GUIDE-Seq

📅 آخر تحديث: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

تقنية GUIDE-Seq ( التحديد الشامل وغير المتحيز لكسور الحمض النووي المزدوجة باستخدام التسلسل ) هي تقنية بيولوجيا جزيئية تتيح الكشف غير المتحيز في المختبر عن أحداث تعديل الجينوم غير المستهدفة في الحمض النووي الناتجة عن تقنية CRISPR/Cas9، بالإضافة إلى النيوكليازات الأخرى الموجهة بالحمض النووي الريبي في الخلايا الحية. [ 1 ] على غرار تقنية LAM-PCR، تستخدم هذه التقنية تفاعلات البلمرة المتسلسلة المتعددة لتضخيم المناطق المستهدفة التي تحتوي على قطعة جينية محددة تندمج بشكل تفضيلي في كسور الحمض النووي المزدوجة. ونظرًا لأن العلاج الجيني مجال ناشئ، فقد اكتسبت تقنية GUIDE-Seq رواجًا كطريقة منخفضة التكلفة للكشف عن التأثيرات غير المستهدفة للعلاجات المحتملة دون الحاجة إلى تسلسل الجينوم الكامل .

مبادئ

صُممت تقنية GUIDE-Seq للعمل بالتزامن مع منصات التسلسل الجيني من الجيل التالي، مثل تسلسل Illumina باستخدام الصبغات ، وتعتمد على دمج جزيء أوليغوديوكسي نيوكليوتيد مزدوج السلسلة (dsODN) ذي نهايات غير لاصقة، مُفسفر على رابطتين فوسفاتيتين في الطرف 5' لكلا السلسلتين. [ 1 ] يندمج جزيء dsODN في أي موقع في الجينوم يحتوي على كسر مزدوج السلسلة (DSB). [ 1 ] هذا يعني أنه بالإضافة إلى المواقع المستهدفة وغير المستهدفة التي قد تنشأ نتيجة لنشاط النيوكلياز، سيندمج جزيء dsODN أيضًا في أي مواقع زائفة في الجينوم تحتوي على كسر مزدوج السلسلة. [ 1 ] لذا، من الضروري وجود شرط خاص بجزيء dsODN فقط للتحكم في الكسور المزدوجة السلسلة العرضية والطبيعية، وهو شرط أساسي لاستخدام برنامج GUIDE-Seq المعلوماتي الحيوي. [ 1 ]

بعد دمج كاسيت dsODN، يُستخلص الحمض النووي الجينومي (gDNA) من مزرعة الخلايا ويُقطع إلى أجزاء بطول 500 زوج قاعدي باستخدام الموجات فوق الصوتية . يخضع الحمض النووي الجينومي المقطع الناتج لإصلاح الأطراف وربط المحولات. بعد ذلك، يُضخّم الحمض النووي الذي يحتوي تحديدًا على إدخال dsODN عبر جولتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أحادي الاتجاه، بدءًا من البادئات المكملة لـ dsODN. تتيح هذه العملية قراءة التسلسلات المجاورة، سواءً السلسلة الموجبة أو السالبة، المحيطة بالإدخال. المنتج النهائي عبارة عن مجموعة من المضخمات، تصف توزيع انقطاعات الحمض النووي المزدوجة، وتحتوي على مؤشرات لتمييز العينات، ومحولات خلايا التدفق p5 وp7 من Illumina، والتسلسلات المحيطة بكاسيت dsODN. [ 1 ]

يُمكن لتقنية GUIDE-Seq الكشف عن كسور الحمض النووي المزدوجة النادرة التي تحدث بنسبة 0.1%، إلا أن هذا قد يكون نتيجةً لقيود منصات التسلسل من الجيل التالي . فكلما زاد عمق القراءات التي يُمكن للجهاز تحقيقها، كان اكتشافه للأحداث النادرة أفضل. [ 1 ] إضافةً إلى ذلك، تستطيع GUIDE-Seq الكشف عن مواقع لا تتنبأ بها الطرق الحاسوبية، والتي غالبًا ما تتنبأ بالمواقع بناءً على تشابه التسلسل ونسبة عدم التطابق. [ 1 ] وقد سُجّلت حالات لم تكتشف فيها GUIDE-Seq أي أهداف جانبية لبعض جزيئات الحمض النووي الريبوزي الدليلية، مما يُشير إلى أن بعض النيوكليازات الموجهة بالحمض النووي الريبوزي قد لا يكون لها أهداف جانبية مرتبطة بها. [ 1 ] [ 2 ] وقد استُخدمت GUIDE-Seq لإثبات أن المتغيرات المُهندسة من Cas9 يُمكن أن تُقلل من التأثيرات الجانبية. [ 3 ]

محاذير

أظهرت الدراسات أن تقنية GUIDE-Seq قد لا ترصد بعض المواقع غير المستهدفة، مقارنةً بتقنية DIGENOME-Seq لتسلسل الجينوم الكامل، وذلك بسبب طبيعة استهدافها. [ 4 ] ومن الملاحظات الأخرى أن GUIDE-Seq قد تُنتج مواقع غير مستهدفة مختلفة قليلاً باختلاف سلالة الخلية. [ 1 ] قد يعود ذلك إلى اختلاف الأصول الجينية الأبوية لسلالات الخلايا، أو وجود طفرات خاصة بكل سلالة، أو، في حالة بعض سلالات الخلايا الخالدة مثل K562، وجود اختلال في عدد الكروموسومات. وهذا يُشير إلى أهمية اختبار الباحثين لسلالات خلوية متعددة للتحقق من فعالية ودقة هذه التقنية. [ 5 ] لا يُمكن استخدام GUIDE-Seq لتحديد المواقع غير المستهدفة في الجسم الحي .

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 تساي، شينغدار كيو؛ تشنغ، زونغلي؛ نغوين، نهو تي؛ ليبرز، ماثيو؛ توبكار، فيد في؛ ثابار، فيشال؛ ويفيكينز، نيكولاس؛ خايتر، سيد؛ إيافرات، أ. جون؛ لي، لونغ بي؛ أري، مارتن جيه؛ جونغ، جيه. كيث (فبراير 2015). "تقنية GUIDE-seq تُمكّن من تحديد خصائص الجينوم الكامل للانقسام غير المستهدف بواسطة نوكليازات CRISPR-Cas" . مجلة Nature Biotechnology . 33 (2): 187-197 . doi : 10.1038/nbt.3117 . PMC 4320685. PMID 25513782 .  
  2. ↑ أكاكايا، بينار؛ بكرة، ماجي L.؛ قوه جيمي أ. مالاجون لوبيز، خوسيه؛ كليمنت، كيندل؛ جارسيا، سارة ب. الزملاء، ميك د.؛ بوريت، ميشيل ج. فيرث، مايك أ. كاريراس، ألبا؛ باتسيجا، تانيا؛ سيليجر، فرانك. بجورسيل، ميكائيل. تساي، شينغدار س؛ نجوين، نهو T.؛ نيتش، روبرتو؛ ماير، لورينز م. بينيلو، لوكا؛ بهلولي، محمد؛ اريي، مارتن J .؛ ماريسكا، مارسيلو؛ جونغ، جيه. كيث (12 سبتمبر 2018). "تحرير كريسبر في الجسم الحي مع عدم وجود طفرات خارج نطاق الجينوم يمكن اكتشافها" . طبيعة . 561 (7723): 416– 419. Bibcode : 2018Natur.561..416A . doi : 10.1038/ s41586-018-0500-9 . PMC 6194229. PMID 30209390 .  
  3. ↑ كلاينستايفر، بنجامين ب.؛ باتاناياك، فيكرام؛ بريو، ميشيل س.؛ تساي، شينغدار كيو.؛ نغوين، نهو ت.؛ تشنغ، زونغلي؛ جونغ، ج. كيث (يناير 2016). "نوكليازات CRISPR-Cas9 عالية الدقة بدون تأثيرات جانبية قابلة للكشف على مستوى الجينوم" . نيتشر . 529 ( 7587): 490-495 . Bibcode : 2016Natur.529..490K . doi : 10.1038/nature16526 . PMC 4851738. PMID 26735016 .  
  4. ↑ كيم، دايسيك؛ كيم، سوجونغ؛ كيم، سونغهيون؛ بارك، جيونغبين؛ كيم، جين-سو (مارس 2016). " الكشف عن الخصائص المستهدفة على مستوى الجينوم لإنزيمات CRISPR-Cas9 النووية من خلال تسلسل الجينوم المتعدد" . أبحاث الجينوم . 26 (3): 406-415 . doi : 10.1101/gr.199588.115 . PMC 4772022. PMID 26786045 .  
  5. ↑ ألبرتس، بروس (2014). البيولوجيا الجزيئية للخلية ( الطبعة السادسة). جارلاند ساينس.