استدعاء المتغيرات الجينية أحادية النوكليوتيد من بيانات التسلسل الجيني عالي الإنتاجية

في عالم مثالي خالٍ من الأخطاء مع تغطية قراءة عالية ، ستكون مهمة تحديد المتغيرات من نتائج محاذاة بيانات التسلسل الجيني عالي الإنتاجية (NGS) بسيطة؛ ففي كل موقع (موضع على الجينوم)، يمكن حساب عدد مرات ظهور كل نيوكليوتيد مميز بين القراءات المحاذية في ذلك الموضع، وسيكون النمط الجيني الحقيقي واضحًا؛ إما AA إذا كانت جميع النيوكليوتيدات تطابق الأليل A ، أو BB إذا كانت تطابق الأليل B ، أو AB إذا كان هناك مزيج. مع ذلك، عند العمل مع بيانات NGS حقيقية، لا يُستخدم هذا النهج البسيط، لأنه لا يأخذ في الحسبان التشويش في بيانات الإدخال. ^{[ 4 ]} تحتوي أعداد النيوكليوتيدات المستخدمة لتحديد القواعد على أخطاء وتحيزات، ناتجة عن القراءات المتسلسلة نفسها، وعن عملية المحاذاة. يمكن التخفيف من هذه المشكلة إلى حد ما عن طريق التسلسل بعمق تغطية قراءة أكبر، إلا أن هذا غالبًا ما يكون مكلفًا، وتتطلب العديد من الدراسات العملية استخلاص استنتاجات من بيانات ذات تغطية منخفضة. ^{[ 1 ]}

تهدف الأساليب الاحتمالية إلى التغلب على المشكلة المذكورة أعلاه، وذلك من خلال إنتاج تقديرات دقيقة لاحتمالات كل نمط جيني ممكن، مع مراعاة التشويش، بالإضافة إلى المعلومات المسبقة الأخرى المتاحة التي يمكن استخدامها لتحسين التقديرات. ويمكن بعد ذلك التنبؤ بالنمط الجيني بناءً على هذه الاحتمالات، غالبًا وفقًا لتقدير MAP .

تعتمد الطرق الاحتمالية لتحديد المتغيرات الجينية على نظرية بايز . في سياق تحديد المتغيرات الجينية، تُعرّف نظرية بايز احتمال أن يكون كل نمط جيني هو النمط الجيني الحقيقي بالنظر إلى البيانات المرصودة، وذلك بدلالة الاحتمالات المسبقة لكل نمط جيني ممكن، وتوزيع الاحتمالات للبيانات بالنظر إلى كل نمط جيني ممكن. الصيغة هي:

${\displaystyle {\begin{aligned}P(G\mid D)&={\frac {P(D\mid G)P(G)}{P(D)}}\\[8pt]&={\frac {P(D\mid G)\,P(G)}{\sum \limits _{i=1}^{n}P(D\mid G_{i})\,P(G_{i})}}\end{aligned}}}$

في المعادلة أعلاه:

• ${\displaystyle D}$يشير إلى البيانات المرصودة؛ أي القراءات المتراصفة
• ${\displaystyle G}$النمط الجيني الذي يتم حساب احتماليته
• ${\displaystyle G_{i}}$يشير إلى النمط الجيني المحتمل رقم i ، من بين n احتمالات

في ضوء الإطار المذكور أعلاه، تختلف حلول البرمجيات المختلفة للكشف عن الطفرات النقطية المفردة (SNVs) بناءً على كيفية حسابها للاحتمالات المسبقة.${\displaystyle P(G)}$، نموذج الخطأ المستخدم لنمذجة الاحتمالات${\displaystyle P(D\mid G)}$وتقسيم الأنماط الجينية الإجمالية إلى أنماط جينية فرعية منفصلة، ​​والتي يمكن تقدير احتمالاتها بشكل فردي في هذا الإطار. ^{[ 5 ]}

كبديل للطرق الاحتمالية، توجد طرق استدلالية لتحديد المتغيرات في بيانات التسلسل الجيني عالي الإنتاجية (NGS). فبدلاً من نمذجة توزيع البيانات المرصودة واستخدام الإحصاءات البايزية لحساب احتمالات النمط الجيني، يتم تحديد المتغيرات بناءً على مجموعة متنوعة من العوامل الاستدلالية، مثل الحد الأدنى لعدد الأليلات، وحدود جودة القراءة، وحدود عمق القراءة، وما إلى ذلك. ورغم أنها لم تحظَ بشعبية كبيرة في الممارسة العملية مقارنةً بالطرق الاحتمالية، إلا أنها، بفضل استخدامها للحدود والقيود، تتمتع بمتانة عالية في مواجهة البيانات الشاذة التي تخالف افتراضات النماذج الاحتمالية. ^{[ 9 ]}

يُعدّ تسلسل الحمض النووي المستخدم كمرجع لمحاذاة قراءات التسلسل جزءًا أساسيًا من تصميم طرق تحديد المتغيرات باستخدام بيانات التسلسل عالي الإنتاجية (NGS). في دراسات علم الوراثة البشرية، تتوفر مراجع عالية الجودة من مصادر مثل مشروع HapMap ^{[ 10 ]} ، مما يُحسّن بشكل كبير دقة تحديد المتغيرات بواسطة خوارزميات تحديد المتغيرات. إضافةً إلى ذلك، يمكن أن تُشكّل هذه المراجع مصدرًا لاحتمالات النمط الجيني المسبقة للتحليل القائم على نظرية بايز. مع ذلك، في حال عدم توفر مرجع عالي الجودة، يُمكن تجميع القراءات المُستحصلة تجريبيًا أولًا لإنشاء تسلسل مرجعي للمحاذاة. ^{[ 1 ]}

توجد طرق متنوعة لتصفية البيانات في تجارب تحديد المتغيرات الجينية، بهدف إزالة مصادر الخطأ والتحيز. وقد يشمل ذلك إزالة القراءات المشبوهة قبل إجراء عملية المحاذاة، و/أو تصفية قائمة المتغيرات التي تُرجعها خوارزمية تحديد المتغيرات.

اعتمادًا على منصة التسلسل المستخدمة، قد توجد تحيزات مختلفة ضمن مجموعة القراءات المتسلسلة. على سبيل المثال، قد يحدث تحيز في اتجاه السلسلة، حيث يكون هناك توزيع غير متساوٍ بشكل كبير للاتجاهين الأمامي والخلفي في القراءات المحاذية في منطقة معينة. بالإضافة إلى ذلك، قد يحدث تكرار مرتفع بشكل غير عادي لبعض القراءات (على سبيل المثال بسبب تحيز في تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR ). يمكن أن تؤدي هذه التحيزات إلى تحديد متغيرات مشكوك فيها - على سبيل المثال، إذا تم تضخيم جزء يحتوي على خطأ في تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR في موضع معين بشكل مفرط بسبب تحيز في تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR، فسيكون لهذا الموضع عدد كبير من الأليل الخاطئ، وقد يتم تحديده على أنه متغير أحادي النوكليوتيد (SNV) - ولذلك غالبًا ما تقوم مسارات التحليل بتصفية النتائج بناءً على هذه التحيزات. ^{[ 1 ]}

حتى وقت قريب، كانت أدوات البرمجيات المستخدمة لإجراء هذا النوع من التحليل متخلفة للغاية، وتعتمد على نفس الخوارزميات المستخدمة للكشف عن الاختلافات الجينية. هذه الإجراءات غير مُحسَّنة لهذه المهمة، لأنها لا تُحاكي بشكل كافٍ الارتباط الإحصائي بين الأنماط الجينية الموجودة في عينات أنسجة متعددة من نفس الفرد. ^{[ 3 ]}

أسفرت الدراسات الحديثة عن تطوير أدوات برمجية مُحسَّنة خصيصًا للكشف عن الطفرات الجسدية في عينات أنسجة متعددة. وقد طُوِّرت تقنيات احتمالية تجمع عدد الأليلات من جميع عينات الأنسجة في كل موقع جيني، وباستخدام نماذج إحصائية لاحتمالات الأنماط الجينية المشتركة لجميع الأنسجة، وتوزيع عدد الأليلات بناءً على النمط الجيني، يُمكن حساب احتمالات موثوقة نسبيًا للطفرات الجسدية في كل موقع جيني باستخدام جميع البيانات المتاحة. ^{[ 3 ] [ 12 ]} إضافةً إلى ذلك، أُجريت مؤخرًا بعض الأبحاث حول تقنيات التعلم الآلي لإجراء هذا التحليل. ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]}

في عام 2021، نشر اتحاد مراقبة جودة التسلسل - المرحلة الثانية ^{[ 17 ]} عددًا من الدراسات التي بحثت في تأثيرات تحضير العينات، ومجموعات مكتبات التسلسل، ومنصات التسلسل، وسير عمل المعلوماتية الحيوية على دقة الكشف عن الطفرات النقطية الجسدية ^{[ 18 ]} استنادًا إلى زوج من خطوط الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية التي اعتمدها الاتحاد كعينات مرجعية وبيانات ومجموعات استدعاء. ^{[ 19 ]}