديفيد فاينشتاين، وكيمان بينغ، وقد أولت هذه التقنية أهمية بالغة لمزاياها الكبيرة مقارنةً بالطرق التقليدية الأخرى القائمة على البادئات، مثل القدرة على تحليل كميات كبيرة من عينات متنوعة باستخدام كمية قليلة من الحمض النووي الأولي. [ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] كما أنها تتميز بانخفاض تكلفتها وسرعة نتائجها مقارنةً بمصفوفات الحمض النووي الصلبة ذات الصلة التي تكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs). [ 1 ] [ 2 ] ومنذ ظهورها، أصبحت هذه التقنية أداةً رئيسيةً في تحليل النباتات متعددة الصيغ الصبغية ، وكذلك في بناء الخرائط الفيزيائية والوراثية لفهم العلاقات بين الأنواع بناءً على أوجه التشابه والاختلافات الأليلية بين جينوماتها. [ 1 ] [ 2 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 3 ]

تاريخ

طُوِّر هذا المفهوم لأول مرة على يد داميان جاكود، وأندريه كيليان، وديفيد فاينشتاين، وكيمان بينغ في عام 2001. [ 1 ] وكان هدفهم ابتكار تقنية للكشف عن تعدد أشكال الحمض النووي الجينومي وتحديد كميته، مما يزيد من الإنتاجية مقارنةً بالطرق التقليدية مثل تعدد أطوال القطع المضخمة (AFLP)، وتعدد أطوال قطع التقييد (RFLP)، وتكرارات التسلسل البسيط (SSR). [ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] كما سعوا إلى تقليل التكلفة والاعتماد على الجينومات المتسلسلة لتحديد تعدد الأشكال، وهو ما كان نتيجةً لاستخدام مصفوفات الحمض النووي الصلبة الثابتة في البداية، مثل رقائق الحمض النووي ، التي كانت تقتصر على تحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs). [ 1 ] [ 2 ] من النتائج الجانبية لاكتشافهم طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لتحليل الجينوم الكامل، أنها وفرت أيضًا تحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) بالإضافة إلى إدخالات وحذف وتحولات أزواج القواعد، وهو ما يمثل طبقة إضافية من التباين الأليلي بين الأنواع التي تم تحليلها. [ 1 ] [ 2 ]

اختار جاكود، وكيليان، وفينشتاين، وبينغ تسعة أنواع فرعية من الأرز كمصدر لتحليل الحمض النووي الجينومي وتعدد الأشكال الجينية. [ 1 ] تضمن التحليل الكشف عن وجود أو غياب تعدد أشكال الحمض النووي باستخدام مصفوفات مجسات، بالإضافة إلى قياس قوة كل إشارة، عبر التألق، داخل النوع الفرعي. بعد اختيار عينات الحمض النووي من العينات واستخراجها، تم هضم العينات بثلاثة إنزيمات تقييد محددة وربطها باستخدام إنزيم T4 ليغاز. بعد الربط في حمض نووي مزدوج السلاسل، تم تخفيف الخليط واستخراج كمية صغيرة منه لاستخدامها كقالب لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وُضعت النواتج في ناقل pCR2.1-TOPO، ثم نُقلت إلى بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) ، التي تم اختيارها بناءً على مقاومتها للأمبيسيلين وتصبغها الناتج عن تفاعل X-gal . [ 1 ] [ 2 ] يتم تضخيم الخلايا المستنسخة باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، ثم تنقيتها، وإدخالها في مصفوفة دقيقة. تم مزج الحمض النووي المرجعي والعينات مع أصباغ فلورية، Cy3 أو Cy5، ثم خُلطت، وخُضعت لعملية فصل السلاسل، وتُركت لتتزاوج لإعادة إدخالها في المصفوفة الدقيقة لمزيد من التحليل. أظهرت النتائج أن استخدام تقنية DArT مكّن من الكشف عن وجود أو غياب التعدد الشكلي بسرعة مقارنةً بتقنية RFLP، بالإضافة إلى تحديد كمية التعدد الشكلي المكتشف. [ 1 ] علاوة على ذلك، تمكنت تقنية DArT من تقليل كمية الحمض النووي الأولي المطلوبة لإجراء التحليل بشكل ملحوظ مقارنةً بالطرق الأخرى. [ 1 ]

إجراء

ينقسم اختبار DArT إلى ثلاث خطوات أساسية: تقليل التعقيد، والتمثيل الجينومي، واختبار DArT. [ 2 ]

تقليل التعقيد

تتناول هذه الخطوة من العملية اختزال الحمض النووي الجينومي المعقد والكبير لأنواع مختارة إلى مكونات مجزأة أصغر وأسهل في التعامل، وذلك باستخدام إنزيمات تقييد محددة. إضافةً إلى ذلك، تعتمد هذه الخطوة بشكل حصري على إنزيمات الهضم بدلاً من استخدام إنزيمات الهضم والبادئات، نظرًا لزيادة التعدد الشكلي الملحوظ في العينات المُحللة. [ 2 ] يُعد إنزيم Pst I من إنزيمات التقييد الشائعة الاستخدام في هذه الخطوة، نظرًا لتخصصه في الجينوم غير المتكرر وغير المُمَثْيَل للأنواع. [ 2 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]

التمثيل الجينومي

بعد تقليص حجم الحمض النووي الجينومي إلى حجم مناسب من الخطوة السابقة باستخدام إنزيم أو اثنين من إنزيمات التقييد المحددة، تتضمن الخطوة التالية اختيار الأجزاء التي تحتوي على أكبر قدر من التعدد الشكلي المهم عبر مجموعة الجينات . تُسمى هذه الأجزاء المختارة "تمثيلات" لأنها تمثل نسخًا مصغرة من الحمض النووي الجينومي الأصلي الأكبر حجمًا. من الضروري تجنب التسلسلات المتكررة عند اختيار الأجزاء لأنها ستُظهر أقل قدر من التعدد الشكلي ضمن الحمض النووي الجينومي المُحلل. [ 2 ]

اختبار DArT

تُربط التسلسلات المهضومة باستخدام إنزيم T4 ligase لإنتاج الحمض النووي المزدوج. تُخفف كمية صغيرة من الخليط المربوط ثم تُضخّم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). خلال تفاعل PCR، من المهم استخدام بادئات مكملة لمواقع قطع إنزيمات التقييد وإنزيم RedTaq polymerase، الذي نادرًا ما يُثبط. يُخلط الناتج في تمثيل لمجموعة الجينات المُضخّمة ويُربط بالناقل pCR2.1-TOPO. بعد إدخال التمثيل في الناقل، يُنقل الناقل إلى خلايا الإشريكية القولونية عن طريق الصدمة الكهربائية أو الوسائل الكيميائية. تُحضن الخلايا ويُختار بناءً على مقاومة الأمبيسيلين والتصبغ الأبيض من جين بيتا-جالاكتوزيداز غير النشط في وسط يحتوي على X-gal. [ 1 ] [ 2 ] تُضخّم الإدخالات بعد ذلك باستخدام تفاعل PCR وتُدخل كنقاط في شريحة مصفوفة دقيقة. تُفصل الشرائح بالطرد المركزي لعزل الإدخالات، والتي تُنقى بعد ذلك.

تُضاف أصباغ فلورية، Cy3 أو Cy5، إلى أهداف المصفوفة الدقيقة، وهي تمثيلات جينومية. بعد إضافة الصبغة الفلورية، تُضاف الأهداف إلى مجسات المصفوفة الدقيقة التي تحتوي على مستنسخات الإشريكية القولونية المُضخّمة ، حيث تتم عملية التمسخ والتهجين اللاحق، إن أمكن. بعد التهجين، تُغسل الشرائح وتُفحص باستخدام نظام تصوير يستهدف الإشارات الفلورية، وذلك باستخدام برنامج مفتوح المصدر يُسمى DArTsoft. تُستخدم التفاعلات والاختلافات بين المجس والأهداف المختلفة لإنشاء رسم بياني يُحدد ويُقيس عدة أشكال من تعدد أشكال الحمض النووي بين الجينومات المُحللة. [ 1 ] [ 2 ]

التطبيقات

التربية الجزيئية

تُعدّ القدرة على تحديد وقياس التباينات الأليلية بين الجينومات دون الحاجة إلى جينوم مُتسلسل ذات قيمة كبيرة لتقنية DArT، ولها آثار بالغة في مجال التربية الجزيئية . [ 1 ] [ 2 ] فمن خلال مقارنة المحاصيل ذات الأنماط الظاهرية، مثل زيادة إنتاجية المحاصيل أو مقاومتها لبعض الطفيليات البيئية، يُمكن ربط النمط الظاهري مباشرةً بتعدد أشكال الحمض النووي (DNA) المُحدد بين الأنواع ذات الصلة باستخدام تقنية DArT. كما تتفوق تقنية DArT على تقنيات التنميط الجيني الأخرى في حالة الكائنات متعددة الصيغ الصبغية، وذلك لغياب تنافس البادئات الموجود في التقنيات الأخرى. [ 2 ] وتنتشر الكائنات متعددة الصيغ الصبغية بين المحاصيل الزراعية الهامة. [ 2 ] فعلى سبيل المثال، استُخدمت تقنية DArT لإجراء تحليل على مستوى الجينوم بين أنواع الموز (Musa) ، بما في ذلك الموز الأخضر (Planata)، مما أدى إلى تطوير مخطط تصنيفي تطوري قائم على المؤشرات الجينية المُستمدة من تقنيات DArT. تُعزز هذه التطورات المعرفة في مجال التربية للحصول على غلة ومنتجات مرغوبة. [ 3 ]

يجري أيضاً دراسة التعرف السريع على المؤشرات الجينية المرتبطة بالجينات المسؤولة عن الأنماط الظاهرية في الحيوانات باستخدام تقنية DArT. [ 2 ] [ 10 ] وقد رُبطت مقاومة البعوض للمبيدات الحشرية بطفرات جينية محددة تُكسب أنواعاً معينة من البعوض مقاومةً دون غيرها. [ 10 ] وقد تم الكشف عن اختلافات جينية من خلال المؤشرات الجينية أثناء إجراء تحليل DArT على العينات ذات الصلة.

رسم الخرائط الجينومية

نظرًا لقدرة تقنية DArT على تحديد العلاقات الجينية بين الأنواع ضمن الميتاجينوم بطريقة سريعة ومنخفضة التكلفة، فقد أصبحت عنصرًا أساسيًا في تطوير الخرائط الفيزيائية والوراثية للأنواع وثيقة الصلة. [ 2 ] [ 8 ] في بداياتها، استُخدمت DArT لتطوير مخططات التفرع التطورية لأنواع الأرز الفرعية بناءً على وجود أو غياب أجزاء الحمض النووي في جينوم كل نوع. [ 1 ] وبالمثل، أُدمجت DArT في إنشاء الخرائط الجينية لنبات الرشاد (Arabidopsis thaliana) من خلال تطبيق نسخة آلية منها. [ 2 ] [ 9 ] يُعد القمح، وهو نبات سداسي الصبغيات، محصولًا آخر استفاد من تطبيق تحليل DArT، حيث تم إنشاء كروموسوم اصطناعي بكتيري (BAC) لأكبر كروموسوم، وهو 3B، من علامات تم الكشف عنها من خلال فحوصات DArT. [ 8 ] [ 11 ]

مراجع

  1. ١ ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ ٧ ٨ ٩ ١٠ ١١ ١٢ ١٣ ١٤ ١٥ ١٦ ١٧ ١٨ جاكود د ، بينغ ك، فاينشتاين د، كيليان أ (فبراير ٢٠٠١). "مصفوفات التنوع: تقنية الحالة الصلبة للتنميط الجيني المستقل عن معلومات التسلسل" . أبحاث الأحماض النووية . ٢٩ (٤): ٢٥هـ–٢٥. doi : 10.1093/nar / 29.4.e25 . PMC 29632. PMID 11160945 .  
  2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 كيليان أ ، وينزل ب ، هوتنر إ ، كارلينج ج ، شيا ل، بلوا هـ، وآخرون . (2012). "تقنية مصفوفات التنوع: تقنية عامة لتوصيف الجينوم على منصات مفتوحة". في بومبانون ف، بونين أ (محرران). إنتاج البيانات وتحليلها في علم جينوم السكان . مناهج في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 888. توتوا، نيوجيرسي: مطبعة هيومانا. الصفحات 67-89 . doi : 10.1007/978-1-61779-870-2_5 . ISBN    978-1-61779-870-2PMID 22665276. إنتاج البيانات وتحليلها في علم جينوم السكان: الأساليب والبروتوكولات 
  3. 1 2 3 ريستروتشي إيه إم، هيبوليت آي، بيريه إكس، شيا إل، كايج في، إيفرز إم، وآخرون (أكتوبر 2009). " تطوير وتقييم تقنية مصفوفات التنوع لتحليلات الحمض النووي عالية الإنتاجية في الموز". علم الوراثة النظري والتطبيقي . 119 (6): 1093-1103 . doi : 10.1007/s00122-009-1111-5 . PMID 19693484. S2CID 23747800 .   
  4. 1 2 فوس ب، هوغرز ر، بليكر م، ريجانز م، فان دي لي ت، هورنيس م، وآخرون . (نوفمبر 1995). "تقنية AFLP: تقنية جديدة لبصمة الحمض النووي" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 23 (21): 4407-4414 . doi : 10.1093/nar/23.21.4407 . PMC 307397. PMID 7501463 .   
  5. 1 2 ويبر جيه إل، ماي بي إي (مارس 1989). " فئة وفيرة من تعدد أشكال الحمض النووي البشري التي يمكن تحديد نمطها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل" . المجلة الأمريكية لعلم الوراثة البشرية . 44 (3): 388-396 . PMC 1715443. PMID 2916582 .  
  6. 1 2 رابينوفيتش، ب. د.، شوتز، ك.، ديدهيا، ن.، يوردان، س.، بارنيل، ل. د.، شتاين، ل.، وآخرون . (نوفمبر 1999). "المثيلة التفاضلية للجينات والعناصر المتنقلة الرجعية تُسهّل تسلسل جينوم الذرة بتقنية التسلسل العشوائي". علم الوراثة الطبيعية . 23 (3): 305-308 . doi : 10.1038/15479 . PMID 10545948. S2CID 19943394 .   
  7. 1 2 وينزل، ب.، كارلينج، ج.، كودرنا، د.، جاكود، د.، هوتنر، إ.، كلاينهوفس، أ.، كيليان، أ. (يونيو 2004). "تقنية مصفوفات التنوع (DArT) لتحليل الجينوم الكامل للشعير" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 101 (26): 9915-9920 . Bibcode : 2004PNAS..101.9915W . doi : 10.1073/pnas.0401076101 . PMC 470773. PMID 15192146 .  
  8. 1 2 3 4 أكبري م، وينزل ب، كايج ف، كارلينج ج، شيا ل، يانغ س، وآخرون . (نوفمبر 2006). " تقنية مصفوفات التنوع (DArT) للتحليل عالي الإنتاجية لجينوم القمح السداسي الصبغي". علم الوراثة النظري والتطبيقي . 113 (8): 1409-1420 . doi : 10.1007/s00122-006-0365-4 . PMID 17033786. S2CID 12636193 .   
  9. 1 2 ويتنبرغ إيه إتش، فان دير لي تي، كايلا سي، كيليان إيه، فيسر آر جي، شوتين إتش جيه (أغسطس 2005). "التحقق من صحة تقنية الواسمات عالية الإنتاجية DArT باستخدام نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا النموذجي". علم الوراثة الجزيئية وعلم الجينوم . 274 (1): 30-39 . doi : 10.1007/s00438-005-1145-6 . PMID 15937704. S2CID 34817585 .  
  10. 1 2 بونين أ، باريس م، ديبريس ل، تيتريو ج، ديفيد جيه بي، كيليان أ (أكتوبر 2008). "طريقة لتحديد النمط الجيني تعتمد على MITE للكشف عن مئات من تعدد أشكال الحمض النووي في جينوم حيواني بعد بضعة أجيال من الانتقاء الاصطناعي" . BMC Genomics . 9 (1): 459. doi : 10.1186/1471-2164-9-459 . PMC 2579443. PMID 18837997 .  
  11. ↑ Paux E, Sourdille P, Salse J, Saintenac C, Choulet F, Leroy P, et al. (أكتوبر 2008). "خريطة فيزيائية لكروموسوم القمح 3B الذي يبلغ طوله 1 جيجابايت". مجلة ساينس . 322 (5898): 101-104 . Bibcode : 2008Sci...322..101P . doi : 10.1126/science.1161847 . PMID 18832645. S2CID 27686615 .