فحص الحمض النووي المتفرع

📅 آخر تحديث: ٣٠ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣٠ يوليو ٢٠٢٦
الموسوعة الحرة

في علم الأحياء، يُعد اختبار الحمض النووي المتفرع اختبارًا لتضخيم الإشارة (على عكس اختبار تضخيم الهدف) يُستخدم للكشف عن جزيئات الحمض النووي . [ 1 ]

طريقة

يبدأ اختبار الحمض النووي المتفرع بطبق أو دعامة صلبة أخرى (مثل شريط غمس بلاستيكي). يُرصّ الطبق بجزيئات صغيرة من الحمض النووي أحادي السلسلة (أو سلاسل) تبرز في المحلول. تُعرف هذه الجزيئات بجزيئات الحمض النووي المُستقبِلة. بعد ذلك، يُضاف جزيء حمض نووي مُطيل. يحتوي كل مُطيل على نطاقين؛ أحدهما يتهجن مع جزيء الحمض النووي المُستقبِل، والآخر يبرز فوق السطح. للمُطيل غرضان: أولًا، يُوفر مساحة سطح أكبر لجزيئات الحمض النووي المستهدفة للارتباط، وثانيًا، يُتيح تكييف الاختبار بسهولة للكشف عن مجموعة متنوعة من جزيئات الحمض النووي المستهدفة.

بمجرد تثبيت جزيئات الالتقاط والتمديد وتكوين روابطها، يمكن إضافة العينة. سترتبط الجزيئات المستهدفة في العينة بجزيء التمديد. ينتج عن ذلك قاعدة مُطعّمة بمجسات الالتقاط، التي تُهجّن بدورها مع مجسات التمديد، والتي بدورها تُهجّن مع الجزيئات المستهدفة.

في هذه المرحلة، يحدث تضخيم الإشارة. تُضاف جزيئة DNA موسّعة للعلامة، تحتوي على نطاقين (مشابهة للموسّع الأول). تتهجن موسّعة العلامة مع الهدف ومع جزيئة مُضخِّم أولي. تحتوي جزيئة المُضخِّم الأولي على نطاقين: أولًا، ترتبط بموسّعة العلامة، وثانيًا، ترتبط بجزيئة المُضخِّم. مثال على جزيئة المُضخِّم هو سلسلة أوليغونوكليوتيدية مرتبطة بإنزيم الفوسفاتاز القلوي .

يمكن تمثيل العملية تخطيطيًا على النحو التالي:

القاعدة ← مسبار الالتقاط ← الموسع ← الهدف ← موسع العلامة ← المضخم الأولي ← المضخم

عملية

تُستخدم عدة جزيئات قصيرة مختلفة من الحمض النووي أحادي السلسلة ( أوليغونوكليوتيدات ) في فحص الحمض النووي المتفرع. يرتبط أوليغونوكليوتيد الالتقاط وأوليغونوكليوتيد التمديد بالحمض النووي المستهدف، ويثبتانه على دعامة صلبة. ثم يكشف أوليغونوكليوتيد الوسم والحمض النووي المتفرع عن الحمض النووي المستهدف المثبت. يُسهّل تثبيت الهدف على دعامة صلبة عملية الغسل المكثفة، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة. بعد ارتباط الهدف بالدعامة الصلبة، يمكن الكشف عنه بواسطة الحمض النووي المتفرع المرتبط بإنزيم (مثل الفوسفاتاز القلوي). يرتبط الحمض النووي المتفرع بالحمض النووي للعينة عن طريق تهجين نوعي في مناطق غير مشغولة بهجائن الالتقاط. يسمح تفرع الحمض النووي بتزيين الحمض النووي بكثافة عالية بالإنزيم، وهو أمر بالغ الأهمية لحساسية الفحص العالية. يحفز الإنزيم تفاعل الركيزة، مما يُنتج ضوءًا (يمكن الكشف عنه باستخدام مقياس الإضاءة). تزداد كمية الضوء المنبعث مع زيادة كمية الحمض النووي المحدد الموجود في العينة. ويختلف تصميم الحمض النووي المتفرع وطريقة تهجينه مع الحمض النووي المراد دراسته بين الأجيال المختلفة من اختبار الحمض النووي المتفرع. [ 2 ]

أجيال

يستخدم الجيل الأول من اختبار الحمض النووي المتفرع (bDNA) جزيء حمض نووي متفرع مرتبطًا مباشرةً بالعديد من جزيئات "مسبار الفوسفاتاز القلوي" (المضخم)، والذي يرتبط بدوره بموسع العلامة ثم بالجزيء المستهدف. ويمكنه تحديد كمية ما بين 10000 و10000000 جزيء بدقة. [ 2 ]

يُضيف الجيل الثاني من هذا التحليل جزيئًا "مُضخِّمًا أوليًا" لزيادة الحساسية. يرتبط هذا المُضخِّم الأولي بمُوسِّع العلامة وعدة نسخ من المُضخِّم، مما يجعل الإشارة أقوى بكثير. ويمكنه الكشف عن ما يصل إلى 500 جزيء. [ 2 ]

يستخدم اختبار الجيل الثالث، أو ما يُعرف بـ"النظام 8"، بقايا الأيزوغوانين والأيزوسيتوزين لمنع التهجين غير النوعي بين المُضخِّم والمُضخِّم الأولي والهدف: من المفترض أن ترتبط هذه الأجزاء فقط بمُوسِّع العلامة، ولكن عند زيادة طولها، فإنها ترتبط أيضًا بالهدف، مما يُسبب نتائج إيجابية خاطئة. من خلال منع التهجين غير النوعي، يُمكن استخدام نسخ أطول من هذين الجزيئين، مما يسمح بتضخيم الإشارة بشكل أكبر، وحد كشف يصل إلى 100 نسخة من الحمض النووي الريبي لفيروس نقص المناعة البشرية لكل مل من الدم. [ 2 ] طُوِّر هذا الاختبار تحت مظلة شركة كايرون للتشخيص في عام 1997، وكانت شركة باير للتشخيص تمتلكه في الفترة ما بين 2005 و 2006 [ 3 ] تحت اسم تقنية "كوانتيبلكس" أو "فيرسانت". [ 4 ] اعتبارًا من عام 2025، يبدو أن علامة "فيرسانت" التجارية مملوكة لشركة سيمنز. [ 5 ]

لا يوجد تعريف متفق عليه عالميًا لتحليل الجيل الرابع، لكن هذا لا يعني توقف التحسينات. على سبيل المثال، تزيد براءة اختراع صدرت عام 2005 من الخصوصية بما يكفي لاستخدامها في الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة . [ 3 ]

الاستخدامات والمزايا

يمكن استخدام هذا التحليل للكشف عن أنواع عديدة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) وتحديد كميتها. في هذا التحليل، يُخلط الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتفرع مع العينة المراد فحصها. ويتم الكشف باستخدام طريقة غير مشعة، ولا يتطلب تضخيمًا مسبقًا للحمض النووي المراد الكشف عنه. يعتمد التحليل كليًا على التهجين. تُستخدم الإنزيمات للإشارة إلى مدى التهجين، ولكنها لا تُستخدم لمعالجة الأحماض النووية. وبالتالي، يمكن الكشف عن كميات صغيرة من الحمض النووي وتحديد كميتها دون الحاجة إلى خطوة النسخ العكسي (في حالة الحمض النووي الريبوزي) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR ). يمكن إجراء هذا التحليل كتحليل عالي الإنتاجية، على عكس تحليل نورثرن الكمي أو تحليل الحماية من إنزيمات الريبونيوكلياز، اللذين يتطلبان جهدًا كبيرًا، وبالتالي يصعب إجراؤهما على عدد كبير من العينات. أما التقنية الرئيسية الأخرى عالية الإنتاجية المستخدمة في تحديد كمية جزيئات الحمض النووي الريبوزي المحددة فهي تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، بعد النسخ العكسي للحمض النووي الريبوزي إلى الحمض النووي الريبوزي المكمل (cDNA) .

على الرغم من عدم تضخيم المادة الأولية مسبقًا، فإن فحوصات الحمض النووي المتفرع من الجيل الثالث (1997) قادرة على الكشف عن أقل من 100 نسخة من الحمض النووي الريبي لفيروس نقص المناعة البشرية لكل مل من الدم. [ 2 ] اعتبارًا من عام 2006، كانت الطرق الوحيدة المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لقياس الحمل الفيروسي لفيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد الوبائي سي تعتمد على الحمض النووي المتفرع، بما في ذلك أحدث جيل من الحمض النووي المتفرع آنذاك. [ 4 ] وقد تمت الموافقة عليه لاحقًا لقياس الحمل الفيروسي لفيروس التهاب الكبد الوبائي بي أيضًا، على الأقل في هولندا. [ 5 ]

تسوّق شركة دياكارتا نسخة من الجيل الثالث (على الأقل) من تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) تحت اسم "isobDNA". وقد تمت الموافقة على استخدامها للكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) لجين الورم الحليمي البشري E6 / E7 ، والحمض النووي الحر المتداول الذي يشير إلى الضرر الناتج عن العلاج الإشعاعي، [ 6 ] وحتى كاختبار متاح بدون وصفة طبية للكشف عن الدم الخفي في البراز. [ 7 ]

استخدمت دراسة نُشرت عام 2021 في مجلة Nature Scientific Reports مستويات الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) كمؤشر على فعالية العلاج الكيميائي في علاج السرطانات المتقدمة، واستخدمت نهج الحمض النووي المتفرع لتضخيم إشارة الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) الضئيل الموجود. [ 8 ]

انظر أيضاً

ملاحظات ومراجع

  1. ↑ عارفين، سيتي نور فاتح الله أحمد (2013). "الحمض النووي المتفرع: تقنية جديدة للتشخيص الجزيئي في دراسات العظام" . تحديثات البحوث في العلوم الطبية (RUMeS) . 1 (1): 27-29 .
  2. 1 2 3 4 5 كولينز، إم إل؛ إيرفين، بي؛ تاينر، دي؛ فاين، إي؛ زياتي، سي؛ تشانغ، سي؛ هورن، تي؛ أهلي، دي؛ ديتمير، جيه؛ شين، إل بي؛ كولبيرغ، جيه؛ بوشنيل، إس؛ أورديا، إم إس؛ هو، دي دي (1997). "اختبار تضخيم إشارة الحمض النووي المتفرع لتحديد كمية أهداف الحمض النووي التي تقل عن 100 جزيء/مل" . أبحاث الأحماض النووية . 25 (15): 2979-2984 . doi : 10.1093 / nar/25.15.2979 . PMC 146852. PMID 9224596 .  
  3. 1 2 Zheng, Minxue; Ahle, David; Warner, Brian; Wu, Ming; Chang, Chu-An (17 أكتوبر 2007). "تسلسلات عالمية متعامدة للغاية للاستخدام في فحوصات الأحماض النووية" .
  4. 1 2 تسونغاليس، غريغوري ج. (سبتمبر 2006). "تقنية الحمض النووي المتفرع في التشخيص الجزيئي". المجلة الأمريكية لعلم الأمراض السريرية . 126 (3): 448-453 . doi : 10.1309/90BU6KDXANFLN4RJ .
  5. 1 2 "VERSANT HBV bDNA Assay" . www.siemens-healthineers.com (باللغة الهولندية).
  6. ↑ "تقنية تضخيم إشارة الحمض النووي المستهدف" . شركة ديا كارتا .
  7. ↑ "شركة DiaCarta تطلق اختبار الدم الخفي في البراز للاستخدام المنزلي بدون وصفة طبية، مكملاً بذلك اختبار ColoScape الخاص بها" . BioSpace . 5 ديسمبر 2023.
  8. ↑ تشو، شياورونغ؛ لي، تشن تشن؛ تشانغ، تشاو؛ لي، دانيال ي.؛ دو، جينوي؛ دينغ، بينغ؛ مينغ، هايان؛ شو، هوي؛ لي، رونغلي؛ هو، إيفي؛ تشانغ، أيغوو (2021-04-07). " حركية الحمض النووي الخالي من الخلايا في البلازما تتنبأ بالاستجابة السريرية لدى مرضى سرطان الرئة ذي الخلايا غير الصغيرة" . التقارير العلمية . 11 (1): 7633. Bibcode : 2021NatSR..11.7633Z . doi : 10.1038/s41598-021-85797-z . ISSN 2045-2322 . PMC 8027214. PMID 33828112 .