تسلسل البيسلفيت ذو التمثيل المخفض

📅 آخر تحديث: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 2 صور
الموسوعة الحرة

يُعدّ تسلسل البيسلفيت ذو التمثيل المُخفّض ( RRBS ) تقنية فعّالة وعالية الإنتاجية لتحليل أنماط مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم بأكمله، وذلك على مستوى النوكليوتيدات المفردة. تجمع هذه التقنية بين إنزيمات التقييد وتسلسل البيسلفيت لإثراء مناطق الجينوم ذات المحتوى العالي من CpG . ونظرًا للتكلفة العالية وعمق التسلسل اللازم لتحليل حالة المثيلة في الجينوم بأكمله، طوّر ميسنر وزملاؤه هذه التقنية عام 2005 لتقليل كمية النوكليوتيدات المطلوبة للتسلسل إلى 1% من الجينوم. [ 1 ] ولا تزال الأجزاء التي تُشكّل الجينوم المُخفّض تشمل غالبية المحفزات ، بالإضافة إلى مناطق مثل التسلسلات المتكررة التي يصعب تحليلها باستخدام طرق تسلسل البيسلفيت التقليدية. [ 2 ]

مخطط بروتوكول تسلسل البيسلفيت ذي التمثيل المخفض

نظرة عامة على البروتوكول

  1. الهضم الإنزيمي : في البداية، يُهضم الحمض النووي الجينومي باستخدام إنزيم تقييد غير حساس للمثيلة، مثل MspI. من الضروري ألا تتأثر الإنزيمات بحالة مثيلة مواقع CpG ، إذ يسمح ذلك بهضم المناطق المثيلة وغير المثيلة على حد سواء. يستهدف هذا الإنزيم 5’CCGG3’التسلسلات ويقطع روابط الفوسفودايستر الموجودة قبل ثنائي نيوكليوتيد CpG. عند استخدام هذا الإنزيم تحديدًا، تحتوي كل قطعة على CpG في كل طرف. ينتج عن هذا الهضم قطع من الحمض النووي بأحجام مختلفة.
  2. إصلاح النهايات وإضافة ذيل الأدينين : نظرًا لطبيعة عمل إنزيم MspI في قطع الحمض النووي المزدوج، ينتج عن هذا التفاعل خيوط ذات نهايات لاصقة . يُعد إصلاح النهايات ضروريًا لملء الطرف 3' من نهايات الخيوط. الخطوة التالية هي إضافة أدينوسين إضافي إلى كل من الخيوط الموجبة والسالبة . يُشار إلى هذه العملية باسم إضافة ذيل الأدينين، وهي ضرورية لربط المحول في الخطوة اللاحقة. يتم إصلاح النهايات وإضافة ذيل الأدينين في نفس التفاعلات، باستخدام ديوكسي ريبونوكليوتيدات dCTP وdGTP وdATP. لزيادة كفاءة إضافة ذيل الأدينين، تُضاف كميات زائدة من dATP في هذا التفاعل.
  3. محولات التسلسل : تُربط محولات التسلسل الميثيلية بقطع الحمض النووي. تحتوي جزيئات محولات التسلسل الميثيلية على استبدال جميع السيتوزينات بسيتوزينات ميثيلية في الطرف 5' لمنع نزع الأمين من هذه السيتوزينات في تفاعل تحويل البيسلفيت. ولتسلسل التفاعلات باستخدام أجهزة التسلسل من Illumina، تُهجّن محولات التسلسل مع المحولات الموجودة على خلية التدفق.
  4. تنقية القطع : يتم اختيار القطع ذات الحجم المطلوب للتنقية. تُفصل القطع ذات الأحجام المختلفة باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي ، ثم تُنقى باستخدام تقنية استخلاص القطع من الهلام. ووفقًا لـ Gu وآخرون، فإن قطع الحمض النووي التي يتراوح طولها بين 40 و220 زوجًا قاعديًا تمثل غالبية تسلسلات المحفزات وجزر CpG [ 2 ].
  5. تحويل البيسلفيت : تُحوّل شظايا الحمض النووي بعد ذلك باستخدام البيسلفيت، وهي عملية تُزيل مجموعة الأمين من السيتوزين غير المُمَثْيَل ليُصبح يوراسيل . أما السيتوزينات المُمَثْيَلة فتبقى دون تغيير، وذلك بفضل مجموعة الميثيل التي تحميها من التفاعل.
  6. تضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل : يتم بعد ذلك تضخيم الحمض النووي المحول بواسطة البيسلفيت باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع البادئات التي تكمل محولات التسلسل.
  7. تنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) : قبل إجراء التسلسل، يجب أن يكون ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل خاليًا من كواشف التفاعل غير المستخدمة، مثل النيوكليوتيدات غير المدمجة أو الأملاح، ويتطلب ذلك تنقية. يمكن القيام بذلك عن طريق تشغيل هلام كهربائي آخر أو باستخدام مجموعات مصممة خصيصًا لتنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  8. التسلسل : تُسلسل القطع بعد ذلك بناءً على الإنتاجية المطلوبة والدقة والوقت اللازم لإنجاز العمل. في البداية، كان يُستخدم تسلسل سانجر، لكنه الآن أقل تفضيلاً مقارنةً بتقنيات التسلسل من الجيل التالي.
  9. تحليل المعلوماتية الحيوية : نظرًا للخصائص الفريدة لتقنية RRBS، يلزم استخدام برامج متخصصة للمحاذاة والتحليل. [ 3 ] يؤدي استخدام إنزيم MspI لهضم الحمض النووي الجينومي إلى شظايا تبدأ دائمًا بقاعدة C (إذا كان السيتوزين مثيلًا) أو بقاعدة T (إذا لم يكن السيتوزين مثيلًا وتحول إلى يوراسيل في تفاعل تحويل البيسلفيت). ينتج عن ذلك تركيب غير عشوائي لأزواج القواعد. بالإضافة إلى ذلك، يكون تركيب القواعد منحرفًا بسبب الترددات المتحيزة لقاعدتي C وT داخل العينات. تتوفر برامج متنوعة للمحاذاة والتحليل، مثل Maq وBS Seeker وBismark وBSMAP. تسمح المحاذاة مع جينوم مرجعي للبرامج بتحديد أزواج القواعد المثيلة داخل الجينوم.

المزايا

إثراء مواقع CpG

تستخدم تقنية RRBS بشكل فريد إنزيم تقييد محدد لإثراء مواقع CpG. ينتج عن هضم MspI، أو أي إنزيم تقييد آخر يتعرف على مواقع CpG ويقطعها، شظايا تنتهي بـ CG فقط. [ 2 ] تُثري هذه الطريقة مناطق CpG في الجينوم، مما يقلل من كمية التسلسل المطلوبة ويخفض التكلفة. [ 2 ] تُعد هذه التقنية فعالة من حيث التكلفة، خاصةً عند التركيز على مناطق CpG الشائعة.

بروتوكول تسلسل البيسلفيت ذو التمثيل المخفض

مدخلات عينة منخفضة

يكفي تركيز منخفض للعينة، يتراوح بين 10 و300  نانوغرام، لتحليل البيانات بدقة. [ 2 ] يمكن استخدام هذه التقنية عند نقص العينات الثمينة. ومن مزاياها الأخرى أنها لا تتطلب عينات طازجة أو حية، إذ يمكن استخدام عينات مثبتة بالفورمالين أو مضمنة في البارافين. [ 2 ]

القيود

إنزيم التقييد

تتضمن خطوات البروتوكول المحددة بعض القيود. يغطي هضم MspI معظم مناطق CG في الجينوم، ولكن ليس جميعها. [ 2 ] قد تُفقد بعض مواقع CpG. كما أن فقدان مواقع CpG واردٌ لأن هذا البروتوكول لا يمثل سوى عينة تمثيلية من الجينوم. [ 2 ] وبالتالي، تكون تغطية بعض المناطق أقل. تستخدم بعض التعديلات الأخرى لهذا البروتوكول إنزيمات بديلة. [ 4 ]

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

خلال مرحلة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من البروتوكول، يجب استخدام بوليميراز غير مدقق، لأن الإنزيم المدقق سيتوقف عند بقايا اليوراسيل الموجودة في قالب الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). [ 1 ] كما أن استخدام بوليميراز غير مدقق قد يؤدي إلى زيادة أخطاء تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل. [ 1 ]

تسلسل البيسلفيت

لا يُحوّل تسلسل البيسلفيت إلا الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). ويتطلب التحويل الكامل للبيسلفيت فصلًا تامًا للحمض النووي وعدم إعادة ارتباط الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA). [ 1 ] وقد ثبت أن خطوات البروتوكول البسيطة تُحقق فصلًا تامًا للحمض النووي. ويُعد ضمان استخدام أجزاء صغيرة من خلال القص أو الهضم، واستخدام كواشف طازجة، ووقت فصل كافٍ للحمض النووي أمرًا بالغ الأهمية للفصل التام. [ 5 ] ومن التقنيات المقترحة الأخرى إجراء تفاعل البيسلفيت عند 95  درجة مئوية، على الرغم من أن تحلل الحمض النووي يحدث أيضًا عند درجات حرارة عالية. [ 5 ] في الساعة الأولى من تفاعل البيسلفيت، يُتوقع أن أقل من 90% من الحمض النووي للعينة يُفقد بسبب التحلل. [ 6 ] ويلزم تحقيق توازن بين درجات الحرارة المرتفعة والمنخفضة لضمان الفصل التام للحمض النووي وتقليل تحلله. كما يمكن استخدام كواشف، مثل اليوريا، لمنع تكوّن الحمض النووي ثنائي السلسلة. [ 5 ] مع تلوث الحمض النووي المزدوج، قد يصعب حساب البيانات بدقة. [ 1 ] عند ملاحظة سيتوزين غير مُحوَّل، يصعب التمييز بين غياب المثيلة ووجود خلل في التحليل. [ 1 ]

دلالة

تكمن أهمية هذه التقنية في أنها تتيح تسلسل المناطق المُمَثْيَلَة التي لا يمكن تحليلها بدقة باستخدام تقنيات تسلسل البيسلفيت التقليدية. وتُعاني تقنيات التسلسل الحالية من قصور في تحليل مناطق التسلسلات المتكررة. [ 7 ] وهذا يُعدّ عائقًا أمام دراسات المَثْيَلَة، إذ غالبًا ما تحتوي هذه التسلسلات المتكررة على سيتوزينات مُمَثْيَلَة. ويُشكّل هذا عائقًا خاصًا في الدراسات التي تتناول تحليل جينومات السرطان ، حيث يُلاحَظ فقدان المَثْيَلَة في هذه التسلسلات المتكررة في العديد من أنواع السرطان. [ 8 ] وتُزيل تقنية RRBS المشاكل الناجمة عن هذه المناطق الكبيرة من التسلسلات المتكررة، مما يسمح بتوصيف هذه المناطق بشكلٍ أكثر شمولًا.

التطبيقات

الميثيلومات في علم جينوم السرطان

لوحظ وجود خلل في عملية المثيلة في السرطان. [ 9 ] في السرطان، لوحظ فرط المثيلة ونقصها في الأورام. [ 9 ] نظرًا لحساسية تقنية RRBS العالية، يمكن استخدامها للكشف السريع عن خلل المثيلة في السرطان. [ 10 ] إذا أمكن الحصول على عينات من ورم المريض وخلاياه الطبيعية، يمكن إجراء مقارنة بين هذين النوعين من الخلايا. [ 2 ] [ 10 ] يمكن الحصول على صورة شاملة للمثيلة بسرعة كبيرة. [ 2 ] تُمكّن هذه التقنية من تحديد حالة المثيلة العامة لجينومات السرطان بسرعة، مما يوفر الوقت والمال.

حالات المثيلة في النمو

يمكن ملاحظة تغيرات خاصة بكل مرحلة في جميع الكائنات الحية. ويمكن أن تكون التعديلات في مستويات المثيلة الإجمالية عبر تسلسل البيسلفيت ذي التمثيل المنخفض مفيدة في علم الأحياء النمائي.

مقارنة بالتقنيات الأخرى

تتطابق نتائج المقارنة بين تقنيتي RRBS وMethylC-seq بشكل كبير. [ 11 ] وبطبيعة الحال، تتميز MethylC-seq بتغطية جينومية أوسع لمواقع CpG مقارنةً بـ RRBS، إلا أن RRBS تتميز بتغطية أوسع لجزر CpG. [ 11 ] ومن التقنيات الأخرى الشائعة الاستخدام لتحليل مثيلة الحمض النووي MeDip-Seq. وتعتمد هذه التقنية على الترسيب المناعي للسيتوزينات المثيلة ثم التسلسل. [ 11 ] تتميز RRBS بدقة أعلى مقارنةً بهذه التقنية، حيث تقتصر MeDip-Seq على 150 زوجًا قاعديًا مقابل دقة نيوكليوتيد واحد في RRBS. [ 11 ] كما وُجد أن طرق البيسلفيت، المستخدمة في RRBS، أكثر دقة من الطرق القائمة على الإثراء، مثل MeDip-Seq. [ 7 ] البيانات التي تم الحصول عليها من RRBS و Illumina Infinium methylation قابلة للمقارنة بدرجة عالية، مع معامل ارتباط بيرسون 0.92. [ 7 ] البيانات الخاصة بالمنصتين قابلة للمقارنة بشكل مباشر أيضًا حيث أن كليهما يستخدم قياسًا مطلقًا للحمض النووي.

أخيرًا، طوّر فريق بن ديلات في شركة أكتيف موتيف تقنية تسلسل البيسلفيت المعتمدة على المرساة (ABBS). تستخدم هذه التقنية بادئات متخصصة لالتقاط مثيلة الحمض النووي، مما يسمح بتغطية أكبر (حوالي 10 أضعاف تغطية WGBS) وخفض تكاليف التسلسل. كما أظهروا أن ABBS أقل تقييدًا من RRBS، ويمكن استخدامها كبديل لتقنية MeDIP-seq مع الحفاظ على دقة القواعد. [ 12 ]

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 6 ألكسندر مايسنر، أندرياس غنيرك، جورج دبليو بيل، برنارد رامساهوي، إريك إس لاندر، ورودولف جانيش. 2005. "تسلسل البيسلفيت ذو التمثيل المُخفَّض لتحليل مثيلة الحمض النووي عالي الدقة المقارن". مجلة أبحاث الأحماض النووية . 33(18):5868-77
  2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gu H, Smith ZD, Bock C, Boyle P, Gnirke A, Meissner A. 2011. "إعداد مكتبات تسلسل البيسلفيت ذات التمثيل المُخفَّض لتحليل مثيلة الحمض النووي على نطاق الجينوم." Nat Protoc . 6(4):468-81. doi : 10.1038/nprot.2010.190 .
  3. ↑ تشاتيرجي أ، رودجر إي جيه، ستوكويل بي إيه، ويكس آر جيه، موريسون آي إم. 2012. "اعتبارات تقنية لتسلسل البيسلفيت ذي التمثيل المُخفَّض باستخدام مكتبات متعددة." مجلة التكنولوجيا الحيوية الطبية الحيوية . 2012:741542. doi : 10.1155/2012/741542
  4. ↑ تروكي، إميليانو؛ مازاريللا، آنا ب.؛ جيلفيلان، غريغور د.؛ لورينزو، ماريا ت.؛ شونسفيتر، بيتر؛ باون، أوفيديو (أبريل 2016). " BsRADseq: فحص مثيلة الحمض النووي في التجمعات الطبيعية للأنواع غير النموذجية" . علم البيئة الجزيئية . 25 (8): 1697-1713 . doi : 10.1111/mec.13550 . PMC 4949719. PMID 26818626 .  
  5. 1 2 3 Warnercke, PM Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, JR, Clark, SJ 2002. "تحديد وحل القطع الأثرية في تسلسل البيسلفيت." Methods. 27: 101-107.
  6. ↑ غروناو، سي.، كلارك، إس جيه وروزنتال، أ. 2001. "تسلسل الجينوم باستخدام البيسلفيت: دراسة منهجية للمعايير التجريبية الحاسمة." أبحاث الأحماض النووية ، 29، E65–65.
  7. 1 2 3 بوك سي، تومازو إي إم، برينكمان إيه بي، مولر إف، سيمر إف، غو إتش، ياغر إن، غنيركه إيه، ستوننبرغ إتش جي، مايسنر إيه. 2010. "مقارنة كمية لتقنيات رسم خرائط مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم." نات بيوتكنولوجي . 28(10):1106-1114. doi : 10.1038/nbt.1681
  8. ↑ إيرليخ م. 2009. "نقص مثيلة الحمض النووي في الخلايا السرطانية". علم التخلق . 1(2):239-59. doi : 10.2217/epi.09.33 .
  9. 1 2 فيرستيج، ر. 1997. المثيلة الشاذة في السرطان. المجلة الأمريكية لعلم الوراثة البشرية. 60:751-754.
  10. 1 2 سميث، زد دي، غو، إتش، بوك، سي، غنيك، إيه، وميسنر، إيه. 2009. التسلسل عالي الإنتاجية للبيسلفيت في جينومات الثدييات. طرق. 48: 226-232.
  11. 1 2 3 4 هاريس، آلان وآخرون. 2010. "مقارنة الطرق القائمة على التسلسل لتحديد مثيلة الحمض النووي وتحديد التعديلات اللاجينية أحادية الأليل" Nature Biotechnology 28:1097-1105.
  12. ↑ تشابين، ن.، فرنانديز، ج.، بول، ج. وآخرون. تسلسل البيسلفيت القائم على المرساة يحدد مثيلة الحمض النووي على مستوى الجينوم. كومون بيول 5، 596 (2022).