مكتبة (علم الأحياء)
في علم الأحياء الجزيئي ، تُعرَّف المكتبة بأنها مجموعة من أجزاء المادة الوراثية التي تُخزَّن وتُستنسخ في مجتمع من الكائنات الدقيقة من خلال عملية الاستنساخ الجزيئي . توجد أنواع مختلفة من مكتبات الحمض النووي، منها مكتبات الحمض النووي المكمل (المُشكَّلة من الحمض النووي الريبوزي المُستنسخ عكسيًا )، والمكتبات الجينومية (المُشكَّلة من الحمض النووي الجينومي)، ومكتبات الطفرات العشوائية (المُشكَّلة عن طريق تخليق الجينات من الصفر حيث تُدمج نيوكليوتيدات أو كودونات بديلة). تُعد تقنية مكتبات الحمض النووي ركيزة أساسية في علم الأحياء الجزيئي والهندسة الوراثية وهندسة البروتين ، وتعتمد تطبيقات هذه المكتبات على مصدر أجزاء الحمض النووي الأصلية. توجد اختلافات في نواقل الاستنساخ والتقنيات المُستخدمة في تحضير المكتبات، ولكن بشكل عام، تُدخَل كل قطعة من الحمض النووي بشكل فريد في ناقل استنساخ، ثم تُنقل مجموعة جزيئات الحمض النووي المُعاد تركيبها إلى مجتمع من البكتيريا ( مكتبة الكروموسوم الاصطناعي البكتيري أو BAC) أو الخميرة، بحيث يحتوي كل كائن حي في المتوسط على بنية واحدة (ناقل + جزء مُدخَل). مع نمو مجموعة الكائنات الحية في المزارع، يتم نسخ جزيئات الحمض النووي الموجودة بداخلها ونشرها (وبالتالي، "استنساخها").
مصطلحات
يمكن أن يشير مصطلح "المكتبة" إلى مجموعة من الكائنات الحية، يحمل كل منها جزيء DNA تم إدخاله في ناقل استنساخ، أو بدلاً من ذلك إلى مجموعة جميع جزيئات الناقل المستنسخة.
مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA)
تمثل مكتبة الحمض النووي المكمل (cDNA) عينة من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA ) المستخلص من مصدر معين (سواءً كان مجموعة من الخلايا، أو نسيجًا معينًا، أو كائنًا حيًا كاملًا)، والذي تم تحويله مرة أخرى إلى قالب DNA باستخدام إنزيم النسخ العكسي . وبالتالي، فهي تمثل الجينات التي كانت تُنسخ بنشاط في ذلك المصدر المحدد في ظل الظروف الفيزيولوجية أو التطورية أو البيئية التي كانت سائدة عند استخلاص الحمض النووي الريبوزي الرسول. يمكن إنشاء مكتبات الحمض النووي المكمل باستخدام تقنيات تُعزز استنساخ نسخ كاملة الطول، أو في ظل ظروف تُنتج أجزاءً أقصر تُستخدم لتحديد " علامات التسلسل المعبر عنها ".
تُعد مكتبات الحمض النووي التكميلي مفيدة في علم الوراثة العكسي، لكنها لا تمثل سوى جزء صغير جدًا (أقل من 1٪) من الجينوم الكلي في كائن حي معين.
تشمل تطبيقات مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA) ما يلي:
- اكتشاف جينات جديدة
- استنساخ جزيئات الحمض النووي التكميلي كاملة الطول لدراسة وظيفة الجينات في المختبر
- دراسة مجموعة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المعبر عنه في الخلايا أو الأنسجة المختلفة
- دراسة التضفير البديل في الخلايا أو الأنسجة المختلفة
المكتبات الجينومية
المكتبة الجينومية هي مجموعة من النسخ المستنسخة التي تمثل مجتمعةً الجينوم الكامل لكائن حي معين. يعتمد عدد النسخ المستنسخة التي تُشكل المكتبة الجينومية على عاملين: (1) حجم الجينوم المعني، و(2) حجم الإدخال الذي يتحمله نظام ناقل الاستنساخ المستخدم . ولأغراض عملية، لا يُعد مصدر نسيج الحمض النووي الجينومي مهمًا، لأن كل خلية في الجسم تحتوي على حمض نووي متطابق تقريبًا (مع بعض الاستثناءات).
تشمل تطبيقات المكتبات الجينومية ما يلي:
- تحديد التسلسل الجينومي الكامل لكائن حي معين (انظر مشروع الجينوم )
- يُستخدم كمصدر لتسلسل الجينوم لإنتاج حيوانات معدلة وراثيًا من خلال الهندسة الوراثية
- دراسة وظيفة التسلسلات التنظيمية في المختبر
- دراسة الطفرات الجينية في الأنسجة السرطانية
مكتبات الطفرات الاصطناعية
على النقيض من أنواع المكتبات المذكورة أعلاه، توجد طرق اصطناعية متنوعة لإنشاء مكتبات من الجينات المتغيرة. [ 1 ] يمكن إدخال التباين في جميع أنحاء الجين عشوائيًا إما عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ ، [ 2 ] أو عن طريق إعادة تركيب الحمض النووي لإعادة دمج أجزاء من جينات متشابهة معًا، [ 3 ] أو عن طريق الطرق القائمة على العناصر المتحركة لإدخال حذف أو إدخال . [ 4 ] بدلاً من ذلك، يمكن استهداف الطفرات لكودونات محددة أثناء التخليق الحيوي أو الطفرات التشبعية لإنشاء طفرة نقطية واحدة أو أكثر لجين ما بطريقة مضبوطة. [ 5 ] ينتج عن ذلك خليط من جزيئات الحمض النووي المزدوجة التي تمثل متغيرات الجين الأصلي.
يمكن بعد ذلك فحص البروتينات المُعبَّر عنها من هذه المكتبات بحثًا عن متغيرات تُظهر خصائص مُلائمة (مثل الاستقرار، أو قوة الارتباط، أو النشاط الإنزيمي). ويمكن تكرار هذه العملية في دورات من إنشاء متغيرات جينية وفحص نواتج التعبير في عملية تطور مُوجَّهة . [ 1 ]
نظرة عامة على تقنيات تحضير مكتبة الحمض النووي التكميلي (cDNA)
استخلاص الحمض النووي
عند إنشاء مكتبة mRNA (أي باستخدام نسخ cDNA)، توجد عدة بروتوكولات ممكنة لعزل mRNA كامل الطول. لاستخلاص الحمض النووي لمكتبات الحمض النووي الجينومي (المعروف أيضًا باسم gDNA)، قد يكون تحضير الحمض النووي المصغر مفيدًا.
تحضير الإدخال
تتطلب مكتبات الحمض النووي التكميلي (cDNA) عناية فائقة لضمان التقاط نسخ كاملة من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) على شكل cDNA (والتي سيتم إدخالها لاحقًا في النواقل). ولهذا السبب، صُممت عدة بروتوكولات لتحسين عملية تخليق الشريط الأول والثاني من cDNA، ولزيادة احتمالية الاستنساخ الموجه في الناقل.
يتم توليد شظايا الحمض النووي الجينومي من الحمض النووي الجينومي المستخلص باستخدام إنزيمات القطع المتكررة غير المتخصصة.
المتجهات
يتم حفظ تسلسلات النيوكليوتيدات ذات الأهمية كإضافات إلى بلازميد أو جينوم عاثية بكتيرية تم استخدامها لإصابة الخلايا البكتيرية.
تُزرع النواقل عادةً في الخلايا البكتيرية، ولكن في حال استخدام كروموسوم الخميرة الاصطناعي (YAC)، يُمكن استخدام خلايا الخميرة. كما يُمكن زراعة النواقل في الفيروسات، إلا أن هذه العملية قد تستغرق وقتًا طويلاً وتكون شاقة. مع ذلك، فإن كفاءة النقل الجيني العالية التي تُحققها الفيروسات (وخاصةً العاثيات) تجعلها مفيدة لتغليف الناقل (مع القطعة المُدخلة المُرتبطة) ثم إدخاله إلى الخلية البكتيرية (أو خلية الخميرة).
بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لمكتبات الحمض النووي المكمل (cDNA)، تم تطوير نظام يستخدم عاثية لامدا زاب 2، وExAssist، ونوعين من بكتيريا الإشريكية القولونية. كما يمكن استخدام نظام Cre-Lox الذي يعتمد على مواقع loxP والتعبير الحيوي لإنزيم إعادة التركيب. هذه أمثلة على أنظمة الاستئصال الحيوي. أما الاستئصال المختبري فيتضمن الاستنساخ الفرعي، وغالبًا ما يستخدم إنزيمات التقييد التقليدية واستراتيجيات الاستنساخ. قد يكون الاستئصال المختبري أكثر استهلاكًا للوقت، وقد يتطلب جهدًا يدويًا أكبر من أنظمة الاستئصال الحيوي. في كلتا الحالتين، تسمح هذه الأنظمة بنقل الناقل من العاثية إلى خلية حية، حيث يمكن للناقل أن يتضاعف ويتكاثر حتى يتم استخدام المكتبة.
استخدام المكتبات
يتضمن ذلك "فحص" التسلسلات ذات الأهمية. وهناك عدة طرق ممكنة لتحقيق ذلك.
مراجع
- 1 2 واجابيي، ناريندرا؛ ليو، أليكس ي.؛ فورلوني، ماتيو (2018-03-01). "الطفرات العشوائية باستخدام بوليميرازات الحمض النووي المعرضة للخطأ". بروتوكولات كولد سبرينغ هاربور . 2018 (3) pdb.prot097741. doi : 10.1101/pdb.prot097741 . ISSN 1940-3402 . PMID 29496818 .
- ^ ماكولوم ، إليزابيث أو. ويليامز، بيريا AR؛ تشانغ، جينجلي؛ Chaput، John C. (2010)، “Random Mutagenesis by Error-Prone PCR”، in Braman، Jeff (ed.)، في بروتوكولات الطفرات المختبرية: الطبعة الثالثة ، طرق في البيولوجيا الجزيئية، المجلد. 634، مطبعة هيومانا، الصفحات من 103 إلى 109، دوى : 10.1007/978-1-60761-652-8_7 ، ISBN 978-1-60761-652-8PMID 20676978
- ↑ كراميري أ، رايلارد س أ، بيرموديز إ، ستيمر و ب (يناير 1998). "إعادة ترتيب الحمض النووي لعائلة من الجينات من أنواع متنوعة يُسرّع التطور الموجه". نيتشر . 391 ( 6664): 288-291 . Bibcode : 1998Natur.391..288C . doi : 10.1038/34663 . PMID 9440693. S2CID 4352696 .
- ↑ جونز، د. د. (مايو 2005). "إزالة ثلاثية النوكليوتيدات في مواقع عشوائية في جين مستهدف: تحمل إنزيم بيتا لاكتاماز TEM-1 لحذف حمض أميني" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 33 (9): e80. doi : 10.1093/nar/gni077 . PMC 1129029. PMID 15897323 .
- ^ وانغ ، تيان ون. تشو، هو؛ ما، شينغ يوان؛ تشانغ، تينغ. ما، يو شو؛ وي ، دونغ تشي (2006/09/01). “بناء مكتبة متحولة في التطور الجزيئي الموجه”. التكنولوجيا الحيوية الجزيئية . 34 (1): 55-68 . دوى : 10.1385/MB:34:1:55 . ردمك 1559-0305 . بميد 16943572 . S2CID 44393645 .
روابط خارجية
- البيولوجيا الجزيئية
- الهندسة الوراثية