كريستوف كريمر

انخرط كريمر مبكرًا في تطوير تقنيات المجهر الضوئي القائمة على الليزر . تعود جذور الأفكار الأولى إلى سنوات دراسته العليا في سبعينيات القرن الماضي. بالتعاون مع شقيقه توماس كريمر ، الأستاذ الحالي (رئيس قسم) الأنثروبولوجيا وعلم الوراثة البشرية في جامعة لودفيغ ماكسيميليان في ميونخ، اقترح كريستوف كريمر تطوير مجهر مسح ليزري رباعي باي (4π) قائم على الهولوغرام . تقوم الفكرة الأساسية على تركيز ضوء الليزر من جميع الجوانب (زاوية فراغية 4π) في بقعة قطرها أصغر من بؤرة الليزر التقليدية، ثم مسح الجسم باستخدام هذه البقعة. بهذه الطريقة، يُفترض أن يكون من الممكن تحقيق دقة بصرية محسّنة تتجاوز الحد التقليدي البالغ 200 نانومتر تقريبًا جانبيًا و600 نانومتر محوريًا. ^{[ 11 ] [ 12 ]} مع ذلك، استنتجت الدراسة المنشورة عام 1978 ^{[ 13 ]} استنتاجًا فيزيائيًا خاطئًا (أي بقعة ضوئية نقطية)، وأغفلت تمامًا الزيادة في الدقة المحورية باعتبارها الفائدة الحقيقية لإضافة الجانب الآخر من الزاوية المجسمة. ^{[ 14 ]} منذ عام 1992، طُوِّرت تقنية المجهر 4Pi على يد ستيفان هيل (معهد ماكس بلانك للكيمياء الفيزيائية الحيوية، غوتينغن) لتصبح عملية تصوير عالية الكفاءة وعالية الدقة، باستخدام عدستين موضوعيتين للمجهر ذواتي فتحة عددية عالية متقابلتين. ^{[ 15 ] [ 16 ]}  

في أوائل سبعينيات القرن الماضي، ابتكر الأخوان جهازًا للتشعيع المجهري بالليزر فوق البنفسجي ، والذي مكّن لأول مرة من تشعيع جزء صغير فقط من الخلية الحية بطريقة مضبوطة عند ذروة امتصاص الحمض النووي (257  نانومتر). ^{[ 17 ]} وقد حلّ هذا الجهاز محل التشعيع الجزئي التقليدي بالأشعة فوق البنفسجية الذي استُخدم لأكثر من 60 عامًا. وبهذه الطريقة، أصبح من الممكن لأول مرة إحداث تغييرات في الحمض النووي بطريقة مركزة (أي في مواقع محددة مسبقًا في نواة الخلايا الحية) دون المساس بقدرة الخلايا على الانقسام والبقاء. ويمكن تشعيع مناطق خلوية صغيرة جدًا، وبالتالي تقدير ديناميكيات الجزيئات الكبيرة (الحمض النووي) الموجودة فيها كميًا. علاوة على ذلك، وبفضل السرعة العالية للعملية التي تستخدم أوقات تشعيع لأجزاء من الثانية، أصبح من الممكن تشعيع حتى عضيات الخلية المتحركة . شكّل هذا التطور أساسًا لتجارب مهمة في مجال أبحاث بنية الجينوم (إثبات وجود ما يُسمى بمناطق الكروموسومات في خلايا الثدييات الحية )، وأدى بعد بضع سنوات (1979/1980) إلى تعاون ناجح مع عالمة الأحياء كريستيان نوسلين-فولهارد ( معهد ماكس بلانك لبيولوجيا النمو ، توبنغن ). في هذا التعاون، استخدم كريمر جهازه الخاص بالتشعيع المجهري بالليزر فوق البنفسجي لإحداث تغييرات خلوية في المراحل اليرقية المبكرة لذبابة الفاكهة دروسوفيلا ميلانوغاستر . ^{[ 18 ] [ 19 ]}

استنادًا إلى الخبرة المكتسبة في تصميم وتطبيق جهاز التشعيع المجهري بالليزر فوق البنفسجي، صمّم الأخوان كريمر عام ١٩٧٨ عملية مسح ليزري تمسح نقطة بنقطة السطح ثلاثي الأبعاد لجسم ما باستخدام شعاع ليزر مركّز، وتُنشئ الصورة الكلية إلكترونيًا بوسائل مشابهة لتلك المستخدمة في المجاهر الإلكترونية الماسحة. ^{[ ١١ ]} هذه الخطة لبناء مجهر المسح الليزري متحد البؤر (CSLM)، الذي جمع لأول مرة بين طريقة المسح الليزري والكشف ثلاثي الأبعاد عن الأجسام البيولوجية الموسومة بعلامات فلورية، هي التي أهلت كريمر لشغل منصب الأستاذية في جامعة هايدلبرغ. خلال العقد التالي، تطورت تقنية المجهر الفلوري متحد البؤر إلى حالة نضج تقني كامل، لا سيما بفضل فرق بحثية تعمل في جامعة أمستردام ومختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي (EMBL) في هايدلبرغ وشركائهم في الصناعة. في السنوات اللاحقة، تم اعتماد هذه التقنية على نطاق واسع من قبل المختبرات البيولوجية الجزيئية والطبية الحيوية ، ولا تزال حتى يومنا هذا المعيار الذهبي فيما يتعلق بالمجهر الضوئي ثلاثي الأبعاد ذي الدقة التقليدية.

يهدف المجهر في كثير من الأحيان إلى تحديد حجم الأجسام الصغيرة الفردية. ولا يستطيع المجهر الفلوري التقليدي تحديد الأحجام إلا في حدود دقة الرؤية البصرية  التقليدية التي تبلغ حوالي 200 نانومتر (جانبيًا). بعد أكثر من 20 عامًا من تقديم طلب براءة اختراع 4π، ^{[ 11 ] [ 20 ]} عاد كريستوف كريمر إلى مشكلة حد الانعراج. وباستخدام مجهر Vertico SMI، تمكن من تطبيق تقنياته المختلفة للدقة الفائقة، بما في ذلك SMI وSPDM وSPDMphymod وLIMON. وتُستخدم هذه الطرق بشكل أساسي في التطبيقات الطبية الحيوية ^{[ 21 ].}