تعدد أشكال طول شظايا التقييد
في علم الأحياء الجزيئي ، تعد تعدد أشكال طول شظايا التقييد ( RFLP ) تقنية تستغل الاختلافات في تسلسلات الحمض النووي المتماثلة ، والمعروفة باسم تعدد الأشكال أو السكان أو الأنواع أو لتحديد مواقع الجينات داخل التسلسل. قد يشير المصطلح إلى تعدد الأشكال نفسه، كما تم اكتشافه من خلال المواقع المختلفة لمواقع إنزيم التقييد ، أو إلى تقنية معملية ذات صلة يمكن من خلالها توضيح مثل هذه الاختلافات. في تحليل RFLP ، يتم هضم عينة الحمض النووي إلى شظايا بواسطة إنزيم تقييد واحد أو أكثر ، ثم يتم فصل شظايا التقييد الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وفقًا لحجمها.
لقد أصبح تحليل RFLP عتيقًا إلى حد كبير الآن بسبب ظهور تقنيات تسلسل الحمض النووي غير المكلفة ، لكنه كان أول تقنية لتحليل الحمض النووي غير مكلفة بما يكفي لرؤية تطبيق واسع النطاق. كان تحليل RFLP أداة مبكرة مهمة في رسم خرائط الجينوم ، وتحديد مواقع الجينات للاضطرابات الوراثية ، وتحديد خطر الإصابة بالأمراض، واختبار الأبوة .
تحليل RFLP
تتضمن التقنية الأساسية للكشف عن RFLPs تجزئة عينة من الحمض النووي بتطبيق إنزيم تقييد ، والذي يمكنه شق جزيء الحمض النووي بشكل انتقائي أينما يتم التعرف على تسلسل قصير ومحدد في عملية تُعرف باسم هضم التقييد . ثم يتم فصل شظايا الحمض النووي التي ينتجها الهضم حسب الطول من خلال عملية تُعرف باسم كهربي هلام الأجار ونقلها إلى غشاء عبر إجراء لطخة ساوثرن . يحدد تهجين الغشاء بمسبار الحمض النووي المسمى بعد ذلك طول الشظايا المكملة للمسبار . يقال إن تعدد أشكال طول شظايا التقييد يحدث عندما يختلف طول الشظية المكتشفة بين الأفراد، مما يشير إلى تشابهات تسلسل غير متطابقة. يُعتبر طول كل شظية أليلًا ، سواء كان يحتوي بالفعل على منطقة ترميز أم لا، ويمكن استخدامه في التحليل الجيني اللاحق.
أمثلة
هناك آليتان شائعتان يمكن من خلالهما تغيير حجم جزء تقييد معين. في الرسم التخطيطي الأول، يتم اكتشاف جزء صغير من الجينوم بواسطة مسبار الحمض النووي (خط أكثر سمكًا). في الأليل A ، يتم شق الجينوم بواسطة إنزيم تقييد في ثلاثة مواقع قريبة (مثلثات)، ولكن سيتم اكتشاف الجزء الأيمن فقط بواسطة المسبار. في الأليل a ، فقد موقع التقييد 2 بسبب طفرة ، لذلك يكتشف المسبار الآن الجزء المندمج الأكبر الذي يمتد من المواقع 1 إلى 3. يوضح الرسم التخطيطي الثاني كيف سيبدو هذا الاختلاف في حجم الجزء على لطخة ساوثرن، وكيف يمكن توريث كل أليل (اثنان لكل فرد) في أفراد العائلة.
في الرسم التخطيطي الثالث، يتم اختيار المجس وإنزيم القيد للكشف عن منطقة من الجينوم تتضمن جزءًا من تكرار مترادف ذي عدد متغير (VNTR) (مربعات في الرسم التخطيطي). في الأليل c ، يوجد خمسة تكرارات في VNTR، ويكتشف المجس جزءًا أطول بين موقعي القيد. في الأليل d ، يوجد تكراران فقط في VNTR ، لذلك يكتشف المجس جزءًا أقصر بين نفس موقعي القيد. يمكن أن تؤدي العمليات الجينية الأخرى، مثل الإدراجات والحذف والانتقالات والانعكاسات ، أيضًا إلى تعدد الأشكال. تتطلب اختبارات RFLP عينات أكبر بكثير من الحمض النووي مقارنة باختبارات التكرار المترادف القصير (STR).
التطبيقات
كان تحليل تباين RFLP في الجينومات في السابق أداة حيوية في رسم خرائط الجينوم وتحليل الأمراض الوراثية. إذا كان الباحثون يحاولون في البداية تحديد الموقع الكروموسومي لجين مرض معين، فإنهم سيحللون الحمض النووي لأفراد الأسرة المصابة بالمرض، ويبحثون عن أليلات RFLP التي تظهر نمطًا مشابهًا للوراثة مثل المرض (انظر الارتباط الوراثي ). بمجرد تحديد جين المرض، يمكن لتحليل RFLP للعائلات الأخرى الكشف عن الأشخاص المعرضين لخطر المرض، أو من المحتمل أن يكونوا حاملين للجينات الطافرة. يستخدم اختبار RFLP في تحديد الكائنات الحية وتمييزها عن طريق تحليل الأنماط الفريدة في الجينوم. كما يستخدم في تحديد معدل إعادة التركيب في المواضع بين مواقع القيد.
كان تحليل RFLP أيضًا الأساس للطرق المبكرة للبصمة الوراثية ، والتي كانت مفيدة في تحديد العينات المسترجعة من مسرح الجريمة ، وفي تحديد الأبوة ، وفي تحديد التنوع الجيني أو أنماط التكاثر في مجموعات الحيوانات.
البدائل
ومع ذلك، فإن تقنية تحليل RFLP بطيئة ومرهقة. فهي تتطلب كمية كبيرة من عينة الحمض النووي، ويمكن أن تستغرق العملية المشتركة لوضع العلامات على المسبار وتفتيت الحمض النووي والرحلان الكهربائي والتنشيف والتهجين والغسيل والتصوير الشعاعي الذاتي ما يصل إلى شهر حتى تكتمل. تم الإبلاغ عن نسخة محدودة من طريقة RFLP التي استخدمت مجسات الأوليجونوكليوتيد في عام 1985. [1] لقد حلت نتائج مشروع الجينوم البشري إلى حد كبير محل الحاجة إلى رسم خرائط RFLP، كما حل تحديد العديد من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) في هذا المشروع (بالإضافة إلى التحديد المباشر للعديد من جينات الأمراض والطفرات) محل الحاجة إلى تحليل ارتباط المرض RFLP (انظر تحديد النمط الجيني لـ SNP ). يستمر تحليل أليلات VNTR، ولكن يتم إجراؤه الآن عادةً عن طريق طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). على سبيل المثال، تتضمن البروتوكولات القياسية لبصمة الحمض النووي تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل لألواح تضم أكثر من اثني عشر تعدد أشكال النوكليوتيد المفرد.
لا يزال RFLP مستخدمًا في الاختيار بمساعدة العلامات. تعد تعدد أشكال طول شظايا التقييد الطرفية (TRFLP أو أحيانًا T-RFLP) تقنية تم تطويرها في البداية لتوصيف المجتمعات البكتيرية في عينات الأنواع المختلطة. كما تم تطبيق التقنية على مجموعات أخرى بما في ذلك فطريات التربة. تعمل TRFLP عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي باستخدام أزواج البادئات التي تم وضع علامات عليها بعلامات فلورية. ثم يتم هضم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام إنزيمات RFLP ويتم تصور الأنماط الناتجة باستخدام جهاز تسلسل الحمض النووي. يتم تحليل النتائج إما عن طريق العد والمقارنة بين النطاقات أو القمم في ملف تعريف TRFLP، أو عن طريق مطابقة النطاقات من تشغيل واحد أو أكثر من تشغيلات TRFLP بقاعدة بيانات للأنواع المعروفة. تم تطوير عدد من أدوات البرمجيات المختلفة لأتمتة عملية مطابقة النطاقات والمقارنة وقاعدة البيانات لملفات تعريف TRFLP. [2]
تتشابه هذه التقنية في بعض جوانبها مع تقنية التدرج الحراري أو التدرج الحراري للهلام (TGGE و DGGE).
يمكن أيضًا تحليل التغييرات التسلسلية المرتبطة بشكل مباشر بـ RFLP بشكل أسرع بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن توجيه التضخيم عبر موقع القيد المتغير، ويتم هضم المنتجات باستخدام إنزيم القيد. وقد أطلق على هذه الطريقة اسم تسلسل متعدد الأشكال مضخم مشقوق (CAPS). بدلاً من ذلك، يمكن تحليل الجزء المضخم بواسطة مجسات أوليجونوكليوتيدات محددة للأليل (ASO)، وهي عملية يمكن إجراؤها غالبًا بواسطة لطخة نقطية بسيطة .
انظر أيضا
مراجع
- ^ سايكي، ر.؛ شارف، س؛ فالونا، ف؛ موليس، ك.؛ هورن، ج.؛ إيرليتش، هـ.؛ أرنهايم، ن (1985). "التضخيم الأنزيمي لتسلسلات جينوم بيتا غلوبين وتحليل موقع القيد لتشخيص فقر الدم المنجلي". ساينس . 230 (4732): 1350-1354. رمز Bibcode :1985Sci...230.1350S. doi :10.1126/science.2999980. ISSN 0036-8075. PMID 2999980.
- ^ Heras, J.; Dominguez, C.; Mata, E.; Pascual, V.; Lozano, C.; Torres, C.; Zarazaga, M. (2015-03-29). "دراسة استقصائية لأدوات تحليل بصمات الحمض النووي". Briefings in Bioinformatics . 17 (6): 903–911. doi :10.1093/bib/bbv016. ISSN 1467-5463. PMID 25825453.
روابط خارجية
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml
علم الوراثة الجزيئي : الطرق الرئيسية للدراسة | |
|---|---|
| تجريبي | |
| المعلوماتية الحيوية |
|
| |
