تجربة الجزيء الواحد

📅 آخر تحديث: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 2 صور
الموسوعة الحرة
تم تسجيل جزيئات البوليمر المفردة (سلاسل بسمك 0.4 نانومتر) في وسط مائي عند درجات حموضة مختلفة باستخدام مجهر القوة الذرية . لوحظ تغير جذري في شكل سلسلة البوليمر عند تغير طفيف في درجة الحموضة. [ 1 ]

تجربة الجزيء المفرد هي تجربة تُعنى بدراسة خصائص الجزيئات الفردية . ويمكن مقارنة دراسات الجزيء المفرد بالقياسات التي تُجرى على مجموعة من الجزيئات، حيث لا يمكن تمييز السلوك الفردي للجزيئات، ولا يُمكن قياس سوى الخصائص المتوسطة . ولأن العديد من تقنيات القياس في علم الأحياء والكيمياء والفيزياء ليست حساسة بما يكفي لرصد الجزيئات المفردة، فقد أثارت تقنيات التألق للجزيئات المفردة (التي ظهرت منذ تسعينيات القرن الماضي لاستكشاف عمليات مختلفة على مستوى الجزيئات المفردة) حماسًا كبيرًا، إذ وفرت تفاصيل جديدة كثيرة حول العمليات المقاسة لم تكن متاحة في السابق. وبالفعل، منذ تسعينيات القرن الماضي، تم تطوير العديد من التقنيات لاستكشاف الجزيئات المفردة. [ 2 ]

كانت أولى التجارب على الجزيئات المفردة تجارب تثبيت الرقعة التي أُجريت في سبعينيات القرن الماضي، لكنها اقتصرت على دراسة قنوات الأيونات . أما اليوم، فتشمل الأنظمة التي تُدرس باستخدام تقنيات الجزيئات المفردة حركة الميوسين على خيوط الأكتين في الأنسجة العضلية، والتفاصيل الطيفية للبيئات المحلية الفردية في المواد الصلبة. وقد قُيست تراكيب البوليمرات البيولوجية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). وباستخدام مطيافية القوة ، يمكن شد الجزيئات المفردة (أو أزواج الجزيئات المتفاعلة)، وعادةً ما تكون بوليمرات ، ميكانيكيًا، وتسجيل استجابتها المرنة في الوقت الحقيقي.

تاريخ

في الحالة الغازية عند ضغوط منخفضة للغاية، أُجريت تجارب على جزيئات مفردة لعقود، أما في الحالة المكثفة فلم تُجرَ إلا منذ عام 1989 مع عمل دبليو إي مورنر ولوثار كادور. [ 3 ] وبعد عام واحد، تمكن ميشيل أوريت وجاكي برنارد من إثبات إمكانية رصد امتصاص الجزيئات المفردة عن طريق تألقها. [ 4 ]

تتمتع العديد من التقنيات بالقدرة على رصد جزيء واحد في كل مرة، وأبرزها مطيافية الكتلة ، حيث يتم الكشف عن الأيونات المفردة. إضافةً إلى ذلك، ظهرت إحدى أقدم وسائل الكشف عن الجزيئات المفردة في مجال قنوات الأيونات مع تطوير تقنية التثبيت الموضعي بواسطة إروين نيهر وبيرت ساكمان (اللذين فازا لاحقًا بجائزة نوبل لإسهاماتهما الرائدة). مع ذلك، فإن فكرة قياس الموصلية لدراسة الجزيئات المفردة فرضت قيودًا كبيرة على أنواع الأنظمة التي يمكن رصدها.

يُعدّ التألق وسيلةً ملائمةً لمراقبة جزيء واحد في كل مرة، ويعود ذلك في الغالب إلى حساسية الكواشف الضوئية التجارية القادرة على عدّ الفوتونات المفردة. مع ذلك، يتطلب رصد جزيء واحد طيفيًا أن يكون الجزيء في بيئة معزولة وأن يُصدر فوتونات عند إثارته، وهو ما يُتيح، بفضل تقنية الكشف عن الفوتونات المفردة باستخدام أنابيب التضخيم الضوئي (PMT) أو الثنائيات الضوئية الانهيارية (APD)، تسجيل أحداث انبعاث الفوتونات بحساسية عالية ودقة زمنية فائقة.

في الآونة الأخيرة، حظي التألق الجزيئي الأحادي باهتمام بالغ في مجال التصوير البيولوجي، وذلك من خلال وسم الجزيئات الحيوية كالبروتينات والنيوكليوتيدات لدراسة الوظائف الإنزيمية التي يصعب دراستها على نطاق واسع، نظرًا للتغيرات الدقيقة التي تحدث مع الزمن في عملية التحفيز وإعادة التنظيم البنيوي. وكانت إنزيمات الميوسين/الأكتين الموجودة في الأنسجة العضلية من أكثر البروتينات دراسةً. وباستخدام تقنيات الجزيء الأحادي، تم رصد آلية الخطوة وتوصيفها في العديد من هذه البروتينات.

في عام 1997، تم إثبات إمكانية الكشف عن الجزيئات المفردة باستخدام مطيافية رامان المحسنة سطحيًا (SERS) بواسطة كاترين كنيب ، وهـ. كنيب، وي. وانغ، ول. ت. بيرلمان وآخرين [ 5 ] في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، وبشكل مستقل بواسطة س . ني وس. ر. إيموري في جامعة إنديانا . [ 6 ] استخدم فريق معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا إثارة رامان غير الرنينية والتحسين السطحي باستخدام تجمعات نانوية من الفضة للكشف عن جزيئات كريزيل البنفسجية المفردة ، بينما استخدم فريق جامعة إنديانا إثارة رامان الرنينية والتحسين السطحي باستخدام جسيمات نانوية من الفضة للكشف عن جزيئات رودامين 6G المفردة .

تُعدّ أجهزة التلاعب النانوية، مثل مجهر القوة الذرية، مناسبةً أيضًا لتجارب الجزيئات المفردة ذات الأهمية البيولوجية، نظرًا لعملها على نفس مقياس الطول لمعظم البوليمرات البيولوجية. إضافةً إلى ذلك، يُعدّ مجهر القوة الذرية (AFM) مناسبًا لدراسة جزيئات البوليمر الاصطناعية، إذ يُتيح إمكانيةً فريدةً للتصوير ثلاثي الأبعاد لسلاسل البوليمر. على سبيل المثال، يُعدّ نمط النقر في مجهر القوة الذرية لطيفًا بما يكفي لتسجيل جزيئات البوليمرات الإلكتروليتية الممتصة (مثل  سلاسل بولي (2-فينيل بيريدين) بسمك 0.4 نانومتر) في وسط سائل. يتوافق موقع تراكب السلسلتين في هذه التجارب مع ضعف سمك السلسلة المفردة (0.8  نانومتر في المثال المذكور). عند تطبيق معايير المسح المناسبة، يبقى شكل هذه الجزيئات ثابتًا لساعات، مما يسمح بإجراء التجارب في أوساط سائلة ذات خصائص متنوعة. [ 1 ] علاوةً على ذلك، يُمكن الحصول على صور عالية الدقة من خلال التحكم في القوة بين رأس المجهر والعينة. [ 7 ] [ 8 ] كما استُخدمت الملاقط الضوئية لدراسة وتحديد كمية التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين. [ 7 ] [ 8 ]

حول التجارب

مفهوم

تستخدم مطيافية التألق لجزيء واحد تألق الجزيء للحصول على معلومات حول بيئته وبنيته وموقعه. تتيح هذه التقنية إمكانية الحصول على معلومات لا يمكن الحصول عليها بطرق أخرى بسبب متوسطات المجموعات (أي أن الإشارة التي يتم الحصول عليها عند تسجيل العديد من الجزيئات في الوقت نفسه تمثل خاصية متوسطة لديناميكيات الجزيئات). وتكون نتائج العديد من التجارب على الجزيئات الفردية عبارة عن مسارات ثنائية الحالة .

تسجيل أحادي القناة

مثالان لبيانات (كل منهما حوالي ١٠ ثوانٍ) من تجربة تسجيل قناة أيونية واحدة باستخدام تقنية التثبيت الموضعي. يُمثل المسار العلوي تركيزًا منخفضًا، بينما يُمثل المسار السفلي تركيزًا للمنشط قريبًا من تركيز EC50 لهذه القناة الأيونية . تُشير الانحرافات الهابطة إلى فتح القناة، وفي هذه الحالة، انحرافات تُقارب ٥ بيكو أمبير.

كما هو الحال في مطيافية التألق لجزيء واحد، يمكن استخدام تقنية تسجيل القناة الأيونية المفردة للحصول على معلومات حركية محددة - في هذه الحالة حول وظيفة القناة الأيونية - غير متوفرة عند إجراء تسجيل جماعي، مثل تسجيل الخلية الكاملة. [ 9 ] على وجه التحديد، تتناوب القنوات الأيونية بين فئتين: موصلة وغير موصلة، تختلفان في بنيتهما. لذلك، يمكن قياس الحالة الوظيفية للقنوات الأيونية مباشرةً باستخدام إلكترونيات حساسة بما يكفي، شريطة اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتقليل التشويش. بدورها، يمكن تقسيم كل فئة من هذه الفئات إلى حالة حركية واحدة أو أكثر ذات تأثير مباشر على الوظيفة الأساسية للقناة الأيونية. يمكن أن يوفر إجراء هذا النوع من دراسات الجزيء المفرد في ظل ظروف متغيرة بشكل منهجي (مثل تركيز وبنية المُنشِّط، ومثبط الأيونات و/أو القناة، والطفرات في الأحماض الأمينية للقناة الأيونية) معلومات حول التحول المتبادل بين الحالات الحركية المختلفة للقناة الأيونية. [ 10 ] في نموذج مبسط للقناة الأيونية، توجد حالتان : مفتوحة ومغلقة. ومع ذلك، غالباً ما تكون هناك حاجة إلى حالات أخرى لتمثيل البيانات بدقة، بما في ذلك حالات مغلقة متعددة بالإضافة إلى حالات غير نشطة و/أو حالات غير حساسة، وهي حالات غير موصلة يمكن أن تحدث حتى في وجود محفز. [ 9 ]

وسم الجزيئات الحيوية

يمكن ربط جزيئات الفلوروفور المفردة كيميائيًا بالجزيئات الحيوية، مثل البروتينات أو الحمض النووي، ويمكن تتبع ديناميكيات الجزيئات الفردية من خلال مراقبة المجس الفلوري. ويمكن تتبع الحركات المكانية ضمن حدود رايلي ، إلى جانب التغيرات في شدة الانبعاث و/أو العمر الإشعاعي، والتي غالبًا ما تشير إلى تغيرات في البيئة المحلية. على سبيل المثال، أسفر وسم الجزيئات المفردة عن كمية هائلة من المعلومات حول كيفية تحرك بروتينات الكينيسين الحركية على طول خيوط الأنابيب الدقيقة في الخلايا العضلية. ويكشف تصوير الجزيئات المفردة في الخلايا الحية عن معلومات مثيرة للاهتمام حول ديناميكيات البروتين في بيئته الفيزيولوجية. ويمكن قياس العديد من المعايير الفيزيائية الحيوية المتعلقة بديناميكيات البروتين، مثل معامل الانتشار، ومتوسط ​​مربعات الإزاحة، وزمن الإقامة، ونسبة الجزيئات المرتبطة وغير المرتبطة، وآلية البحث عن الهدف لربط البروتين بموقعه المستهدف في الخلية الحية. [ 11 ]

نقل طاقة الرنين الفلوري لجزيء واحد (FRET)

المقال الرئيسي smFRET .

في نقل طاقة الرنين الفلوري لجزيء واحد ، يُوسَم الجزيء في موضعين (على الأقل). يُركَّز شعاع ليزر على الجزيء لإثارة المجس الأول. عندما يسترخي هذا المجس ويُصدر فوتونًا، فإنه يُحتمل أن يُثير المجس الثاني. تعتمد كفاءة امتصاص الفوتون المنبعث من المجس الأول في المجس الثاني على المسافة بين هذين المجسَّين. وبما أن هذه المسافة تتغير مع الزمن، فإن هذه التجربة تستكشف الديناميكيات الداخلية للجزيء.

مقارنة بالتجارب الجماعية

عند النظر إلى البيانات المتعلقة بالجزيئات الفردية، يمكن عادةً بناء دوال الانتشار، ودوال كثافة احتمالية زمن القفز، من الرتبة الأولى والثانية وما إلى ذلك، بينما في التجارب الجماعية، يُحصل عادةً على اضمحلال دالة الارتباط. [ 12 ] من المعلومات الواردة في هذه الدوال الفريدة (المستمدة من الجزيئات الفردية)، يمكن استخلاص صورة واضحة نسبيًا عن سلوك النظام؛ على سبيل المثال، مخططه الحركي ، أو إمكانات نشاطه، أو شكله ذي الأبعاد المختزلة . [ 13 ] [ 14 ] على وجه الخصوص، يمكن بناء (العديد من خصائص) مسار تفاعل الإنزيم عند مراقبة نشاط إنزيم فردي. [ 15 ] بالإضافة إلى ذلك، وصف العديد من المؤلفين جوانب مهمة تتعلق بتحليل بيانات الجزيئات الفردية - مثل طرق المطابقة واختبارات التجمعات المتجانسة. [ 9 ] من ناحية أخرى، هناك العديد من المشكلات المتعلقة بتحليل بيانات الجزيء الواحد بما في ذلك إنشاء بيئة منخفضة الضوضاء وأطراف الماصة المعزولة، وترشيح بعض المكونات غير المرغوب فيها المتبقية (الضوضاء) الموجودة في التسجيلات، وطول الوقت اللازم لتحليل البيانات (المعالجة المسبقة، والكشف عن الأحداث بشكل لا لبس فيه، ورسم البيانات، وتركيب المخططات الحركية، وما إلى ذلك).

تأثير

أحدثت تقنيات الجزيء المفرد تأثيرًا كبيرًا في مجالات البصريات والإلكترونيات وعلم الأحياء والكيمياء. ففي العلوم البيولوجية، اقتصرت دراسة البروتينات وغيرها من الآليات البيولوجية المعقدة على تجارب جماعية جعلت من المستحيل تقريبًا الملاحظة المباشرة لحركيتها. فعلى سبيل المثال، لم يُفهم فهم آليات المشي مباشرةً إلا بعد استخدام مجهر التألق للجزيء المفرد لدراسة أزواج الكينيسين-ميوسين في الأنسجة العضلية. ومع ذلك، اقتصرت هذه التجارب في معظمها على الدراسات المختبرية، إذ لم تُستغل بعدُ التقنيات المفيدة لتصوير الخلايا الحية استغلالًا كاملًا. إلا أن وعد تصوير الجزيء المفرد في الجسم الحي [ 16 ] يحمل معه إمكانات هائلة للملاحظة المباشرة للجزيئات الحيوية في العمليات الطبيعية. وغالبًا ما تُستخدم هذه التقنيات في دراسات البروتينات ذات النسخ القليلة، والتي لا يزال الكثير منها قيد الاكتشاف. كما وُسِّعت هذه التقنيات لدراسة مجالات في الكيمياء، بما في ذلك رسم خرائط الأسطح غير المتجانسة [ 17 ] .

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 رويتر، ف.، ومينكو، س. (2005). "تجارب المجهر الذري للقوة على جزيء واحد عند السطح البيني بين الطورين الصلب والسائل: التكوين الموضعي لسلاسل البوليمرات الإلكتروليتية المرنة الممتزة". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 127 (45): 15688-15689 . doi : 10.1021/ja0558239 . PMID 16277495 . 
  2. ↑ جويت إم إف، تيري دي إس، واسرمان إم آر، تشو زد، ألتمان آر بي، تشنغ كيو، بلانشارد إس سي (يونيو 2014). "المستقبل المشرق لتصوير التألق الجزيئي الأحادي" . مجلة الرأي الحالي في الكيمياء الحيوية . 20 : 103-111 . doi : 10.1016/j.cbpa.2014.05.010 . PMC 4123530. PMID 24956235 .  
  3. ↑ WE Moerner و L. Kador، الكشف البصري والتحليل الطيفي للجزيئات المفردة في مادة صلبة ، Phys. Rev. Lett. 62، 2535 - 2538 (1989)
  4. ↑ M. Orrit and J. Bernard, Single pentacene molecules detected by fluorescence excitation in a p -terphenyl crystal , Phys. Rev. Lett. 65, 2716–2719 (1990)
  5. ↑ كنيب، كاترين ؛ وانغ، يانغ؛ كنيب، هارالد؛ بيرلمان، ليف ت.؛ إيتزكان، إيرفينغ؛ داساري، راماتشاندرا ر.؛ فيلد، مايكل س. (1997-03-03). "الكشف عن الجزيئات المفردة باستخدام تشتت رامان المحسن سطحيًا (SERS)" . رسائل المراجعة الفيزيائية . 78 (9): 1667-1670 . doi : 10.1103/PhysRevLett.78.1667 . ISSN 0031-9007 . 
  6. ↑ ني، شومينغ؛ إيموري، ستيفن ر. (21 فبراير 1997). "استكشاف الجزيئات المفردة والجسيمات النانوية المفردة باستخدام تشتت رامان المحسن سطحيًا" . مجلة ساينس . 275 (5303): 1102-1106 . doi : 10.1126/science.275.5303.1102 . ISSN 0036-8075 . 
  7. 1 2 موروجيسابيللاي وآخرون (2014). "يوفر ربط الحمض النووي وتكوين الحلقات بواسطة HMO1 آلية لتثبيت الكروماتين الخالي من النيوكليوسومات" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 42 (14): 8996-9004 . doi : 10.1093/nar/ gku635 . PMC 4132745. PMID 25063301 .   
  8. 1 2 موروجيسابيللاي د، وآخرون (2016). "دراسات الجزيء المفرد لبروتينات انحناء الحمض النووي ذات البنية عالية الحركة من المجموعة ب" . مجلة بيوفيز ريفيو . 9 (1): 17-40 . doi : 10.1007/s12551-016-0236-4 . PMC 5331113. PMID 28303166 .   
  9. 1 2 3 ب. ساكمان وإي.نيهر، تسجيل أحادي القناة ، ISBN 9780306414190(1995).
  10. ↑ بيكونيس، أ؛ كيونغ، إ؛ تيمبي، إل سي (2001). "تغير الموصلية الوحدوية في Kir2.1 وفي قنوات البوتاسيوم القلبية المقومة للداخل" . مجلة الفيزياء الحيوية . 81 (4): 2035-2049 . doi : 10.1016/S0006-3495(01)75853-5 . PMC 1301677 . 
  11. ↑ بود، نيتيش كومار؛ باليوال، شيتال؛ داي، بارثا؛ داس، أيان؛ مورجاريا، شروتي؛ ميهتا، غونجان (5 نوفمبر 2021). "التصوير الجزيئي الأحادي في الخميرة داخل الجسم الحي: التطبيقات والتحديات". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 433 (22) 167250. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167250 . PMID 34537238. S2CID 237573437 .  
  12. ↑ أ. فلومنبوم، ج. كلافتير، و أ. سزابو، ما الذي يمكن تعلمه من مسارات الجزيئات المفردة ثنائية الحالة؟ مؤرشف في 14 يناير 2012، في أرشيف الإنترنت ، مجلة الفيزياء الحيوية 88، 3780-3783 (2005) ؛ arXiv : q-bio/0502006
  13. ↑ O. Flomenbom، و RJ Silbey، استخدام محتوى المعلومات في مسارات الحالة الثنائية مؤرشفة في 14 يناير 2012، في Wayback Machine ، وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 103، 10907-10910 (2006) .
  14. ↑ O. Flomenbom, and RJ Silbey, Toolbox for analyzing finite two-state trajectories, Phys. Rev. E 78, 066105 (2008) ; arXiv:0802.1520 .
  15. ↑ O. Flomenbom, K. Velonia, D. Loos, et al., التحلل الأسي الممتد والارتباطات في النشاط التحفيزي لجزيئات الليباز المفردة المتذبذبة. مؤرشف في 14 يناير 2012، في Wayback Machine ، Proc. Natl. Acad. Sci. US 102، 2368-2372 (2005) .
  16. ↑ زان، هونغ؛ ستانسياوسكاس، راموناس؛ ستيغلوهر، كريستيان؛ كيوماني-ديزون، كيفن؛ جوسبان، مايل؛ بيسيرو، جان لويس؛ بينو، فابيان (2014). "التصوير الجزيئي الأحادي في الجسم الحي يُحدد ديناميكيات متغيرة لقنوات الكالسيوم في دودة C. elegans الطافرة في جين الديستروفين" . Nature Communications . 5 ncomms5974. Bibcode : 2014NatCo...5.4974Z . doi : 10.1038/ncomms5974 . PMC 4199201. PMID 25232639 .  
  17. ↑ والدر، ر.؛ نيلسون، ن.؛ شوارتز، د.ك. (2011). "رسم خرائط سطحية فائقة الدقة باستخدام مسارات المجسات الجزيئية" . نيتشر كوميونيكيشنز . 2 : 515. Bibcode : 2011NatCo...2..515W . doi : 10.1038/ncomms1530 . PMID 22044994 .