اختبار الحمض النووي

اختبار الحمض النووي ( NAT ) هو تقنية تُستخدم للكشف المباشر عن تسلسل حمض نووي محدد، وعادةً ما يكون ذلك للكشف عن نوع أو سلالة معينة من الكائنات الحية وتحديدها، وغالبًا ما يكون فيروسًا أو بكتيريا تُسبب الأمراض في الدم أو الأنسجة أو البول ، وما إلى ذلك. يختلف اختبار الحمض النووي عن الاختبارات الأخرى في أنه يكشف عن المواد الوراثية ( RNA أو DNA ) بدلاً من المستضدات أو الأجسام المضادة . يسمح الكشف عن المواد الوراثية بالتشخيص المبكر للمرض، لأن الكشف عن المستضدات و/أو الأجسام المضادة يتطلب وقتًا حتى تبدأ بالظهور في مجرى الدم. ^{[ 1 ]} نظرًا لأن كمية مادة وراثية معينة عادةً ما تكون ضئيلة جدًا، فإن العديد من اختبارات الحمض النووي تتضمن خطوة لتضخيم المادة الوراثية، أي إنتاج نسخ متعددة منها. تُسمى هذه الاختبارات باختبارات تضخيم الحمض النووي ( NAATs ). توجد عدة طرق للتضخيم، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، واختبار إزاحة السلسلة (SDA)، واختبار النسخ الوسيط (TMA)، ^{[ 2 ]} والتضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP). ^{[ 3 ]}

تعتمد جميع طرق تضخيم الأحماض النووية وتقنيات الكشف عنها تقريبًا على خصوصية اقتران قواعد واتسون-كريك؛ حيث تلتقط جزيئات المجس أو البادئ أحادية السلسلة جزيئات الحمض النووي DNA أو RNA المستهدفة ذات السلاسل المكملة . ولذلك، يُعد تصميم سلاسل المجس بالغ الأهمية لرفع حساسية وخصوصية الكشف. مع ذلك، فإن الطفرات التي تُشكل الأساس الجيني للعديد من الأمراض البشرية عادةً ما تختلف اختلافًا طفيفًا عن الأحماض النووية الطبيعية. غالبًا ما يكون الاختلاف في قاعدة واحدة فقط، مثل الإدخالات والحذف وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ( SNPs ). في هذه الحالة، قد يحدث ارتباط غير كامل بين المجس والهدف بسهولة، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة ، مثل الخلط بين سلالة متعايشة وسلالة ممرضة . وقد خُصصت أبحاث كثيرة لتحقيق خصوصية القاعدة المفردة.

تلتصق خيوط الحمض النووي (DNA وRNA) ذات التسلسلات المتطابقة معًا في سلاسل ثنائية. لكن كل عقدة من السلسلة ليست شديدة الالتصاق، لذا فإن السلسلة المزدوجة تنفك جزئيًا ثم تعود للالتصاق تحت تأثير الاهتزازات المحيطة (المعروفة بالضوضاء الحرارية أو الحركة البراونية ). وتكون الأزواج الأطول أكثر استقرارًا. تستخدم اختبارات الحمض النووي "مسبارًا" وهو عبارة عن خيط طويل ملتصق به خيط قصير. يحتوي خيط البادئ الطويل على تسلسل مطابق (مكمل) لخيط "الهدف" من الكائن المسبب للمرض المراد الكشف عنه. يلتصق خيط المرض بإحكام بالجزء المكشوف من خيط البادئ الطويل (المسمى "موضع الارتباط")، ثم يزيح تدريجيًا خيط "الحماية" القصير من المسبار. في النهاية، لا يرتبط خيط الحماية القصير بأي شيء، ويمكن الكشف عن خيط البادئ القصير غير المرتبط. يقدم الجزء المتبقي من هذا القسم بعض المعلومات التاريخية عن الأبحاث اللازمة لتحسين هذه العملية وتحويلها إلى اختبار مفيد.

في عام ٢٠١٢، نشر فريق بحث يين ورقة بحثية حول تحسين خصوصية تهجين الأحماض النووية. ^{[ ٤ ]} وقدّموا "مسبار تبادل منطقة الارتباط (PC)"، الذي يتكون من سلسلة مكملة مهجنة مسبقًا (C) وسلسلة واقية (P). السلسلة المكملة أطول من السلسلة الواقية، ما يسمح بوجود ذيل غير مرتبط في نهايتها، وهو ما يُعرف بمنطقة الارتباط. تتكامل السلسلة المكملة تمامًا مع التسلسل المستهدف. عندما يتفاعل الهدف الصحيح (X) مع مسبار تبادل منطقة الارتباط (PC)، تتحرر السلسلة الواقية (P) ويتكون الناتج المهجن XC. تكون الطاقة الحرة القياسية (∆) للتفاعل قريبة من الصفر. من ناحية أخرى، إذا تفاعل مسبار تبادل منطقة الارتباط (PC) مع هدف زائف (S)، فإن التفاعل يسير في الاتجاه الأمامي، لكن الطاقة الحرة القياسية تزداد، ما يجعله أقل ملاءمة من الناحية الديناميكية الحرارية. يكون فرق الطاقة الحرة القياسية (∆∆) كبيرًا بما يكفي لإحداث تمييز واضح في الناتج. يُحسب عامل التمييز Q بقسمة نسبة التهجين الصحيح للهدف على نسبة التهجين الخاطئ للهدف. من خلال تجارب أجريت على مجسات تبادلية مختلفة ذات قاعدة طرفية، باستخدام 5 أهداف صحيحة و55 هدفًا خاطئًا مع تغييرات أحادية القاعدة ذات دلالة طاقية (استبدالات، حذف، وإدخالات)، خلصت مجموعة يين إلى أن عوامل التمييز لهذه المجسات تتراوح بين 3 و100+، بمتوسط ​​26. تعمل هذه المجسات بكفاءة عالية في درجات  حرارة تتراوح بين 10 و37  درجة مئوية، وتركيزات تتراوح بين 1 و47 ملي مولار، وتركيزات حمض نووي تتراوح بين 1 و5 مولار. كما اكتشفوا أن هذه المجسات تعمل بكفاءة عالية حتى في الكشف عن الحمض النووي الريبي (RNA).

أُجريت أبحاثٌ إضافيةٌ لاحقة. في عام ٢٠١٣، نشر فريق سيليغ ورقةً بحثيةً حول المجسات الجزيئية الفلورية التي تستخدم أيضًا تفاعل تبادل منطقة الارتباط. ^{[ ٥ ]} وقد مكّن هذا من الكشف البصري عن الهدف الصحيح وهدف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP). كما نجحوا في الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في عيناتٍ مشتقةٍ من بكتيريا الإشريكية القولونية.

في عام 2015، حقق فريق ديفيد انتقائية عالية للغاية (أكثر من 1000) للمتغيرات أحادية النوكليوتيد (SNVs) من خلال تقديم نظام يُسمى "التراكيب التنافسية". ^{[ 6 ]} في هذا النظام، قاموا ببناء نموذج حركي لعمليات التهجين الأساسية للتنبؤ بقيم المعلمات المثلى، والتي تختلف بناءً على تسلسلات SNV والنمط البري (WT)، وعلى تصميم بنية المجس والمستقبل، وعلى تركيزات الكواشف وظروف التحليل. نجح نموذجهم في تحقيق انتقائية متوسطة قدرها 890 ضعفًا لـ 44 متغيرًا أحادي النوكليوتيد مرتبطًا بالسرطان في الحمض النووي، بحد أدنى 200، وهو ما يمثل تحسنًا لا يقل عن 30 ضعفًا مقارنةً بالتحليلات السابقة القائمة على التهجين. بالإضافة إلى ذلك، طبقوا هذه التقنية لتحليل تسلسلات ذات تردد أليل متغير منخفض من الحمض النووي الجينومي البشري بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وكذلك مباشرةً على تسلسلات الحمض النووي الريبوزي الاصطناعي (RNA).

استنادًا إلى خبرتهم، طوروا طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) جديدة تُسمى تضخيم إزاحة الحاجز (BDA). ^{[ 7 ]} وهي طريقة PCR مقاومة للحرارة، تُضخّم بشكل انتقائي جميع متغيرات التسلسل ضمن نطاق 20 نيوكليوتيد تقريبًا بمقدار 1000 ضعف مقارنةً بالتسلسلات الأصلية، مما يُسهّل الكشف عن مئات المتغيرات المحتملة وتحديد كميتها، والتي كانت في الأصل بتردد أليلي ≤ 0.1%. تُحقق BDA أداءً مُماثلًا في الإثراء عبر درجات حرارة التلدين التي تتراوح من 56  درجة مئوية إلى 64  درجة مئوية. تُسهّل هذه المقاومة للحرارة الإثراء المُتعدد للعديد من المتغيرات المختلفة عبر الجينوم، كما تُتيح استخدام أجهزة التدوير الحراري المحمولة وغير المكلفة للكشف عن متغيرات الحمض النووي النادرة. وقد تم التحقق من صحة BDA حتى على أنواع عينات تشمل عينات الحمض النووي الخالية من الخلايا السريرية المأخوذة من بلازما دم مرضى سرطان الرئة.

• تشخيص عدوى السيلان وغيرها من عدوى النيسرية: تضخيم تسلسلات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الخاصة بالنيسرية البنية للكشف عنها. ^{[ 2 ]}
• تشخيص عدوى المتدثرة الحثرية في الجهاز البولي التناسلي ^{[ 8 ]}
• الكشف عن المتفطرة السلية ^{[ 9 ]}
• الكشف عن الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية ^{[ 10 ]}
• الكشف عن فيروسات كورونا الحيوانية المنشأ ^{[ 11 ]}
• اختبار تشخيصي لفيروس SARS-CoV-2 ^{[ 12 ]}
• الكشف عن البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية بعد العلاج بالمضادات الحيوية ^{[ 13 ]}