المجهر فائق الدقة

توفر مجهرية النفق الضوئي (PTM) ^{[ 20 ]} تصويرًا فوريًا للمجال الكامل دون مسح ضوئي، بدقة جانبية دون طول موجي ودقة رأسية تصل إلى 1 نانومتر، كما أوضح جون إم. غيرا ^{[ 21 ]} . (تجدر الإشارة إلى الفرق بين PTM ومجهرية مسح النفق الضوئي (PSTM)، والتي هي في الأساس إعادة تسمية لمجهرية المسح الضوئي للمجال القريب (NSOM) التي تستغل المجال القريب من طرف ألياف بصرية حاد موضوع بالقرب من سطح العينة، عادةً في حدود بضعة نانومترات، بحيث عند مسح الألياف على طول سطح العينة، تتكون صورة).

توفر تقنية التصوير المجهري الضوئي (PTM) دقة مكانية دون الطول الموجي بفضل قدرتها على التقاط الضوء المنعكس عالي التردد المرتبط بالعينة وتحويله إلى ضوء منتشر لتكوين الصورة. ويُسهّل إدخال سطح العينة في المجال المتلاشي عند الطرف البعيد للمجهر بواسطة "محول طاقة" مرن مصنوع من بوليمر أو زجاج رقيق، يوضع بالقرب من العينة. ^{[ 22 ]} يتميز هذا المحول بمرونة كافية لتتبع المنحنيات الكبيرة على سطح العينة، مع توفير سطح مرجعي صلب ومستوٍ محليًا. وتقتصر الدقة الرأسية على الدقة الضوئية لكاشف المجال الكامل، ويمكن أن تصل إلى 1 نانومتر. وقد طُبقت هذه التقنية على عينات بيولوجية وعينات صلبة، مما أتاح فهمًا أعمق لبنية السطح والخصائص البصرية على المستوى النانوي.

في إطار تطوير هذا العمل عام ١٩٩٦، بيّن جون إم. غيرا أن الحصول على تضاريس جانبية فائقة الدقة، تفوق حتى ما يُحقق بتقنية PTM، يتم عن طريق تغيير طور المجال المتلاشي. عند انتشار الضوء، تكون مستويات الطور المتساوي موازية لمستويات السعة المتساوية، ما يُنتج دقة فائقة دون الطول الموجي على طول المحور الرأسي، كما هو الحال في مقاييس التداخل التي تنتجها شركتا WYKO وZYGO لقياس الأسطح البصرية. مع ذلك، فإن المجال المتلاشي غير متجانس، إذ تكون مستويات السعة المتساوية موازية لسطح العينة (وهذا ما يُفسر الدقة الرأسية العالية في تقنية PTM)، بينما تكون مستويات الطور المتساوية عمودية عليها وعلى السطح. وبالتالي، يُمكن لتغيير الطور الآن أن يُنتج دقة فائقة دون الطول الموجي على المحور الجانبي، تفوق حتى دقة تقنية PTM. رغم وجود طرق عديدة لإحداث هذا التحول الطوري، كما أوضح غيرا في عدة براءات اختراع أمريكية ^{[ 23 ]} مسجلة باسم شركة بولارويد ، فقد استخدم العرض التوضيحي الأول مُؤخِّر طور ومُستقطِب من شركة ميدولارك أوبتكس . وقد أدى طرح الصور المتتالية التي تم فيها تغيير الطور بمقدار صغير إلى تحسين الدقة. حصلت شركات داير إنرجي سيستمز، وكاليميتريكس، ونانوبتك على تراخيص استخدام هذه التقنية فائقة الدقة في تخزين البيانات البصرية والمجهر. في عام 2001، نشر غيرا، بالتعاون مع ديمتري فيزينوف ^{[ 24 ]} ، صورة كاملة الدقة لكرات قطرها 200 نانومتر، مُرتبة بشكل سداسي مُتراص، ومُضاءة بضوء طول موجته 650 نانومتر، بدقة 0.3 لامدا. ورغم أن هذه الدقة مُبهرة، إلا أن الدقة المُحتملة يُمكن أن تكون أعلى بكثير، إذ أنها محدودة فقط بمقدار التحول الطوري.

يُحقق المجهر الضوئي الماسح للمجال القريب بدون فتحة (ANSOM)، المعروف أيضًا باسم المجهر الضوئي الماسح للمجال القريب من نوع التشتت (s-SNOM)، تصويرًا فائق الدقة من خلال تعزيز المجال الضوئي محليًا بالقرب من طرف حاد، غالبًا ما يكون مصنوعًا من المعدن. في تقنية ANSOM، يتفاعل مسبار معدني أو عازل مع الضوء الساقط، مما يُنشئ مجالًا كهرومغناطيسيًا محصورًا ومعززًا عند قمة الطرف نتيجةً لرنين البلازمون السطحي الموضعي .

يمكن للهوائيات النانوية البصرية أن تُحسّن الدقة بشكلٍ أكبر من خلال عملها كمُرنّات تُركّز الضوء في أحجام نانوية، مما يُعزّز قوة المجال المحلي وحساسيته. صُمّمت هذه الهوائيات النانوية للرنين عند ترددات بصرية مُحدّدة، وتُستخدم في كلٍ من وضعَي الإضاءة والكشف لتحقيق دقة مكانية أقل بكثير من حدّ الانعراج.

يُعدّ مجهر رسم الخرائط البصرية العشوائية للمجال القريب (NORM) طريقةً لاكتساب المجال البصري القريب بواسطة مجهر المجال البعيد من خلال مراقبة الحركة البراونية للجسيمات النانوية في سائل غمر. ^{[ 25 ] [ 26 ]}

تستخدم تقنية NORM مسح سطح الجسم بتحريك الجسيمات النانوية عشوائيًا. تظهر الجسيمات النانوية من خلال المجهر على شكل بقع دائرية متناظرة. يُعادل عرض البقعة دالة انتشار النقطة (حوالي 250  نانومترًا) ويُحدد بدقة المجهر. يمكن تقييم الإحداثيات الجانبية للجسيم بدقة أعلى بكثير من دقة المجهر. من خلال جمع المعلومات من العديد من الإطارات، يمكن رسم خريطة لتوزيع شدة المجال القريب عبر مجال رؤية المجهر بالكامل. بالمقارنة مع تقنيتي NSOM وANSOM، لا تتطلب هذه الطريقة أي معدات خاصة لتحديد موضع رأس المجهر، وتتميز بمجال رؤية واسع وعمق بؤري كبير. بفضل العدد الكبير من "المستشعرات" الماسحة، يمكن الحصول على الصور في وقت أقصر.

يُعدّ مجهر 4Pi مجهرًا فلوريًا ماسحًا بالليزر يتميز بدقة محورية محسّنة. ويمكن تحسين القيمة النموذجية التي تتراوح بين 500 و700 نانومتر إلى 100-150 نانومتر، وهو ما يتوافق مع بقعة بؤرية كروية تقريبًا بحجم أصغر بمقدار 5-7 مرات من حجم بقعة المجهر متحد البؤر القياسي .  

يتحقق تحسين الدقة باستخدام عدستين موضوعيتين متقابلتين، يتم تركيز كلتيهما على نفس الموقع الهندسي. كما يتم تقليل الفرق في طول المسار البصري عبر كل عدسة موضوعية إلى أدنى حد ممكن. وبذلك، يمكن إضاءة الجزيئات الموجودة في منطقة التركيز المشتركة للعدستين بشكل متماسك من كلا الجانبين، ويمكن جمع الضوء المنعكس أو المنبعث بشكل متماسك، أي يصبح التراكب المتماسك للضوء المنبعث على الكاشف ممكنًا. الزاوية المجسمة$أوميغا$تزداد الطاقة المستخدمة للإضاءة والكشف، وتقترب من الحالة المثالية، حيث تتم إضاءة العينة والكشف عنها من جميع الجوانب في وقت واحد. ^{[ 27 ] [ 28 ]}

حتى الآن، تم تحقيق أفضل جودة في مجهر 4Pi بالاقتران مع مجهر STED في الخلايا المثبتة ^{[ 29 ]} ومجهر RESOLFT مع البروتينات القابلة للتبديل في الخلايا الحية. ^{[ 30 ]}

تعمل تقنية المجهرية ذات الإضاءة المهيكلة (SIM) على تحسين الدقة المكانية من خلال جمع المعلومات من فضاء التردد خارج المنطقة المرئية. تتم هذه العملية في الفضاء المتبادل: إذ يحتوي تحويل فورييه (FT) لصورة SI على معلومات إضافية متراكبة من مناطق مختلفة في الفضاء المتبادل؛ وباستخدام عدة إطارات يتم فيها إزاحة الإضاءة بمقدار طور معين ، يصبح من الممكن حسابيًا فصل وإعادة بناء صورة FT، التي تتميز بدقة أعلى بكثير. ويعيد تحويل فورييه العكسي الصورة المُعاد بناؤها إلى صورة فائقة الدقة.

قد يحلّ المجهر الضوئي ذو المسح المجهري (SIM) محلّ المجهر الإلكتروني كأداة في بعض التشخيصات الطبية. وتشمل هذه التشخيصات أمراض الكلى، ^{[ 31 ]} وسرطان الكلى، ^{[ 32 ]} وأمراض الدم. ^{[ 33 ]}

على الرغم من أن مصطلح "مجهر الإضاءة المنظمة" قد صاغه آخرون في سنوات لاحقة، إلا أن جون إم. غيرا (1995) كان أول من نشر نتائج ^{[ 34 ]} حيث  قام بتسليط ضوء مُنمَّط بواسطة محزز ذي خطوة 50 نانومتر على محزز ثانٍ  بنفس الخطوة، مع تدوير المحززين بالنسبة لبعضهما البعض بالزاوية اللازمة لتحقيق التكبير. وعلى الرغم من أن الطول الموجي للإضاءة كان 650  نانومتر، إلا أنه كان من السهل تمييز المحزز ذي خطوة 50  نانومتر. وقد أظهر هذا تحسنًا يقارب خمسة أضعاف عن حد دقة آبي البالغ 232  نانومتر، والذي كان من المفترض أن يكون أصغر حد يمكن الحصول عليه للفتحة العددية والطول الموجي المستخدمين.

• صور لنوى الخلايا ومراحل الانقسام الخلوي المسجلة باستخدام تقنية التصوير ثلاثي الأبعاد (3D-SIM).
• 
  المجهر متحد البؤر المقارن  – التصوير المجهري ثلاثي الأبعاد
• 
  نواة الخلية في الطور التمهيدي من زوايا مختلفة
• 
  نواتان لخلية فأر في الطور التمهيدي.
• 
  خلية فأر في الطور النهائي

يُعرف أحد تطبيقات الإضاءة المنظمة باسم الإضاءة المُعدَّلة مكانيًا (SMI). وكما هو الحال في الإضاءة المنظمة القياسية، تُعدِّل تقنية SMI دالة انتشار النقطة (PSF) للمجهر بطريقة مناسبة. ولكن في هذه الحالة، "لا يتم تحسين الدقة البصرية نفسها"؛ ^{[ 35 ]} بل تُستخدم الإضاءة المنظمة لزيادة دقة قياسات المسافة للأجسام المتألقة إلى أقصى حد، "لتمكين قياسات الحجم على مستوى الجزيئات التي تبلغ بضعة عشرات من النانومترات". ^{[ 35 ]}

يحقق مجهر Vertico SMI إضاءةً مُهيكلةً باستخدام شعاع ليزر واحد أو شعاعين متداخلين متعاكسين على طول المحور. ثم يُحرَّك الجسم المراد تصويره بخطوات عالية الدقة عبر مجال الموجة، أو يُحرَّك مجال الموجة نفسه بالنسبة للجسم عن طريق إزاحات الطور. ينتج عن ذلك تحسين في دقة الحجم المحوري والمسافة. ^{[ 35 ] [ 36 ] [ 37 ]}

يمكن دمج تقنية SMI مع تقنيات أخرى فائقة الدقة، مثل تقنية LIMON ثلاثية الأبعاد أو LSI- TIRF، وهي عبارة عن مقياس تداخل انعكاس داخلي كلي مع إضاءة مُهيكلة جانبيًا (هذا الجهاز والتقنية الأخيران هما في الأساس مجهر نفق فوتوني مُزاح الطور، يستخدم مجهرًا ضوئيًا للانعكاس الداخلي الكلي مع مجال متلاشٍ مُزاح الطور (جون إم. غيرا، 1996)). ^{[ 23 ]} تتيح تقنية SMI هذه الحصول على صور ضوئية لتوزيعات الفلوروفورات الذاتية في مقاطع من أنسجة العين البشرية بدقة بصرية غير مسبوقة.  يُمكّن استخدام ثلاثة أطوال موجية مختلفة للإثارة (488، 568، و647 نانومتر) من جمع معلومات طيفية حول إشارة التألق الذاتي . وقد استُخدمت هذه التقنية لفحص أنسجة العين البشرية المصابة بالتنكس البقعي . ^{[ 38 ]}

يُعدّ الاستشعار الحيويّ أساسيًا لفهم أنشطة المكونات الخلوية في بيولوجيا الخلية. وقد أحدثت المجسات المشفرة جينيًا نقلة نوعية في هذا المجال، وتتألف عادةً من جزأين: نطاق الاستشعار، الذي يكشف النشاط الخلوي أو التفاعلات، ونطاق الإبلاغ، الذي يُنتج إشارات قابلة للقياس. يوجد نوعان رئيسيان من المجسات: مجسات تعتمد على نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) باستخدام جزيئين فلوريين للقياس الكمي الدقيق، ولكن مع بعض القيود؛ ومجسات حيوية أحادية الجزيء الفلوري، وهي أصغر حجمًا وأسرع، وتتيح إجراء تجارب متعددة، ولكنها قد تواجه تحديات في الحصول على قيم مطلقة وكشف تشبع الاستجابة. وقد استُخدمت طرق مجهرية متنوعة، بما في ذلك تصوير التذبذب البصري فائق الدقة، لقياس ومراقبة الأنشطة البيولوجية في الوقت الحقيقي. ومن الأمثلة على ذلك استشعار الكالسيوم، ودرجة الحموضة، والجهد الكهربائي. ويُقدّم غرينوالد وآخرون نظرة عامة أكثر شمولًا لهذه التطبيقات. ^{[ 39 ]}

يستخدم مجهر استنزاف الانبعاث المحفز ( مجهر STED ) نبضتين ليزريتين: نبضة الإثارة لتحفيز جزيئات الفلوروفور إلى حالتها الفلورية، ونبضة STED لإزالة الإثارة عن طريق الانبعاث المحفز . ^{[ 19 ] [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] [ 48 ]} عمليًا، تُطبَّق نبضة ليزر الإثارة أولًا، ثم تتبعها نبضة STED مباشرةً (كما يُستخدم STED بدون نبضات باستخدام ليزرات الموجة المستمرة). علاوة على ذلك، تُعدَّل نبضة STED بحيث تحتوي على بقعة ذات شدة صفرية تتطابق مع بؤرة الإثارة. نظرًا لاعتماد معدل الانبعاث المحفز بشكل غير خطي على شدة شعاع STED، ستكون جميع جزيئات الفلوروفور المحيطة ببؤرة الإثارة في حالتها غير المتألقة (الحالة الأرضية لجزيئات الفلوروفور). ومن خلال مسح هذه البؤرة، يتم الحصول على الصورة. يمكن نظريًا ضغط العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لوظيفة انتشار النقطة (PSF) لبقعة الإثارة البؤرية إلى عرض تعسفي عن طريق زيادة شدة نبضة STED، وفقًا للمعادلة ( 1 ).

${\displaystyle \Delta r\approx {\frac {\Delta }{\sqrt {1+I_{\max }/I_{s}}}}}$   ( 1 )

حيث ∆r هي الدقة الجانبية، و∆ هي عرض نصف الارتفاع الأقصى لدالة انتشار النقطة المحدودة بالحيود، و I _max هي شدة الذروة لليزر STED، و${\displaystyle I_{s}}$هي شدة العتبة اللازمة لتحقيق استنفاد الانبعاثات المشبعة.

تتمثل العيوب الرئيسية لتقنية STED، والتي حالت دون انتشار استخدامها على نطاق واسع، في تعقيد أجهزتها. فمن جهة، تكون سرعة التقاط الصور بطيئة نسبيًا في مجالات الرؤية الواسعة نظرًا للحاجة إلى مسح العينة للحصول على الصورة. ومن جهة أخرى، يمكن أن تكون سريعة جدًا في مجالات الرؤية الضيقة، حيث سُجلت تسجيلات تصل إلى 80 إطارًا في الثانية. ^{[ 49 ] [ 50 ]} ونظرًا لقيمة I _{_s} العالية المرتبطة بتقنية STED، يلزم استخدام نبضة إثارة عالية الكثافة، مما قد يُلحق الضرر بالعينة.

تستخدم مجهرية استنزاف الحالة الأرضية (مجهرية GSD) الحالة الثلاثية للفلوروفور كحالة إيقاف، والحالة المفردة كحالة تشغيل، حيث يُستخدم ليزر إثارة لدفع الفلوروفورات الموجودة على محيط جزيء الحالة المفردة إلى الحالة الثلاثية. وهذا يشبه إلى حد كبير تقنية STED، حيث تكون حالة الإيقاف هي الحالة الأرضية للفلوروفورات، ولهذا السبب تنطبق المعادلة ( 1 ) أيضًا في هذه الحالة.${\displaystyle I_{s}}$تكون القيمة أصغر من تلك الموجودة في تقنية STED، مما يجعل التصوير فائق الدقة ممكنًا عند شدة ليزر أقل بكثير. ومع ذلك، بالمقارنة مع تقنية STED، فإن الفلوروفورات المستخدمة في تقنية GSD تكون عمومًا أقل استقرارًا ضوئيًا؛ وقد يكون من الصعب تحقيق تشبع الحالة الثلاثية. ^{[ 51 ]}

تستغل تقنية المجهرية ذات الإضاءة المهيكلة المشبعة (SSIM) العلاقة غير الخطية بين معدل انبعاث الفلوروفورات وشدة ليزر الإثارة. ^{[ 52 ]} بتطبيق نمط إضاءة جيبي ^{[ 53 ]} بشدة ذروة قريبة من تلك اللازمة لتشبع الفلوروفورات في حالتها الفلورية، نحصل على أهداب موير. تحتوي هذه الأهداب على معلومات مكانية عالية الدقة يمكن استخلاصها بتقنيات حسابية. بعد استخلاص هذه المعلومات، نحصل على صورة فائقة الدقة.

تتطلب تقنية SSIM تغيير نمط الإضاءة عدة مرات، مما يحد فعلياً من الدقة الزمنية لهذه التقنية. إضافةً إلى ذلك، ثمة حاجة إلى مواد فلورية شديدة الثبات الضوئي، نظراً لظروف التشبع التي تُلحق ضرراً إشعاعياً بالعينة، مما يحد من التطبيقات الممكنة لتقنية SSIM.

تظهر أمثلة على هذا المجهر تحت قسم المجهر ذو الإضاءة المهيكلة (SIM) : صور لنوى الخلايا ومراحل الانقسام الخلوي المسجلة باستخدام مجهر 3D-SIM.

تُلخص تقنية المجهرية لتحديد موقع الجزيئات المفردة (SMLM) جميع التقنيات المجهرية التي تحقق دقة فائقة من خلال عزل الباعثات ومطابقة صورها مع دالة انتشار النقطة (PSF). عادةً،  يحد عرض دالة انتشار النقطة (حوالي 250 نانومتر) من الدقة. مع ذلك، عند وجود باعث معزول، يُمكن تحديد موقعه بدقة لا يحدها سوى شدة إضاءته وفقًا للمعادلة ( 2 ). ^{[ 54 ]}

${\displaystyle \Delta \mathrm {loc} \approx {\frac {\Delta }{\sqrt {N}}}}$   ( 2 )

حيث Δloc هي دقة تحديد الموقع، وΔ هي FWHM (العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى) لـ PSF وN هو عدد الفوتونات التي تم جمعها.

لا يمكن إجراء عملية المطابقة هذه بشكل موثوق إلا مع البواعث المنفردة (انظر: فك الالتفاف )، وتكون العينات البيولوجية المهمة مُوسومة بكثافة عالية بالبواعث، ما يجعل المطابقة مستحيلة عندما تكون جميع البواعث نشطة في الوقت نفسه. تحل تقنيات SMLM هذه المعضلة بتنشيط مجموعة فرعية قليلة من البواعث في الوقت نفسه، وتحديد مواقع هذه البواعث القليلة بدقة متناهية، ثم تعطيلها وتنشيط مجموعة فرعية أخرى.

مع الأخذ في الاعتبار الخلفية وتشويه الصورة بالكاميرا، وباستخدام تقريب غاوسي لدالة انتشار النقطة ( قرص إيري ) للمجهر النموذجي، تم اقتراح الدقة النظرية بواسطة طومسون وآخرون ^{[ 55 ]} وتم ضبطها بدقة بواسطة مورتنسن وآخرون: ^{[ 56 ]}

${\displaystyle \sigma ^{2}={\frac {\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12}{N_{sig}}}\left({\frac {16}{9}}+{\frac {8\pi N_{bg}(\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12)}{N_{sig}a^{2}}}\right)}$

أين

* σ هو الانحراف المعياري الغاوسي لمواقع مركز الجزيء نفسه عند قياسه عدة مرات (مثل إطارات الفيديو). (الوحدة: متر)

* σ _PSF هو الانحراف المعياري الغاوسي لدالة انتشار النقطة، والتي يتبع عرضها عند نصف الارتفاع الأقصى معادلة إرنست آبي d = λ/(2 NA) . (الوحدة متر)

* a هو حجم كل بكسل في الصورة. (الوحدة: م)

* N _sig هو عدد الفوتونات في دالة الانتشار النقطي الكلية على جميع وحدات البكسل محل الاهتمام. (بدون وحدة)

* N _bg هو متوسط ​​عدد الفوتونات الخلفية لكل بكسل (بعد إزالة الفوتونات المظلمة)، ويُقارب مربع الانحراف المعياري الغاوسي لضوضاء الخلفية لتوزيع بواسون لكل بكسل بمرور الوقت، أو الانحراف المعياري لجميع البكسلات مع ضوضاء الخلفية فقط، σ _bg ^2. كلما زادت قيمة σ _bg ² ، كان التقريب أفضل (على سبيل المثال، جيد عندما σ _bg ² > 10، وممتاز عندما σ _bg ² > 1000). (بدون وحدة)

* دقة FWHM هي ~2.355 ضعف الانحراف المعياري الغاوسي .

بشكل عام، تُجرى مجهرية التموضع باستخدام الفلوروفورات. تبقى الفلوروفورات المناسبة (مثل تلك المستخدمة في تقنية STORM) في حالة معتمة غير متألقة معظم الوقت، ويتم تنشيطها عشوائيًا، عادةً باستخدام ليزر إثارة منخفض الشدة. يحفز ليزر القراءة التألق، ثم يُزيل الفلوروفورات أو يُعيدها ضوئيًا إلى الحالة المعتمة، عادةً خلال 10-100 مللي ثانية. في تقنية تجميع النقاط للتصوير في التضاريس النانوية (PAINT)، تكون الفلوروفورات غير متألقة قبل الارتباط، ثم تصبح متألقة بعد ذلك. تُجمع الفوتونات المنبعثة خلال مرحلة التألق بواسطة كاميرا، ويمكن مطابقة الصورة الناتجة للفلوروفور (المشوهة بواسطة دالة انتشار النقطة) بدقة عالية جدًا، حتى في حدود بضعة أنغسترومات. ^{[ 57 ]} يضمن تكرار العملية عدة آلاف من المرات أن تمر جميع الفلوروفورات بالحالة المضيئة ويتم تسجيلها. ثم يقوم الحاسوب بإعادة بناء صورة فائقة الدقة.

لتحقيق أقصى دقة ممكنة، يجب أن تتميز الفلوروفورات المستخدمة في هذه الطرق بخصائص مرغوبة، وهي أن تكون ساطعة. أي أن يكون لها معامل امتصاص عالٍ وعائد كمي مرتفع . كما يجب أن تتمتع بنسبة تباين عالية (النسبة بين عدد الفوتونات المنبعثة في الحالة المضيئة وعدد الفوتونات المنبعثة في الحالة المظلمة). بالإضافة إلى ذلك، يُفضل استخدام عينة موسومة بكثافة عالية، وفقًا لمعايير نايكويست .

تختلف طرق المجهر الموضعي المتعددة في الغالب في نوع الفلوروفورات المستخدمة.

المجهر الطيفي الدقيق للمسافة (SPDM)

يمكن تحديد موقع مصدر ضوء صغير واحد بدقة أفضل بكثير مما تسمح به دقة المجهر عادةً: فعلى الرغم من أن الضوء سينتج بقعة ضبابية، إلا أنه يمكن استخدام خوارزميات الكمبيوتر لحساب مركز البقعة الضبابية بدقة، مع مراعاة دالة انتشار النقطة للمجهر، وخصائص الضوضاء للكاشف، وما إلى ذلك. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا ينجح عندما يكون هناك الكثير من المصادر القريبة من بعضها البعض: فعندها تتداخل جميع المصادر معًا.

يُعدّ مجهر المسافة الطيفي الدقيق (SPDM) مجموعة من تقنيات تحديد المواقع في مجهر التألق ، والتي تتغلب على مشكلة تعدد المصادر بقياس عدد قليل منها في كل مرة، بحيث يكون كل مصدر "معزولًا بصريًا" عن غيره (أي مفصولًا بمسافة أكبر من دقة المجهر، والتي تتراوح عادةً بين 200 و250  نانومترًا). ^{[ 78 ] [ 79 ] [ 80 ]} يتطلب هذا "العزل البصري" أن تمتلك الجسيمات قيد الفحص بصمات طيفية مختلفة، مما يسمح برؤية الضوء المنبعث من عدد قليل من الجزيئات في كل مرة باستخدام مصادر الضوء والمرشحات المناسبة. ويحقق هذا دقة بصرية فعالة أفضل بعدة مرات من الدقة البصرية التقليدية التي يُمثلها نصف عرض الذروة الرئيسية لدالة صورة النقطة الفعالة. ^{[ 78 ]}

يمكن التعبير عن الدقة الهيكلية التي يمكن تحقيقها باستخدام SPDM بدلالة أصغر مسافة قابلة للقياس بين جسيمين نقطيين ذوي خصائص طيفية مختلفة ("الدقة الطوبولوجية"). وقد أظهرت النمذجة أنه في ظل ظروف مناسبة تتعلق بدقة التموضع وكثافة الجسيمات، وما إلى ذلك، فإن "الدقة الطوبولوجية" تتوافق مع " تردد مكاني " يُعادل، وفقًا للتعريف الكلاسيكي، دقة بصرية محسّنة بشكل كبير. كما يمكن تمييز الجزيئات بطرق أكثر دقة بالاعتماد على عمر الفلورة وتقنيات أخرى. ^{[ 78 ]}

يُعدّ البحث في الجينوم (دراسة التنظيم الوظيفي للجينوم ) أحد التطبيقات المهمة . كما يُعدّ البحث في بنية الأغشية مجالاً مهماً آخر للاستخدام.

SPDMphymod

يُمكن استخدام مجهر التموضع للعديد من الأصباغ الفلورية القياسية ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP ) وأصباغ أليكسا فلور وجزيئات الفلورسين ، في حال توفر ظروف فيزيائية ضوئية معينة. وبفضل تقنية الفلوروفورات القابلة للتعديل الفيزيائي (SPDMphymod) ، يكفي استخدام طول موجي ليزري واحد ذي شدة مناسبة للتصوير النانوي ^{[ 81 ]،} على عكس تقنيات مجهر التموضع الأخرى التي تتطلب طولين موجيين ليزريين عند استخدام جزيئات فلورية خاصة قابلة للتحويل/التنشيط الضوئي. ومن الأمثلة الأخرى على استخدام SPDMphymod تحليل جزيئات فيروس تبرقش التبغ (TMV) ^{[ 82 ]} أو دراسة تفاعل الفيروس مع الخلية ^{[ 83 ] [ 84 ]} .

استنادًا إلى انتقالات الحالة المفردة-الثلاثية، يُعدّ استمرار هذه العملية أمرًا بالغ الأهمية لتقنية SPDMphymod، حيث يؤدي إلى دخول جزيء واحد أولًا في حالة مظلمة قابلة للانعكاس طويلة الأمد (بعمر نصف يصل إلى عدة ثوانٍ)، ثم يعود منها إلى حالة فلورية ينبعث منها العديد من الفوتونات لعدة أجزاء من الألف من الثانية، قبل أن يعود إلى حالة مظلمة طويلة الأمد تُعرف بالحالة غير القابلة للانعكاس. يستخدم مجهر SPDMphymod جزيئات فلورية تُصدر نفس التردد الطيفي للضوء، ولكن ببصمات طيفية مختلفة بناءً على خصائص الوميض. ومن خلال دمج ألفي صورة لنفس الخلية، يُمكن، باستخدام قياسات الليزر البصرية الدقيقة، تسجيل صور تحديد الموقع بدقة بصرية محسّنة بشكل ملحوظ. ^{[ 85 ]}

الأصباغ الفلورية القياسية المستخدمة بنجاح مع تقنية SPDMphymod هي GFP و RFP و YFP و Alexa 488 و Alexa 568 و Alexa 647 و Cy2 و Cy3 و Atto 488 والفلورسين .

تحديد الموقع البصري ثلاثي الأبعاد في درجات حرارة منخفضة للغاية (COLD)

التموضع البصري ثلاثي الأبعاد بالتبريد الفائق (COLD) هو أسلوب يسمح بتحديد مواقع متعددة للفلورة داخل جزيء حيوي صغير إلى متوسط ​​الحجم بدقة تصل إلى مستوى الأنجستروم. ^{[ 57 ]} وتتحسن دقة التموضع في هذا الأسلوب لأن التفاعلات الكيميائية الضوئية الأبطأ عند درجات الحرارة المنخفضة تؤدي إلى زيادة عدد الفوتونات التي يمكن أن تنبعث من كل فلوروفور قبل التلاشي الضوئي. ^{[ 86 ] [ 87 ]} وبالتالي، يحقق مجهر التموضع العشوائي بالتبريد الفائق الدقة دون الجزيئية اللازمة لتحديد المواقع ثلاثية الأبعاد لعدة فلوروفورات مرتبطة ببروتين صغير. وباستخدام خوارزميات معروفة من المجهر الإلكتروني، يُعاد بناء الإسقاطات ثنائية الأبعاد للفلوروفورات في تكوين ثلاثي الأبعاد. ويصل مجهر التموضع البصري ثلاثي الأبعاد بالتبريد الفائق (COLD) إلى أقصى حدوده الأساسية، وذلك اعتمادًا على حجم العلامة. ويمكن أيضًا دمج هذه الطريقة مع تقنيات البيولوجيا الهيكلية الأخرى - مثل علم البلورات بالأشعة السينية، وقياس الطيف بالرنين المغناطيسي، والمجهر الإلكتروني - لتوفير معلومات تكميلية قيّمة وخصوصية.

المجهر الموضعي المنشط بالربط (BALM)

يُعدّ المجهر الموضعي المُنشَّط بالارتباط (BALM) مفهومًا عامًا للمجهر الموضعي للجزيئات المفردة (SMLM): وهو تصوير فائق الدقة للأصباغ المرتبطة بالحمض النووي DNA، يعتمد على تعديل خصائص الحمض النووي DNA والصبغة. ^{[ 88 ]} من خلال الضبط الدقيق للبيئة الكيميائية - مما يؤدي إلى انصهار الحمض النووي DNA بشكل موضعي وعكسي، والتحكم في إشارة التألق عن طريق التهجين - يمكن إدخال جزيئات الصبغة المرتبطة بالحمض النووي DNA. يمكن استخدام أصباغ الحمض النووي DNA المتداخلة والمرتبطة بالأخدود الصغير لتسجيل وعزل عدد قليل فقط من إشارات الصبغة المرتبطة بالحمض النووي DNA بصريًا في كل مرة. وقد استُخدم المجهر الموضعي المُنشَّط بالارتباط المدعوم بتقلبات بنية الحمض النووي DNA (fBALM) لرصد الاختلافات النانوية في البنية النووية، بدقة هيكلية متوقعة تبلغ حوالي 50  نانومترًا. تصوير البنية النانوية للكروماتين باستخدام المجهر الموضعي المُنشَّط بالارتباط بناءً على تقلبات بنية الحمض النووي DNA. ^{[ 89 ]} في الآونة الأخيرة، تم استغلال التحسن الكبير في مردود الكم الفلوري لـ NIAD-4 عند ارتباطه بالأميلويد في تصوير ألياف الأميلويد ^{[ 90 ]} والقليلات ^{[ 91 ] باستخدام تقنية BALM.}

المجهر الموضعي بدون استخدام علامات

 يمكن تحقيق دقة بصرية للهياكل الخلوية في نطاق حوالي 50 نانومتر، حتى في الخلايا الخالية من العلامات، باستخدام مجهر التموضع SPDM .

باستخدام طولين موجيين مختلفين لليزر، يكشف SPDM عن الأجسام الخلوية التي لا يمكن اكتشافها في ظل ظروف التصوير التقليدية واسعة المجال بالفلورة، إلى جانب تحقيق تحسين كبير في دقة الهياكل ذاتية التألق.

كإجراء تحكم، تتطابق مواقع الأجسام المكتشفة في صورة تحديد الموقع مع تلك الموجودة في صورة المجال الساطع. ^{[ 104 ]}

كما تم إثبات إمكانية استخدام المجهر فائق الدقة بدون علامات باستخدام تقلبات إشارة تشتت رامان المحسّنة سطحيًا على سطح فوقي بلازموني متجانس للغاية. ^{[ 105 ]}

المجهر ذو الإضاءة العشوائية (RIM) هو تقنية تصوير فائقة الدقة تستخدم إضاءة واسعة المجال عشوائية أو شبه عشوائية، يتم توليدها بواسطة الليزر. تُمكّن هذه الطريقة من إعادة بناء صورة عالية الدقة من عدة إطارات منخفضة الدقة تم التقاطها تحت أنماط إضاءة متغيرة وغير معروفة، ما يُتيح الوصول إلى دقة تصل إلى 90 نانومترًا. يتميز المجهر ذو الإضاءة العشوائية بميزة خاصة في تصوير العينات الحية السميكة نظرًا لانخفاض سميته الضوئية وقدرته الفائقة على تصوير المقاطع المحورية (z). إضافةً إلى ذلك، فإن مقاومته للانحرافات البصرية تجعله أداة فعالة للغاية في البحوث البيولوجية.

من الممكن تجاوز الحاجة إلى مطابقة دالة انتشار النقطة (PSF) المتأصلة في مجهر تحديد موقع الجزيء المفرد (SMLM) عن طريق حساب الارتباط الذاتي الزمني للبكسلات مباشرةً. تُعرف هذه التقنية باسم تصوير التذبذب البصري فائق الدقة (SOFI)، وقد ثبت أنها أكثر دقة من SMLM عندما تكون كثافة الفلوروفورات النشطة في وقت واحد عالية جدًا.

يُعدّ مجهر التموضع الشامل (OLM) امتدادًا لتقنيات مجهر الجزيء المفرد (SMLM)، حيث يُتيح تصويرًا عالي الكثافة للجزيئات المفردة باستخدام مصدر ضوء غير متماسك (مثل مصباح قوس الزئبق) وإعداد مجهر فلوري تقليدي. ^{[ 113 ]} تُمكّن نبضة قصيرة من الإثارة باللون الأزرق الداكن (باستخدام ليزر بطول موجي 350-380  نانومتر، بدلًا من 405  نانومتر) من إعادة تنشيط الجزيئات لفترة طويلة، ما يُتيح دقة تصل إلى 90  نانومتر على العينات المختبرة. أخيرًا، يُمكن إجراء تصوير STED وSMLM المترابط على نفس العينة البيولوجية باستخدام وسيط تصوير بسيط، ما يُوفّر أساسًا لتحسين الدقة بشكل أكبر. تُساهم هذه النتائج في إتاحة التصوير فائق الدقة للجميع، وتُساعد أي باحث على إنتاج صور عالية الكثافة للجزيئات المفردة حتى بميزانية محدودة.

يُعدّ تحسين الدقة بالتصوير التسلسلي (RESI) امتدادًا لتقنية DNA-PAINT، حيث يُمكنه نظريًا تحقيق دقة غير محدودة. ^{[ 114 ]} فبدلًا من استخدام نوع واحد من العلامات لتحديد نوع مُستهدف مُعين، يتم وسم نسخ من نفس الهدف بتسلسلات DNA مُتعامدة. عند التصوير التسلسلي (أي المُنفصل)، يُمكن (1) فصل سُحب التموضع التي تتداخل في تقنية SMLM التقليدية، و(2) دمجها في تموضع "فائق" واحد، تتناسب دقته طرديًا مع عدد التموضعات الأساسية. وبما أن عدد التموضعات التي يُمكن تحقيقها في تقنية DNA-PAINT غير محدود، فإن الدقة النظرية لتقنية RESI غير محدودة أيضًا. يُؤدي تراكب تموضعات RESI من جولات التصوير الأساسية إلى إنشاء صورة مُركبة عالية الدقة.

أصبحت صور المجهر الضوئي النانوي (3D LIMON)، باستخدام مجهر Vertico SMI ، ممكنة من خلال الجمع بين SMI و SPDM ، حيث يتم تطبيق عملية SMI أولاً، ثم عملية SPDM.

تحدد عملية SMI مركز الجسيمات وانتشارها في اتجاه محور المجهر. وبينما يمكن تحديد مركز الجسيمات/الجزيئات بدقة تتراوح بين 1 و2  نانومتر، يمكن تحديد الانتشار حول هذه النقطة بدقة تصل إلى قطر محوري يبلغ حوالي 30-40  نانومتر.

بعد ذلك، يتم تحديد الموضع الجانبي للجسيم/الجزيء الفردي باستخدام SPDM، مما يحقق دقة تصل إلى بضعة نانومترات. ^{[ 115 ]}

كتطبيق بيولوجي في وضع اللون المزدوج ثلاثي الأبعاد، تم تحديد الترتيبات المكانية لتجمعات Her2/neu و Her3 . ويمكن تحديد مواقع تجمعات البروتين في جميع الاتجاهات الثلاثة بدقة تصل إلى حوالي 25  نانومتر. ^{[ 116 ]}

يُمكّن الجمع بين مجهر فائق الدقة ومجهر إلكتروني من تصوير المعلومات السياقية، مع توفير الوسم بواسطة علامات فلورية. وهذا يتغلب على مشكلة الخلفية السوداء التي يواجهها الباحث عند استخدام مجهر ضوئي فقط. في النظام المتكامل، تُقاس العينة بواسطة كلا المجهرين في آنٍ واحد. ^{[ 117 ]}

تجمع تقنية التصوير SR-FACT بين الدقة الفائقة والتصوير المقطعي المحوسب بمساعدة حيود الأشعة السينية. تتميز هذه التقنية بقدرات فريدة قابلة للتطبيق في علم الأحياء الخلوي ، مع التركيز بشكل خاص على تفاعلات الخلية . ^{[ 118 ]}