نظام الإبلاغ GUS

نظام GUS المُخبِر ( GUS : بيتا-غلوكورونيداز ) هو نظام جيني مُخبِر ، ذو فائدة خاصة في البيولوجيا الجزيئية النباتية ^{[ 1 ]} وعلم الأحياء الدقيقة. ^{[ 2 ]} تتوفر أنواع عديدة من فحوصات جين GUS المُخبِر ، وذلك بحسب الركيزة المستخدمة. ويُشير مصطلح تلوين GUS إلى أكثر هذه التقنيات شيوعًا، وهي تقنية كيميائية نسيجية .

تهدف هذه التقنية إلى تحليل نشاط مُحفِّز نسخ الجين (من حيث التعبير عن جين مُخبِر يخضع للتحكم التنظيمي لهذا المُحفِّز) إما كميًا، من خلال قياس النشاط، أو نوعيًا (تشغيل/إيقاف) عبر تصوير نشاطه في خلايا أو أنسجة أو أعضاء مختلفة. تستخدم هذه التقنية جين uidA من بكتيريا الإشريكية القولونية ، الذي يُشفِّر إنزيم بيتا-غلوكورونيداز ؛ ^{[ 3 ]} هذا الإنزيم، عند حضانته مع ركائز مُحدَّدة عديمة اللون أو غير مُتألِّقة ، يُمكنه تحويلها إلى نواتج مُلوَّنة أو مُتألِّقة ثابتة . ^{[ 4 ]} يُشير وجود اللون الناتج عن إنزيم بيتا-غلوكورونيداز إلى موضع التعبير النشط للجين. وبهذه الطريقة، يُنتج النشاط القوي للمُحفِّز تلوينًا كثيفًا، بينما يُنتج النشاط الضعيف تلوينًا أقل.

يمكن أيضًا دمج جين uidA مع جين مُراد دراسته، مما يُنتج جينًا مُدمجًا . سيؤدي إدخال جين uidA إلى إنتاج GUS، والذي يمكن الكشف عنه باستخدام أنواع مختلفة من الغلوكورونيدات كركائز. ^{[ 4 ]}

توجد أنواع مختلفة من الغلوكورونيدات التي يمكن استخدامها كركائز لإنزيم بيتا-غلوكورونيداز، وذلك بحسب نوع الكشف المطلوب ( الكيميائي النسيجي ، الطيفي الضوئي ، الفلوري ). الركيزة الأكثر شيوعًا للتلوين الكيميائي النسيجي باستخدام إنزيم غلوكورونيداز (GUS) هي 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل غلوكورونيد ( X-Gluc ). يتحلل X-Gluc بواسطة إنزيم GUS إلى الناتج 5،5'-ثنائي برومو-4،4'-ثنائي كلورو-إنديجو (diX-indigo). يظهر DiX-indigo باللون الأزرق، ويمكن رؤيته باستخدام المجهر الضوئي. ^{[ 5 ]} هذه العملية مماثلة لتحلل X-gal بواسطة إنزيم بيتا-غالاكتوزيداز ^{[ 5 ]} لإنتاج خلايا زرقاء، كما هو شائع في فحوصات الجينات المُبلِّغة البكتيرية.

أما بالنسبة لأنواع الكشف الأخرى، فإن الركائز الشائعة هي p-نيتروفينيل β-D-غلوكورونيد للفحص الطيفي الضوئي و4 -ميثيل أومبيليفيريل-بيتا-D-غلوكورونيد (MUG) للفحص الفلوري. ^{[ 6 ]}

طُوِّر هذا النظام في الأصل على يد ريتشارد أنتوني جيفرسون خلال دراسته للدكتوراه في جامعة كولورادو في بولدر . ^{[ 7 ]} وقد قام بتكييف هذه التقنية لاستخدامها مع النباتات أثناء عمله في معهد تربية النباتات في كامبريدج ، بين عامي 1985 و1987. ^{[ 1 ]} ومنذ ذلك الحين، استخدمت آلاف المختبرات هذا النظام، مما جعله أحد أكثر الأدوات استخدامًا في علم الأحياء الجزيئي للنباتات، كما يتضح من آلاف الاستشهادات في الأدبيات العلمية. ^{[ 7 ]}

يُعدّ الكائن الحي مناسبًا لاختبار GUS إذا كان يفتقر إلى نشاط إنزيم بيتا-غلوكورونيداز الطبيعي أو إذا كان نشاطه منخفضًا جدًا ( نشاط أساسي ). لهذا السبب، لا يُعدّ الاختبار مفيدًا في معظم الفقاريات والعديد من الرخويات . ^{[ 6 ]} نظرًا لعدم وجود نشاط قابل للكشف لإنزيم GUS في النباتات الراقية ، والطحالب ، والأعشاب البحرية ، والسرخسيات ، والفطريات ، ومعظم البكتيريا ، ^{[ 6 ]} يُعدّ الاختبار مثاليًا لدراسات التعبير الجيني في هذه الكائنات، ويُعتبر الجين المُبلِّغ المُفضَّل في علم النبات.

لا يتطلب اختبار GUS وجود أي عوامل مساعدة أو أيونات لكي يعمل. يمكن لإنزيم بيتا-غلوكورونيداز أن يعمل ضمن نطاق واسع من قيم الأس الهيدروجيني، وهو مقاوم إلى حد كبير للتثبيط الحراري. ^{[ 8 ]} ومع ذلك، فإن GUS عرضة للتثبيط بواسطة بعض أيونات المعادن الثقيلة، مثل Cu2 ⁺ وZn2 ⁺ .

بالإضافة إلى ذلك، فإن تفسير نتائج التحليل محدودٌ بسبب حركة صبغة diX-indigo داخل الخلية. إذ يمكن لهذه الصبغة أن ترتبط بالدهون وتنتشر بعيدًا عن موقع نشاط الإنزيم، مما يُشير إلى غياب التموضع السيتوبلازمي وعدم انتظام اختراق الركيزة. وهذا قد يؤدي إلى تفسير خاطئ لتموضع بروتين GUS. ^{[ 9 ]} على الرغم من غياب التموضع الخلوي، فقد لوحظ التموضع النووي لبروتين GUS بشكلٍ واضح. ^{[ 10 ]} يمكن إجراء تحليلات GUS في وجود فيريسيانيد البوتاسيوم لمنع انتشار الصبغة. ^{[ 5 ]}

لا يُعد نظام GUS النظام الوحيد المتاح لتحليل نشاط المحفزات الجينية. فهناك أنظمة منافسة أخرى تعتمد على جينات مثل لوسيفيراز ، وبروتين GFP ، وبيتا-جالاكتوزيداز ، وكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز (CAT)، والفوسفاتاز القلوي . ويعتمد اختيار النظام المناسب بشكل أساسي على الكائن الحي المدروس وتقنيات التصوير والمجهر المتاحة للمختبرات التي تُجري البحث.

يمكن استخدام اختبار GUS، بالإضافة إلى أنظمة الجينات المُبلِّغة الأخرى، في أنواع أخرى من الدراسات غير اختبار نشاط المُحفِّز التقليدي. وقد استُخدمت أنظمة الجينات المُبلِّغة لتحديد كفاءة أنظمة توصيل الجينات، وتحديد الموقع داخل الخلية لمنتج الجين، والكشف عن تفاعلات البروتين-بروتين أو البروتين-DNA، وكفاءة إشارات بدء الترجمة، ونجاح جهود الاستنساخ الجزيئي.