تسلسل صبغة Illumina

بعد تنقية الحمض النووي من عينة جينومية أو توليد الحمض النووي المكمل (cDNA)، يجب تحويله إلى مكتبة من الشظايا، تُعرف بالمكتبة الجينومية ، والتي يمكن تسلسلها لاحقًا باستخدام الجهاز. تتضمن هذه العملية عادةً خطوتين رئيسيتين: تجزئة الحمض النووي ، وإصلاح الأطراف وربط المحولات. هناك طريقتان لتجزئة المكتبة الجينومية: المعالجة بالموجات فوق الصوتية والتجزئة الجزئية . في التجزئة الجزئية، تقوم إنزيمات النقل المعدلة بتقطيع الحمض النووي عشوائيًا إلى شظايا يتراوح طولها بين 50 و500 زوج قاعدي، مع إضافة المحولات في الوقت نفسه. ^{[ 6 ]} يمكن أيضًا توليد مكتبة جينية باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية لتجزئة الحمض النووي الجينومي إلى أحجام متقاربة باستخدام الموجات فوق الصوتية. بعد ذلك، تُربط محولات متخصصة بالطرفين الأيمن والأيسر للشظايا باستخدام بوليميراز الحمض النووي T7 وليغاز الحمض النووي T4 . تُزال الخيوط التي لم تُربط بها المحولات بالغسل. ^{[ 7 ]}

تحتوي المحولات على ثلاثة أجزاء مختلفة: التسلسل المكمل للدعامة الصلبة (أوليغونوكليوتيدات على خلية التدفق)، وتسلسل الباركود (الفهارس)، وموقع ارتباط بادئ التسلسل. ^{[ 6 ]} عادةً ما يكون طول الفهارس ستة أزواج قاعدية، وتُستخدم أثناء تحليل تسلسل الحمض النووي لتحديد العينات. تسمح الفهارس بتشغيل ما يصل إلى 96 عينة مختلفة معًا، وهو ما يُعرف أيضًا باسم التعدد . أثناء التحليل، يقوم الحاسوب بتجميع جميع القراءات التي لها نفس الفهرس معًا. ^{[ 8 ] [ 9 ]} تستخدم شركة Illumina نهج "التسلسل بالتخليق". ^{[ 9 ]} تتم هذه العملية داخل خلية تدفق زجاجية مطلية بالأكريلاميد. ^{[ 10 ]} تحتوي خلية التدفق على أوليغونوكليوتيدات (تسلسلات نيوكليوتيدية قصيرة) تغطي قاع الخلية، وتعمل هذه الأوليغونوكليوتيدات كدعامة صلبة لتثبيت خيوط الحمض النووي في مكانها أثناء التسلسل. عند غسل الحمض النووي المجزأ فوق خلية التدفق، يرتبط المحول المناسب بالدعامة الصلبة المكملة.

بمجرد الارتباط، تبدأ عملية تكوين التجمعات. الهدف هو إنشاء مئات من خيوط الحمض النووي المتطابقة. بعضها سيكون الخيط الأمامي، والباقي سيكون الخيط العكسي. لهذا السبب تُستخدم محولات يمين ويسار. تُولّد التجمعات من خلال تضخيم الجسر. يتحرك إنزيم بوليميراز الحمض النووي على طول خيط الحمض النووي، مُنشئًا خيطه المُكمّل. يُزال الخيط الأصلي، ولا يتبقى سوى الخيط العكسي. يوجد في أعلى الخيط العكسي تسلسل محول. ينحني خيط الحمض النووي ويرتبط بالأوليغونوكليوتيد المُكمّل لتسلسل المحول العلوي. يرتبط إنزيم البوليميراز بالخيط العكسي، ويتم تكوين خيطه المُكمّل (المطابق للخيط الأصلي). يُفصل الحمض النووي المزدوج الآن بحيث يمكن لكل خيط أن يرتبط بشكل منفصل بتسلسل أوليغونوكليوتيد مُثبّت على خلية التدفق. سيكون أحدهما هو الخيط العكسي، والآخر هو الخيط الأمامي. تُسمى هذه العملية بتضخيم الجسر، وتحدث لآلاف التجمعات في جميع أنحاء خلية التدفق في وقت واحد. ^{[ 11 ]}

تنحني خيوط الحمض النووي وتلتصق بالدعامة الصلبة مرارًا وتكرارًا. يقوم إنزيم بوليميراز الحمض النووي بتخليق خيط جديد لتكوين قطعة مزدوجة الخيوط، ثم يتم فصلها بحيث تكون جميع خيوط الحمض النووي في منطقة واحدة من مصدر واحد (التضخيم الاستنساخي). يُعد التضخيم الاستنساخي مهمًا لأغراض مراقبة الجودة. إذا وُجد أن أحد الخيوط يحتوي على تسلسل غير طبيعي، فيمكن للعلماء فحص الخيط العكسي للتأكد من احتوائه على التسلسل المكمل لنفس التسلسل غير الطبيعي. يعمل الخيطان الأمامي والخلفي كضوابط للحماية من الشوائب. نظرًا لأن تسلسل Illumina يستخدم إنزيم بوليميراز الحمض النووي، فقد لوحظت أخطاء استبدال القواعد، ^{[ 12 ]} خاصةً عند الطرف 3'. ^{[ 13 ]} يمكن لقراءات الأطراف المزدوجة، بالإضافة إلى توليد العناقيد، تأكيد حدوث خطأ. يجب أن يكون الخيطان الأمامي والخلفي متكاملين، ويجب أن تتطابق جميع قراءات الخيط العكسي، وجميع قراءات الخيط الأمامي. إذا لم تكن القراءة متشابهة بدرجة كافية مع نظيراتها (التي من المفترض أن تكون نسخة طبق الأصل منها)، فقد يكون حدث خطأ. وقد تم استخدام حد أدنى للتشابه بنسبة 97% في تحليلات بعض المختبرات. ^{[ 13 ]}

في نهاية عملية التضخيم الاستنساخي، تُقطع جميع السلاسل العكسية عند الفهرس 2 باستخدام إنزيم تقييد ^{[ 14 ]} ، ثم تُغسل من خلية التدفق، تاركةً السلاسل الأمامية فقط. يرتبط البادئ بموقع ارتباط بادئ المحول في السلاسل الأمامية، ويضيف البوليميراز نيوكليوتيدًا ثلاثي الفوسفات (dNTP) موسومًا بصبغة فلورية إلى سلسلة الحمض النووي. لا يمكن إضافة سوى قاعدة واحدة في كل دورة نظرًا لأن الصبغة الفلورية تعمل كمجموعة حجب؛ ومع ذلك، فإن مجموعة الحجب قابلة للعكس ^{[ 6 ]} . باستخدام تقنية الألوان الأربعة، تُصدر كل قاعدة من القواعد الأربع لونًا مميزًا (A=أحمر، G=أزرق، T=أخضر، C=أصفر) ^{[ 15 ]} ، وبعد كل دورة، يسجل الجهاز القاعدة المضافة. بمجرد تسجيل اللون، تُغسل الصبغة الفلورية، ثم يُغسل نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات آخر فوق خلية التدفق، وتُكرر العملية.

بدأت شركة Illumina، مع إطلاق جهاز NextSeq ثم جهاز MiniSeq، بتقديم تقنية تسلسل جديدة ثنائية اللون. يتم تمييز النيوكليوتيدات إما بأحد لونين (أحمر أو أخضر)، أو بدون لون ("أسود")، أو بمزيج من اللونين (يظهر باللون البرتقالي كمزيج بين الأحمر والأخضر).

بعد قراءة شريط الحمض النووي، يُغسل الشريط المُضاف حديثًا. ثم يرتبط البادئ الأول، ويُبلمر تسلسل البادئ الأول، ويُغسل مرة أخرى. يُشكل الشريط جسرًا مجددًا، ويرتبط الطرف 3' لشريط الحمض النووي بجزيء أوليغونوكليوتيد على خلية التدفق. يرتبط البادئ الثاني، ويُبلمر التسلسل، ويُغسل.

يقوم إنزيم البوليميراز بتسلسل السلسلة المكملة فوق السلسلة المقوسة. ثم تنفصل السلسلتان، ويُحجب الطرف 3' لكل منهما. تُقطع السلسلة الأمامية عند الموقع المحدد، وتُزال بالغسل، وتتكرر عملية التسلسل بالتخليق للسلسلة العكسية.

تُجرى عملية التسلسل لملايين المجموعات في آنٍ واحد، وتحتوي كل مجموعة على ما يقارب 1000 نسخة متطابقة من قطعة الحمض النووي المُدرجة. ^{[ 12 ]} تُحلل بيانات التسلسل من خلال إيجاد أجزاء ذات مناطق متداخلة، تُسمى القطع المتجاورة ، ومحاذاتها. إذا كان التسلسل المرجعي معروفًا، تُقارن القطع المتجاورة به لتحديد المتغيرات.

تتيح هذه العملية التدريجية للعلماء رؤية التسلسل الكامل حتى في حال عدم تشغيل تسلسل غير مجزأ؛ ومع ذلك، نظرًا لأن أطوال قراءات Illumina ليست طويلة جدًا ^{[ 13 ]} (يمكن لتسلسل HiSeq إنتاج قراءات بطول 90 زوجًا قاعديًا تقريبًا ^{[ 8 ]} )، فقد يكون من الصعب تحديد مناطق التكرارات الترادفية القصيرة. ^{[ 8 ] [ 12 ]} كذلك، إذا كان التسلسل جديدًا تمامًا (de novo) ولم يكن هناك مرجع، فقد تُسبب المناطق المتكررة صعوبة كبيرة في تجميع التسلسل . ^{[ 12 ]} تشمل الصعوبات الإضافية استبدال القواعد (خاصةً في الطرف 3' للقراءات ^{[ 13 ]} ) بواسطة بوليميرازات غير دقيقة، والتسلسلات الكيميرية، وانحياز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وكلها عوامل قد تُساهم في توليد تسلسل غير صحيح. ^{[ 13 ]}