المجهر متعدد البؤر

المجهر متعدد البؤر ( MUM )، المعروف أيضًا باسم المجهر متعدد المستويات أو المجهر متعدد البؤر ، هو نوع من أنواع المجهر الضوئي يسمح بتتبع الديناميكيات ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية بدقة زمنية ومكانية عالية من خلال تصوير مستويات بؤرية مختلفة داخل العينة في آنٍ واحد. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]} في هذه الطريقة، يُقسّم الضوء المُجمّع من العينة بواسطة عدسة موضوعية مُصحّحة إلى ما لا نهاية إلى مسارين. ^{[ 5 ]} في كل مسار، يُركّز الضوء المُقسّم على كاشف موضوع على مسافة مُعايرة مُحدّدة من عدسة الأنبوب. وبهذه الطريقة، يُصوّر كل كاشف مستوىً مُختلفًا داخل العينة. كان أول جهاز MUM مُطوّر قادرًا على تصوير مستويين مُختلفين داخل العينة. ومع ذلك، يُمكن تعديل الجهاز لتصوير أكثر من مستويين عن طريق تقسيم الضوء في كل مسار ضوئي وتركيزه على كواشف موضوعة على مسافات مُعايرة مُحدّدة. وقد تم تحسينه لاحقًا لتصوير ما يصل إلى أربعة مستويات مُختلفة. ^{[ 6 ] [ 7 ]} لتصوير عدد أكبر من المستويات البؤرية، طُوّرت تقنيات أبسط تعتمد على بصريات تقسيم الصورة. ومن الأمثلة على ذلك استخدام موشور تقسيم صورة مُخصّص، قادر على التقاط ما يصل إلى 8 مستويات بؤرية باستخدام كاميرتين فقط. ^{[ 8 ]} والأفضل من ذلك، يمكن استخدام مقسمات الحزم الجزئية القياسية الجاهزة لإنشاء ما يُسمى بموشور تقسيم z، الذي يسمح بالتصوير المتزامن لـ 9 مستويات بؤرية فردية باستخدام كاميرا واحدة. ^{[ 9 ] [ 10 ]} وهناك تقنية أخرى تُسمى المجهر متعدد البؤر (MFM) تستخدم بصريات فورييه الحيودية لتصوير ما يصل إلى 25 مستوى بؤري. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

يُعدّ المجهر الفلوري للخلايا الحية أداةً رئيسيةً في دراسة عمليات النقل الخلوي. يُناسب تصميم المجهر التقليدي تصوير الديناميكيات الخلوية السريعة ثنائية الأبعاد، أي في مستوى التركيز. مع ذلك، تُعتبر الخلايا أجسامًا ثلاثية الأبعاد، وعادةً لا تقتصر مسارات النقل داخلها على مستوى بؤري واحد. إذا لم تقتصر الديناميكيات على مستوى بؤري واحد، فإن تقنية المجهر أحادي المستوى التقليدية غير كافية لإجراء دراسات تفصيلية للديناميكيات الخلوية السريعة ثلاثية الأبعاد. غالبًا ما تكون الأساليب التقليدية القائمة على تغيير مستوى التركيز غير فعّالة في مثل هذه الحالات، نظرًا لبطء أجهزة التركيز نسبيًا مقارنةً بالعديد من الديناميكيات الخلوية. إضافةً إلى ذلك، قد يكون مستوى التركيز في غير موضعه أو في غير وقته، ما يؤدي إلى تفويت جوانب مهمة من الأحداث الديناميكية.

أثارت تقنيات المجهر الحديثة اهتمامًا كبيرًا بدراسة العمليات الخلوية على مستوى الجزيء الواحد. تتغلب تجارب الجزيء الواحد على تأثيرات المتوسطات، وبالتالي توفر معلومات لا يمكن الحصول عليها باستخدام الدراسات التقليدية الشاملة. مع ذلك، يطرح تحديد موقع الجزيئات المفردة وتتبعها ثلاثي الأبعاد عدة تحديات. فبالإضافة إلى إمكانية التقاط صور للجزيء المفرد أثناء خضوعه لديناميكيات ثلاثية الأبعاد قد تكون بالغة التعقيد، يبرز التساؤل حول إمكانية تحديد موقعه ثلاثي الأبعاد، ومدى دقة هذا التحديد.

يُعدّ ضعف تمييز العمق في المجهر القياسي عائقًا رئيسيًا أمام تقدير الموقع ثلاثي الأبعاد بدقة عالية. ^{[ 15 ]} فحتى مع استخدام عدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية ، لا تتغير صورة المصدر النقطي في المجهر التقليدي بشكل ملحوظ إذا تم تحريكه بضع مئات من النانومترات من موضع بؤرته. وهذا ما يجعل تحديد الموضع المحوري (أي الموضع z) للمصدر النقطي باستخدام المجهر التقليدي أمرًا بالغ الصعوبة.

بشكل عام، يطرح التصوير المجهري الكمي للجزيئات المفردة للعينات ثلاثية الأبعاد نفس المشكلة سواءً كان التطبيق هو تحديد الموقع/التتبع أو التصوير المجهري فائق الدقة مثل PALM وSTORM وFPALM وdSTORM للتطبيقات ثلاثية الأبعاد، أي تحديد موقع جزيء مفرد في ثلاثة أبعاد. ^{[ 16 ]} يوفر التصوير المجهري للجزيئات المفردة (MUM) العديد من المزايا. ^{[ 17 ]} في MUM، يتم الحصول على صور المصدر النقطي في وقت واحد عند مستويات تركيز مختلفة. توفر هذه الصور معلومات إضافية يمكن استخدامها لتقييد موضع المصدر النقطي على المحور z. تتغلب هذه المعلومات التقييدية إلى حد كبير على مشكلة تمييز العمق بالقرب من التركيز.

يوفر مقياس التحديد ثلاثي الأبعاد مؤشرًا كميًا لمدى دقة تحديد موقع المصدر النقطي  . تشير القيمة العددية الصغيرة لهذا المقياس إلى دقة عالية جدًا في تحديد الموقع، بينما تشير القيمة العددية الكبيرة إلى دقة منخفضة جدًا. في المجهر التقليدي، عندما يكون المصدر النقطي قريبًا من مستوى التركيز، مثلًا z0 ≤ 250 نانومتر، يتوقع مقياس التحديد ثلاثي الأبعاد دقة منخفضة جدًا في تقدير موضع z. لذا، في المجهر التقليدي، يصبح تتبع الموقع ثلاثي الأبعاد صعبًا عندما يكون المصدر النقطي قريبًا من مستوى التركيز.

من جهة أخرى، في إعداد مجهر متعدد المستويات ثنائي الأبعاد، يُظهر مقياس تحديد الموقع ثلاثي الأبعاد دقةً أفضل باستمرار من المجهر التقليدي ضمن نطاق واسع من قيم z، لا سيما عندما يكون مصدر النقطة قريبًا من مستوى التركيز. ومن النتائج المباشرة لهذه النتيجة إمكانية تحديد موقع مصدر النقطة على المحور z بدقة مماثلة تقريبًا ضمن نطاق واسع من قيم z، وهو أمرٌ مفيد لتتبع الجسيمات المفردة ثلاثي الأبعاد .

في تطبيقات تصوير الجسيمات المفردة، يلعب عدد الفوتونات المكتشفة من العلامة الفلورية دورًا حاسمًا في التحليل الكمي للبيانات المُكتسبة. حاليًا، تُجرى تجارب تتبع الجسيمات عادةً باستخدام مجهر مقلوب أو قائم، حيث تُضيء عدسة موضوعية واحدة العينة وتجمع إشارة الفلورة منها. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من انبعاث الفلورة من العينة في جميع الاتجاهات (أي أعلى العينة وأسفلها)، فإن استخدام عدسة موضوعية واحدة في هذه التكوينات المجهرية يؤدي إلى جمع الضوء من جانب واحد فقط من العينة. حتى مع استخدام عدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية، لا يمكن جمع جميع الفوتونات المنبعثة من جانب واحد من العينة نظرًا لزاوية التجميع المحدودة للعدسة الموضوعية. وبالتالي، حتى في ظل أفضل ظروف التصوير، لا تجمع المجاهر التقليدية سوى جزء ضئيل من الفوتونات المنبعثة من العينة.

لحل هذه المشكلة، يمكن استخدام تكوين مجهري يستخدم عدستين موضوعيتين متقابلتين، حيث تكون إحدى العدستين في وضع مقلوب والأخرى في وضع مستقيم. يُطلق على هذا التكوين اسم مجهر متعدد البؤر ثنائي العدسة (dMUM). ^{[ 18 ]}

• صفحة مختبر وارد أوبر على الإنترنت في المركز الطبي الجنوبي الغربي التابع لجامعة تكساس .
• الصفحة الرئيسية لأداة تحديد حد اليد
• الصفحة الرئيسية لأداة تصميم MUMDesignTool