التركيز الكهربائي المتساوي

التركيز الكهربائي المتساوي ( IEF )، المعروف أيضًا بالتركيز الكهربائي ، هو تقنية لفصل الجزيئات ذات الشحنات المختلفة بناءً على اختلافات نقطة التعادل الكهربائي (pI). ^{[ 1 ] [ 2 ]} وهو نوع من أنواع الفصل الكهربائي النطاقي، يُجرى عادةً على البروتينات في هلام ، ويستفيد من حقيقة أن الشحنة الكلية على الجزيء المراد دراسته، أي كثافة الشحنة الصافية ، هي دالة لدرجة حموضة الوسط المحيط به. ^{[ 3 ]}

تتضمن تقنية الفصل الكهربائي متساوي البؤر (IEF) إضافة محلول أمفوليت إلى هلامات ذات تدرج حموضة ثابت (IPG). تتكون هلامات IPG من مصفوفة هلامية من الأكريلاميد متشابكة مع تدرج الحموضة، مما ينتج عنه تدرجات حموضة مستقرة تمامًا باستثناء القيم القلوية العالية جدًا (>12). يُحصل على تدرج الحموضة الثابت من خلال التغيير المستمر في نسبة المواد غير المتحركة (immobilines ). المادة غير المتحركة هي حمض أو قاعدة ضعيفة تُحدد قيمتها pK.

البروتين الموجود في منطقة حموضة أقل من نقطة التعادل الكهربائي (pI) يكون موجب الشحنة، وبالتالي يهاجر نحو المهبط (القطب السالب). ومع ذلك، أثناء هجرته عبر تدرج حموضة متزايد، تتناقص شحنة البروتين الكلية حتى يصل إلى منطقة الحموضة التي تُطابق نقطة التعادل الكهربائي الخاصة به. عند هذه النقطة، يصبح البروتين بلا شحنة صافية، فتتوقف هجرته (لعدم وجود تجاذب كهربائي نحو أي من القطبين). ونتيجة لذلك، تتركز البروتينات في نطاقات ثابتة حادة، حيث يتموضع كل بروتين عند نقطة في تدرج الحموضة تُطابق نقطة التعادل الكهربائي الخاصة به. تتميز هذه التقنية بدقة عالية للغاية، حيث يتم فصل البروتينات التي تختلف في شحنة واحدة إلى نطاقات منفصلة.

تُوزَّع الجزيئات المراد تركيزها على وسط ذي تدرج في الرقم الهيدروجيني (يُنشأ عادةً بواسطة الأمفوليتات الأليفاتية ). يُمرَّر تيار كهربائي عبر هذا الوسط، مُشكِّلاً قطبًا موجبًا ( أنود ) وقطبًا سالبًا (كاثود) . تهاجر الجزيئات سالبة الشحنة عبر تدرج الرقم الهيدروجيني في الوسط باتجاه القطب الموجب، بينما تتحرك الجزيئات موجبة الشحنة باتجاه القطب السالب. عندما يتحرك الجزيء باتجاه القطب المقابل لشحنته، فإنه يتحرك عبر تدرج الرقم الهيدروجيني المتغير حتى يصل إلى نقطة التعادل الكهربائي (pH). عند هذه النقطة، يفقد الجزيء شحنته الكهربائية الصافية (نتيجةً لبروتنة أو إزالة بروتونات المجموعات الوظيفية المرتبطة به)، وبالتالي يتوقف عن الحركة داخل الهلام. يُنشأ التدرج قبل إضافة الجزيئات المراد دراستها، وذلك بتعريض محلول من جزيئات صغيرة، مثل البولي أمفوليتات ذات قيم pI متفاوتة، لعملية الفصل الكهربائي.

تُستخدم هذه الطريقة بكثرة في دراسة البروتينات ، حيث تُفصل البروتينات بناءً على محتواها النسبي من الأحماض الأمينية الحمضية والقاعدية ، والتي يُمثلها الرقم الهيدروجيني المتساوي (pI). تُوضع البروتينات في هلام مُثبَّت ذي تدرج في الرقم الهيدروجيني، مُكوَّن من بولي أكريلاميد أو نشا أو أجاروز، حيث تم إنشاء تدرج في الرقم الهيدروجيني. تُستخدم عادةً هلامات ذات مسام كبيرة في هذه العملية للتخلص من أي تأثيرات "غربلة"، أو أي تشوهات في قيمة الرقم الهيدروجيني المتساوي ناتجة عن اختلاف معدلات هجرة البروتينات ذات الأحجام المختلفة. يُمكن للتركيز الكهربائي المتساوي فصل البروتينات التي تختلف في قيمة الرقم الهيدروجيني المتساوي بمقدار 0.01 فقط. ^{[ 4 ]} يُعد التركيز الكهربائي المتساوي الخطوة الأولى في الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد ، حيث تُفصل البروتينات أولاً حسب قيمة الرقم الهيدروجيني المتساوي، ثم تُفصل لاحقًا حسب الوزن الجزيئي باستخدام تقنية SDS-PAGE . من ناحية أخرى، يُعد التركيز الكهربائي المتساوي الخطوة الوحيدة في الفصل الكهربائي التحضيري الأصلي (PAGE) عند رقم هيدروجيني ثابت. ^{[ 5 ]}

بحسب بعض الآراء ^{[ 6 ] [ 7 ]،} تقوم الخلايا حقيقية النواة الحية بتركيز البروتينات داخلها عند نقطة التعادل الكهربائي للتغلب على محدودية معدل التفاعلات الأيضية الناتجة عن انتشار الإنزيمات ومتفاعلاتها، ولتنظيم معدل عمليات كيميائية حيوية محددة. فمن خلال تركيز إنزيمات مسارات أيضية معينة في مناطق صغيرة ومحددة داخل الخلية، تستطيع زيادة معدل هذه المسارات الكيميائية الحيوية عدة مراتب. كما تستطيع الخلية، عبر تعديل نقطة التعادل الكهربائي (pI) لجزيئات الإنزيم، على سبيل المثال، عن طريق الفسفرة أو إزالة الفسفرة، نقل جزيئات الإنزيم بين أجزاء مختلفة من داخلها، لتفعيل أو تعطيل عمليات كيميائية حيوية محددة.

يُعد الفصل الكهربائي القائم على الرقائق الدقيقة بديلاً واعداً للفصل الكهربائي الشعري لأنه يتمتع بالقدرة على توفير تحليل سريع للبروتين، وتكامل مباشر مع عمليات وحدة الموائع الدقيقة الأخرى، والكشف عن القناة بأكملها، وأغشية النيتروسليلوز، وأحجام عينات أصغر وتكاليف تصنيع أقل.

أدى ازدياد الطلب على أدوات فصل البروتينات الأسرع والأسهل استخدامًا إلى تسريع تطور تقنية الفصل الكهربائي متساوي التركيز (IEF) نحو الفصل في المحلول. في هذا السياق، طُوّر نظام IEF متعدد الوصلات لإجراء عمليات فصل سريعة وخالية من الهلام. يستخدم هذا النظام سلسلة من الأوعية، يمر عبر كل منها أنبوب شعري. ^{[ 8 ]} يُستبدل جزء من الأنبوب الشعري في كل وعاء بغشاء شبه نفاذ. تحتوي الأوعية على محاليل منظمة ذات قيم أس هيدروجيني مختلفة، مما يُنشئ تدرجًا فعالًا في الأس الهيدروجيني داخل الأنبوب الشعري. يتصل المحلول المنظم في كل وعاء كهربائيًا بمقسم جهد موصول بمصدر طاقة عالي الجهد، مما يُنشئ مجالًا كهربائيًا على طول الأنبوب الشعري. عند حقن عينة (مزيج من الببتيدات أو البروتينات) في الأنبوب الشعري، يعمل وجود المجال الكهربائي وتدرج الأس الهيدروجيني على فصل هذه الجزيئات وفقًا لنقاطها متساوية الكهربائية. تم استخدام نظام IEF متعدد الوصلات لفصل مخاليط الببتيدات التريبسينية لعلم البروتينات ثنائي الأبعاد ^{[ 9 ]} وبروتينات بلازما الدم من مرضى الزهايمر لاكتشاف المؤشرات الحيوية. ^{[ 8 ]}