هندسة البروتين

هندسة البروتين هي عملية تطوير بروتينات مفيدة أو قيّمة من خلال تصميم وإنتاج عديدات ببتيد غير طبيعية ، غالبًا عن طريق تغيير تسلسل الأحماض الأمينية الموجودة في الطبيعة. ^{[ 1 ]} وهو تخصص حديث نسبيًا، يشهد نشاطًا بحثيًا مكثفًا لفهم عملية طي البروتين والتعرف على مبادئ تصميمه . وقد استُخدم لتحسين وظائف العديد من الإنزيمات المستخدمة في التحفيز الصناعي. ^{[ 2 ]} كما يُعد سوقًا للمنتجات والخدمات، بقيمة تُقدّر بـ 168 مليار دولار أمريكي بحلول عام 2017. ^{[ 3 ]}

توجد استراتيجيتان رئيسيتان لهندسة البروتينات: التصميم العقلاني للبروتينات والتطور الموجه . لا تتعارض هاتان الطريقتان، بل غالبًا ما يطبق الباحثون كلتيهما. في المستقبل، قد تُسهم المعرفة المتعمقة ببنية البروتينات ووظائفها ، والتقدم في تقنيات الفحص عالي الإنتاجية ، في توسيع نطاق هندسة البروتينات بشكل كبير. وفي نهاية المطاف، قد يُتاح إدخال حتى الأحماض الأمينية غير الطبيعية، عبر أساليب حديثة، مثل توسيع الشفرة الوراثية ، التي تسمح بترميز أحماض أمينية جديدة ضمن الشفرة الوراثية. تطبيقات هذه الهندسة واسعة ومتنوعة في مجالات عديدة، تشمل الطب والمعالجة الحيوية الصناعية.

الأساليب

التصميم العقلاني

في تصميم البروتينات العقلاني، يستخدم العالم معرفة دقيقة ببنية البروتين ووظيفته لإجراء التغييرات المطلوبة. وبشكل عام، يتميز هذا الأسلوب بانخفاض تكلفته وسهولة تطبيقه تقنيًا، نظرًا لتطور أساليب الطفرات الموجهة للموقع . مع ذلك، يتمثل عيبه الرئيسي في عدم توفر معلومات تفصيلية عن بنية البروتين في كثير من الأحيان، وحتى عند توفرها، يصعب التنبؤ بآثار الطفرات المختلفة، لأن المعلومات البنيوية غالبًا ما تقدم صورة ثابتة لبنية البروتين. ومع ذلك، فقد استعانت برامج مثل Folding@home و Foldit بتقنيات التعهيد الجماعي لفهم أنماط طي البروتينات. ^{[ 4 ]}

تسعى خوارزميات تصميم البروتينات الحاسوبية إلى تحديد تسلسلات جديدة من الأحماض الأمينية ذات طاقة منخفضة عند طيها إلى البنية المستهدفة المحددة مسبقًا. ورغم اتساع نطاق البحث في فضاء التسلسل والتشكيل، فإن التحدي الأكبر في تصميم البروتينات الحاسوبي يكمن في إيجاد دالة طاقة سريعة ودقيقة في الوقت نفسه، قادرة على التمييز بين التسلسلات المثلى والتسلسلات المشابهة لها ذات الأداء دون المستوى الأمثل.

محاذاة التسلسل المتعدد

في غياب المعلومات البنيوية عن البروتين، يُعد تحليل التسلسل مفيدًا في كثير من الأحيان لاستخلاص معلومات عنه. تتضمن هذه التقنيات محاذاة تسلسلات البروتين المستهدف مع تسلسلات بروتينات أخرى ذات صلة. تُظهر هذه المحاذاة الأحماض الأمينية المحفوظة بين الأنواع، والتي تُعد مهمة لوظيفة البروتين. تُساعد هذه التحليلات في تحديد الأحماض الأمينية الأكثر عرضةً للطفرات. تستخدم محاذاة التسلسلات المتعددة قواعد بيانات مثل PREFAB وSABMARK وOXBENCH وIRMBASE وBALIBASE للمقارنة بين تسلسلات البروتين المستهدف والتسلسلات المعروفة. ترد أدناه قائمة بتقنيات محاذاة التسلسلات المتعددة. ^{[ 5 ]}

تبدأ هذه الطريقة بإجراء محاذاة ثنائية للتسلسلات باستخدام طريقتي k-tuple أو Needleman-Wunsch . تحسب هاتان الطريقتان مصفوفة توضح التشابه الثنائي بين أزواج التسلسلات. ثم تُحوّل درجات التشابه إلى درجات مسافة تُستخدم لإنتاج شجرة توجيهية باستخدام طريقة الربط الجواري. تُستخدم هذه الشجرة التوجيهية بعد ذلك للحصول على محاذاة تسلسلية متعددة. ^{[ 5 ]}

أوميغا العنقودية

تُمكّن هذه الطريقة من محاذاة ما يصل إلى 190,000 تسلسل باستخدام طريقة k-tuple. بعد ذلك، تُجمّع التسلسلات باستخدام طريقتي mBed و k -means . ثم تُنشأ شجرة توجيهية باستخدام طريقة UPGMA المُستخدمة في حزمة HH align. تُستخدم هذه الشجرة التوجيهية لإنشاء محاذاة تسلسلية متعددة. ^{[ 5 ]}

MAFFT

تعتمد هذه الطريقة على تحويل فورييه السريع (FFT) الذي يحول تسلسلات الأحماض الأمينية إلى تسلسل يتكون من قيم الحجم والقطبية لكل حمض أميني. يُستخدم هذا التسلسل الجديد للعثور على المناطق المتماثلة. ^{[ 5 ]}

كي-ألاين

تستخدم هذه الطريقة خوارزمية مطابقة السلاسل التقريبية وو-مانبر لإنشاء محاذاة تسلسل متعددة. ^{[ 5 ]}

مقارنة التسلسلات المتعددة باستخدام التوقع اللوغاريتمي (MUSCLE)

تستخدم هذه الطريقة مسافات Kmer و Kimura لإنشاء محاذاة تسلسل متعددة. ^{[ 5 ]}

تي-كوفي

تستخدم هذه الطريقة دوال هدف الاتساق القائمة على الأشجار لتطوير المحاذاة. وقد ثبت أن هذه الطريقة أكثر دقة بنسبة 5-10% من طريقة Clustal W. ^{[ 5 ]}

التحليل التطوري المشترك

يُعرف التحليل التطوري المشترك أيضًا باسم الطفرة المترابطة، أو التباين المشترك، أو الاستبدال المشترك. يتضمن هذا النوع من التصميم العقلاني تغييرات تطورية متبادلة في مواقع جينية متفاعلة تطوريًا. تبدأ هذه الطريقة عادةً بإنشاء محاذاة تسلسلية متعددة مُدققة للتسلسل المستهدف. ثم تُخضع هذه المحاذاة لتحسين يدوي يشمل إزالة التسلسلات ذات الفجوات الكبيرة، بالإضافة إلى التسلسلات ذات التطابق التسلسلي المنخفض. تُحسّن هذه الخطوة جودة المحاذاة. بعد ذلك، تُستخدم المحاذاة المُعالجة يدويًا لإجراء المزيد من القياسات التطورية المشتركة باستخدام خوارزميات طفرة مترابطة متميزة. تُنتج هذه الخوارزميات مصفوفة تسجيل للتطور المشترك. تُصفّى هذه المصفوفة بتطبيق اختبارات دلالة إحصائية متنوعة لاستخراج قيم التطور المشترك المهمة وإزالة التشويش الخلفي. تُقيّم قياسات التطور المشترك بشكل إضافي لتقييم أدائها ودقتها. أخيرًا، تُتحقق تجريبيًا من نتائج هذا التحليل التطوري المشترك. ^{[ 5 ]}

التنبؤ الهيكلي

تستفيد عملية توليد البروتينات من الصفر من معرفة البنى البروتينية الموجودة. وتساعد هذه المعرفة في التنبؤ بالبنى البروتينية الجديدة. تندرج طرق التنبؤ بالبنية البروتينية ضمن إحدى الفئات الأربع التالية: الطرق الأولية، والطرق القائمة على التجزئة، ونمذجة التماثل، وربط البروتينات. ^{[ 5 ]}

من البداية

تعتمد هذه الأساليب على النمذجة الحرة دون استخدام أي معلومات هيكلية عن النموذج. تهدف أساليب ab initio إلى التنبؤ بالبنى الأصلية للبروتينات التي تتوافق مع الحد الأدنى العالمي لطاقتها الحرة. من أمثلة أساليب ab initio : AMBER وGROMOS وGROMACS وCHARMM وOPLS وENCEPP12. تبدأ الخطوات العامة لأساليب ab initio بالتمثيل الهندسي للبروتين محل الدراسة. بعد ذلك، يتم تطوير نموذج دالة طاقة كامنة للبروتين. يمكن إنشاء هذا النموذج باستخدام جهود الميكانيكا الجزيئية أو دوال الطاقة الكامنة المشتقة من بنية البروتين. بعد تطوير نموذج الطاقة الكامنة، تُطبق تقنيات البحث عن الطاقة، بما في ذلك محاكاة الديناميكا الجزيئية ومحاكاة مونت كارلو والخوارزميات الجينية، على البروتين. ^{[ 5 ]}

قائم على التجزئة

تستخدم هذه الطرق معلومات قواعد البيانات المتعلقة بالبنى لمطابقة البنى المتماثلة مع تسلسلات البروتين المُنشأة. تُجمّع هذه البنى المتماثلة للحصول على بنى مُدمجة باستخدام إجراءات التقييم والتحسين، بهدف الوصول إلى أدنى قيمة لطاقة الوضع. خوادم الويب لمعلومات الأجزاء هي: I-TASSER، وROSETTA، وROSETTA@home، وFRAGFOLD، وCABS fold، وPROFESY، وCREF، وQUARK، وUNDERTAKER، وHMM، وANGLOR. ^{[ 5 ]}^{: 72}

نمذجة التماثل

تعتمد هذه الطرق على تماثل البروتينات، وتُعرف أيضًا بالنمذجة المقارنة. تتمثل الخطوة الأولى في نمذجة التماثل عمومًا في تحديد تسلسلات نموذجية ذات بنية معروفة ومتماثلة مع التسلسل المطلوب. بعد ذلك، تتم محاذاة التسلسل المطلوب مع التسلسل النموذجي. عقب المحاذاة، تُنمذج المناطق المحفوظة بنيويًا باستخدام بنية النموذج. يلي ذلك نمذجة السلاسل الجانبية والحلقات المختلفة عن النموذج. أخيرًا، تخضع البنية المُنمذجة للتنقيح وتقييم الجودة. فيما يلي قائمة بالخوادم المتاحة لبيانات نمذجة التماثل: SWISS MODEL، MODELLER، ReformAlign، PyMOD، TIP-STRUCTFAST، COMPASS، 3d-PSSM، SAMT02، SAMT99، HHPRED، FAGUE، 3D-JIGSAW، META-PP، ROSETTA، وI-TASSER. ^{[ 5 ]}

خيط البروتين

يمكن استخدام تقنية ربط البروتينات عندما يتعذر العثور على نظير موثوق لتسلسل الاستعلام. تبدأ هذه الطريقة بالحصول على تسلسل الاستعلام ومكتبة من الهياكل النموذجية. بعد ذلك، يتم ربط تسلسل الاستعلام بالهياكل النموذجية المعروفة. تُقيّم هذه النماذج المرشحة باستخدام دوال التقييم، والتي تُقيّم بناءً على نماذج الطاقة الكامنة لكل من تسلسل الاستعلام والنموذج. ثم يتم اختيار النموذج ذي أقل طاقة كامنة. فيما يلي قائمة بالطرق والخوادم المستخدمة لاسترجاع بيانات الربط وإجراء الحسابات: GenTHREADER، pGenTHREADER، pDomTHREADER، ORFEUS، PROSPECT، BioShell-Threading، FFASO3، RaptorX، HHPred، خادم LOOPP، Sparks-X، SEGMER، THREADER2، ESYPRED3D، LIBRA، TOPITS، RAPTOR، COTH، MUSTER. ^{[ 5 ]}

لمزيد من المعلومات حول التصميم العقلاني، انظر الطفرات الموجهة للموقع .

الارتباط متعدد التكافؤ

يمكن استخدام الارتباط متعدد التكافؤ لزيادة خصوصية الارتباط وقوته من خلال تأثيرات التجاذب . وجود نطاقات ارتباط متعددة في جزيء حيوي واحد أو مركب يزيد من احتمالية حدوث تفاعلات أخرى عبر أحداث ارتباط فردية. قد يكون التجاذب أو التقارب الفعال أعلى بكثير من مجموع التقاربات الفردية، مما يوفر أداة فعالة من حيث التكلفة والوقت للارتباط الموجه. ^{[ 6 ]}

البروتينات متعددة التكافؤ

تُعدّ البروتينات متعددة التكافؤ سهلة الإنتاج نسبيًا من خلال التعديلات اللاحقة للترجمة أو مضاعفة تسلسل الحمض النووي المشفر للبروتين. وتتمثل الميزة الرئيسية للبروتينات متعددة التكافؤ ومتعددة التخصصات في قدرتها على زيادة الألفة الفعالة لبروتين معروف تجاه هدفه. وفي حالة الأهداف غير المتجانسة، يُمكن استخدام مزيج من البروتينات التي تُؤدي إلى ارتباط متعدد التخصصات لزيادة التخصص، وهو ما يُعدّ ذا أهمية بالغة في العلاجات البروتينية.

تُعد الأجسام المضادة المثال الأكثر شيوعًا للارتباط متعدد التكافؤ، وهناك أبحاث مكثفة حول الأجسام المضادة ثنائية التخصص. تشمل تطبيقات الأجسام المضادة ثنائية التخصص طيفًا واسعًا يتضمن التشخيص والتصوير والوقاية والعلاج. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]}

التطور الموجه

في التطور الموجه، تُطبَّق الطفرات العشوائية ، مثلاً باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ أو طفرات تشبع التسلسل ، على البروتين، ويُستخدم نظام انتقاء لاختيار المتغيرات ذات الصفات المرغوبة. ثم تُطبَّق جولات إضافية من الطفرات والانتقاء. تُحاكي هذه الطريقة التطور الطبيعي ، وتُنتج عمومًا نتائج أفضل من التصميم العقلاني. وتُضاف عملية تُسمى إعادة تركيب الحمض النووي ، حيث تُخلط وتُطابق أجزاء من المتغيرات الناجحة لإنتاج نتائج أفضل. تُحاكي هذه العمليات عملية إعادة التركيب التي تحدث طبيعيًا أثناء التكاثر الجنسي . من مزايا التطور الموجه أنه لا يتطلب معرفة مسبقة ببنية البروتين، ولا يتطلب القدرة على التنبؤ بتأثير طفرة معينة. في الواقع، غالبًا ما تكون نتائج تجارب التطور الموجه مفاجئة، إذ غالبًا ما تنتج التغييرات المرغوبة عن طفرات لم يكن متوقعًا أن يكون لها أي تأثير. أما عيبها فهو أنها تتطلب فحصًا عالي الإنتاجية ، وهو أمر غير ممكن لجميع البروتينات. يجب تحوير كميات كبيرة من الحمض النووي المُعاد تركيبه وفحص المنتجات بحثًا عن الصفات المرغوبة. غالباً ما يتطلب العدد الكبير من المتغيرات معدات روبوتية باهظة الثمن لأتمتة العملية. علاوة على ذلك، لا يمكن فحص جميع الأنشطة المطلوبة بسهولة.

يمكن استخدام الأساليب المختبرية لمحاكاة جوانب من التطور الدارويني لتطوير خصائص البروتينات في تطبيقات مثل التحفيز. تتوفر تقنيات تجريبية متنوعة لإنشاء مكتبات بروتينية كبيرة ومتنوعة، ولفرز أو اختيار المتغيرات ذات الطي والوظائف المطلوبة. يمكن أن تنشأ البروتينات المطوية في فضاء تسلسل عشوائي، وهو ما يمكن استخدامه في تطوير البروتينات الرابطة والمحفزات. يتضمن نهج بديل تعديل البروتينات الموجودة من خلال الطفرات العشوائية، متبوعةً بالاختيار أو الفرز لتحسين خصائصها أو تغييرها. يمكن أن يكون هذا النهج أساسًا لجهود هندسة البروتينات الأكثر تقدمًا. قد يدعم الجمع بين التطور التجريبي والأساليب الحسابية تطوير جزيئات ضخمة وظيفية غير موجودة في الطبيعة. ^{[ 9 ]}

شهدت التحديات الرئيسية لتصميم مكتبات طفرات عالية الجودة تقدماً ملحوظاً في الآونة الأخيرة. تمثل هذا التقدم في تحسين وصف تأثيرات الأحمال الطفرية على خصائص البروتين. كما حققت الأساليب الحسابية تقدماً كبيراً في تحويل نطاق التسلسلات الهائل إلى أحجام قابلة للفحص، مما أدى إلى إنشاء مكتبات طفرات ذكية. وتم أيضاً تقليص حجم المكتبة إلى أحجام أكثر قابلية للفحص من خلال تحديد البقايا المفيدة الرئيسية باستخدام خوارزميات إعادة التركيب المنهجي. وأخيراً، تم تحقيق خطوة هامة نحو إعادة هندسة الإنزيمات بكفاءة من خلال تطوير نماذج إحصائية وخوارزميات أكثر دقة لتحديد وتوقع التأثيرات الطفرية المترابطة على وظائف البروتين. ^{[ 10 ]}

بشكل عام، يمكن تلخيص التطور الموجه كعملية تكرارية من خطوتين، تتضمن إنشاء مكتبات بروتينية طافرة، وعمليات فحص عالية الإنتاجية لاختيار المتغيرات ذات الصفات المحسّنة. لا تتطلب هذه التقنية معرفة مسبقة بعلاقة بنية البروتين بوظيفته. يستخدم التطور الموجه الطفرات العشوائية أو المركزة لإنشاء مكتبات من البروتينات الطافرة. يمكن إدخال الطفرات العشوائية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المعرض للخطأ، أو طفرات تشبع الموقع. كما يمكن توليد الطفرات باستخدام إعادة تركيب جينات متماثلة متعددة. لقد طورت الطبيعة عددًا محدودًا من التسلسلات المفيدة. يُمكّن التطور الموجه من تحديد تسلسلات بروتينية غير مكتشفة ذات وظائف جديدة. تعتمد هذه القدرة على قدرة البروتينات على تحمل استبدال بقايا الأحماض الأمينية دون المساس بطيها أو استقرارها. ^{[ 5 ]}

يمكن تصنيف أساليب التطور الموجه بشكل عام إلى استراتيجيتين، أساليب لا جنسية وأساليب جنسية.

طرق لا جنسية

لا تُنتج الطرق اللاجنسية أي روابط متقاطعة بين الجينات الأصلية. تُستخدم جينات مفردة لإنشاء مكتبات طفرات باستخدام تقنيات طفرية متنوعة. يمكن لهذه الطرق اللاجنسية أن تُنتج طفرات عشوائية أو مُوجَّهة.

الطفرات العشوائية

تُنتج طرق الطفرات العشوائية طفرات عشوائية في جميع أنحاء الجين المستهدف. ويمكن أن تُدخل الطفرات العشوائية الأنواع التالية من الطفرات: الانتقالات، والتحولات، والإدخالات، والحذف، والانقلاب، والطفرات غير المترادفة، والطفرات غير المنطقية. وفيما يلي أمثلة على طرق إنتاج الطفرات العشوائية.

تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ

تعتمد تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ (Errorposed PCR) على حقيقة أن إنزيم Taq DNA polymerase يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز من 3' إلى 5'. ينتج عن ذلك معدل خطأ يتراوح بين 0.001 و0.002% لكل نيوكليوتيد في كل عملية تضاعف. تبدأ هذه الطريقة باختيار الجين، أو المنطقة داخل الجين، المراد إحداث طفرة فيه. بعد ذلك، يتم حساب مدى الخطأ المطلوب بناءً على نوع ومدى النشاط المراد توليده. يحدد مدى الخطأ هذا استراتيجية تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ التي سيتم استخدامها. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم استنساخ الجينات في بلازميد وإدخالها إلى أنظمة الخلايا المؤهلة. ثم يتم فحص هذه الخلايا بحثًا عن الصفات المرغوبة. بعد ذلك، يتم عزل البلازميدات للحصول على المستعمرات التي تُظهر صفات محسنة، ثم تُستخدم كقوالب للجولة التالية من الطفرات. يُظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ تحيزات لبعض الطفرات مقارنةً بغيرها، مثل التحيز للتحولات الانتقالية على حساب التحولات العرضية. ^{[ 5 ]}

يمكن زيادة معدلات الخطأ في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالطرق التالية: ^{[ 5 ]}

زيادة تركيز كلوريد المغنيسيوم، الذي يعمل على تثبيت اقتران القواعد غير المتكاملة.
أضف كلوريد المنغنيز لتقليل خصوصية أزواج القواعد.
زيادة غير متوازنة في إضافة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs).
إضافة نظائر قاعدية مثل dITP و 8 oxo-dGTP و dPTP.
زيادة تركيز بوليميراز Taq.
زيادة وقت التمديد.
زيادة وقت الدورة.
استخدم بوليميراز Taq أقل دقة.

انظر أيضًا إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل لمزيد من المعلومات.

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المعرض للخطأ باستخدام الدائرة المتدحرجة

تعتمد طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هذه على تضخيم الدائرة المتدحرجة، وهي محاكاة للطريقة التي تستخدمها البكتيريا لتضخيم الحمض النووي الدائري. ينتج عن هذه الطريقة جزيئات DNA ثنائية الخط. تحتوي هذه الأجزاء على تكرارات متتالية من الحمض النووي الدائري تُسمى "الكونكاتامرات"، والتي يمكن نقلها إلى سلالات بكتيرية. تُدخل الطفرات عن طريق استنساخ التسلسل المستهدف أولًا في بلازميد مناسب. بعد ذلك، تبدأ عملية التضخيم باستخدام بادئات سداسية عشوائية وإنزيم بوليميراز DNA Φ29 في ظل ظروف تضخيم الدائرة المتدحرجة المعرضة للخطأ. تشمل الشروط الإضافية لإنتاج تضخيم الدائرة المتدحرجة المعرض للخطأ: 1.5 بيكومول من الحمض النووي القالب، و1.5 ملي مول من كلوريد المنغنيز (MnCl₂ ₎ ، ومدة تفاعل 24 ساعة. يُضاف كلوريد المنغنيز _إلى مزيج التفاعل لتعزيز الطفرات النقطية العشوائية في خيوط الحمض النووي. يمكن زيادة معدلات الطفرات عن طريق زيادة تركيز كلوريد المنغنيز _، أو عن طريق تقليل تركيز الحمض النووي القالب. يُعدّ تضخيم الدائرة المتدحرجة المعرض للخطأ أفضل من تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ، وذلك لاستخدامه بادئات سداسية عشوائية عامة بدلاً من البادئات النوعية. كما أن نواتج هذا التفاعل لا تحتاج إلى معالجة بالليغازات أو الإندونوكليازات. هذا التفاعل متساوي الحرارة. ^{[ 5 ]}

الطفرات الكيميائية

تتضمن الطفرات الكيميائية استخدام عوامل كيميائية لإحداث طفرات في التسلسلات الجينية. وفيما يلي أمثلة على الطفرات الكيميائية.

يُعدّ بيكبريتات الصوديوم فعالاً في إحداث طفرات في التسلسلات الجينومية الغنية بالجوانين والسيتوزين. ويعود ذلك إلى أن بيكبريتات الصوديوم يحفز نزع الأمين من السيتوزين غير المُمَثْيَل إلى يوراسيل. ^{[ 5 ]}

يقوم إيثيل ميثان سلفونات بألكلة بقايا الغوانيدين. ويؤدي هذا التغيير إلى حدوث أخطاء أثناء تضاعف الحمض النووي. ^{[ 5 ]}

يتسبب حمض النيتروز في حدوث تحول عن طريق نزع الأمين من الأدينين والسيتوزين. ^{[ 5 ]}

يُعدّ النهج المزدوج للطفرات الكيميائية العشوائية عمليةً تكراريةً من خطوتين. تتضمن الخطوة الأولى إحداث طفرات كيميائية داخل الكائن الحي في الجين المستهدف باستخدام مادة EMS. بعد ذلك، يُعزل الجين المُعالَج ويُستنسخ في ناقل تعبير غير مُعالَج لمنع حدوث طفرات في هيكل البلازميد. ^{[ 5 ]} تحافظ هذه التقنية على الخصائص الوراثية للبلازميدات. ^{[ 5 ]}

استهداف الجليكوزيلازات إلى المصفوفات المدمجة من أجل إحداث الطفرات (TaGTEAM)

استُخدمت هذه الطريقة لإحداث طفرات مُستهدفة داخل الكائن الحي في الخميرة. وتتضمن هذه الطريقة دمج إنزيم غليكوزيلاز الحمض النووي 3-ميثيل أدينين مع نطاق ارتباط الحمض النووي tetR. وقد ثبت أن هذا يزيد معدلات الطفرات بأكثر من 800 ضعف في مناطق الجينوم التي تحتوي على مواقع tetO. ^{[ 5 ]}

الطفرات الناتجة عن الإدخال والحذف العشوائيين

تتضمن هذه الطريقة تغيير طول التسلسل عبر حذف وإدخال أجزاء من القواعد ذات أطوال عشوائية في آنٍ واحد. وقد ثبت أن هذه الطريقة تُنتج بروتينات ذات وظائف جديدة من خلال إدخال مواقع تقييد جديدة، وكودونات محددة، وكودونات رباعية القواعد للأحماض الأمينية غير الطبيعية. ^{[ 5 ]}

الطفرات العشوائية القائمة على الترانسبوزون

أُبلغ مؤخرًا عن العديد من طرق الطفرات العشوائية القائمة على الترانسبوزونات. تشمل هذه الطرق، على سبيل المثال لا الحصر، ما يلي: التبديل الدائري العشوائي (PERMUTE)، وتقصير البروتين العشوائي، واستبدال ثلاثيات النيوكليوتيدات العشوائي، وإدخال نطاق/علامة/أحماض أمينية متعددة عشوائيًا، والطفرات الناتجة عن مسح الكودونات، والطفرات الناتجة عن مسح الكودونات المتعددة. تتطلب جميع هذه التقنيات تصميم ترانسبوزونات صغيرة من نوع "ميو" (mini-Mu). تُصنّع شركة Thermo Scientific مجموعات أدوات لتصميم هذه الترانسبوزونات. ^{[ 5 ]}

طرق الطفرات العشوائية التي تغير طول الحمض النووي المستهدف

تتضمن هذه الطرق تغيير طول الجين عبر طفرات الإدخال والحذف. ومن الأمثلة على ذلك طريقة إدخال التكرارات المتتالية (TRINS). وتؤدي هذه التقنية إلى توليد تكرارات متتالية لأجزاء عشوائية من الجين المستهدف عبر تضخيم الدائرة المتدحرجة، وإدراج هذه التكرارات في الجين المستهدف في الوقت نفسه. ^{[ 5 ]}

سلالات الطفرات

السلالات الطافرة هي خطوط خلوية بكتيرية تفتقر إلى آلية واحدة أو أكثر من آليات إصلاح الحمض النووي. ومن الأمثلة على السلالات الطافرة سلالة الإشريكية القولونية XL1-RED. ^{[ 5 ]} تفتقر هذه السلالة التابعة من الإشريكية القولونية إلى مسارات إصلاح الحمض النووي MutS وMutD وMutT. يُعد استخدام السلالات الطافرة مفيدًا في إدخال أنواع عديدة من الطفرات؛ إلا أن هذه السلالات تُظهر تدهورًا تدريجيًا في بيئة الاستزراع نتيجة لتراكم الطفرات في جينومها. ^{[ 5 ]}

الطفرات الموجهة

تُنتج طرق الطفرات الموجهة طفرات في بقايا أحماض أمينية محددة مسبقًا. تتطلب هذه التقنيات فهمًا لعلاقة التسلسل بالوظيفة للبروتين محل الاهتمام. يسمح فهم هذه العلاقة بتحديد البقايا المهمة في الاستقرار، والانتقائية الفراغية، والكفاءة التحفيزية. ^{[ 5 ]} فيما يلي أمثلة على الطرق التي تُنتج طفرات موجهة.

الطفرات المشبعة للموقع

الطفرات الموجهة للموقع هي طريقة تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لاستهداف الأحماض الأمينية ذات الأدوار المهمة في وظيفة البروتين. وأكثر التقنيات شيوعًا لإجراء ذلك هي تفاعل البوليميراز المتسلسل الأحادي للبلازميد الكامل، وتفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل.

يُشار أيضًا إلى تفاعل البلمرة المتسلسل الأحادي للبلازميد الكامل باسم الطفرات الموجهة للموقع (SDM). تخضع نواتج SDM لهضم إنزيم Dpn الداخلي. ينتج عن هذا الهضم قطع السلسلة الأصلية فقط، لأن السلسلة الأصلية تحتوي على GmATC المُمَثْيَل عند N6 للأدينين. لا تُجدي SDM نفعًا مع البلازميدات الكبيرة التي يزيد حجمها عن عشرة كيلوبايت. كما أن هذه الطريقة قادرة فقط على استبدال نيوكليوتيدين في كل مرة. ^{[ 5 ]}

يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل استخدام زوجين من البادئات. تحتوي إحدى البادئات في كل زوج على طفرة. تُجرى جولة أولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام هذه البادئات، فتتكون سلسلتان مزدوجتان من الحمض النووي. ثم تُجرى جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل، حيث تُفصل سلسلتا الحمض النووي وتُعاد تهجينهما مع البادئات لإنتاج سلسلتين غير متجانستين، تحتوي كل سلسلة منهما على طفرة. تُملأ أي فجوات في هاتين السلسلتين المتكونتين حديثًا بواسطة بوليميرازات الحمض النووي، ثم تُضخّم بشكل إضافي. ^{[ 5 ]}

الطفرات الناتجة عن تشبع التسلسل (SeSaM)

تؤدي الطفرات التشبعية للتسلسل إلى تغيير عشوائي في تسلسل الهدف عند كل موقع نيوكليوتيدي. تبدأ هذه الطريقة بتكوين شظايا DNA متغيرة الطول ذات نهايات تحتوي على قواعد عالمية، وذلك باستخدام إنزيمات نقل القوالب عند الطرف 3'. بعد ذلك، تُمدد هذه الشظايا إلى الطول الكامل باستخدام قالب أحادي السلسلة. تُستبدل القواعد العالمية بقاعدة قياسية عشوائية، مما يُسبب الطفرات. توجد عدة نسخ مُعدلة من هذه الطريقة، مثل SeSAM-Tv-II وSeSAM-Tv+ وSeSAM-III. ^{[ 5 ]}

تفاعلات البادئات المفردة المتوازية (SPRINP)

تتضمن طريقة الطفرات التشبعية للموقع هذه تفاعلي PCR منفصلين. يستخدم الأول بادئات أمامية فقط، بينما يستخدم الثاني بادئات عكسية فقط. وهذا يمنع تكوين ثنائيات البادئات. ^{[ 5 ]}

الطفرات الموجهة باستخدام طريقة ميجا برايمر والخالية من الليغاز

تبدأ هذه التقنية الطفرية لتشبع الموقع باستخدام قليل النوكليوتيدات الطافر وبادئ عام محيط به. يُستخدم هذان المتفاعلان في دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الأولية. وتُستخدم نواتج هذه الدورة الأولى كبادئات ضخمة لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية. ^{[ 5 ]}

Ω-PCR

تعتمد هذه الطريقة الطفرية لتشبع الموقع على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل. وتُستخدم لإدخال طفرات في أي موقع في بلازميد دائري. ^{[ 5 ]}

PFunkel-ominchange-OSCARR

تعتمد هذه الطريقة على الطفرات الموجهة للموقع التي يحددها المستخدم في موقع واحد أو مواقع متعددة في آن واحد. OSCARR هو اختصار لمنهجية بسيطة أحادية الوعاء لإعادة تركيب وتوزيع الكاسيتات . ينتج عن هذه العملية إعادة تركيب وتوزيع عشوائي لأجزاء مرغوبة من البروتين. أما Omnichange فهي طفرات تشبع متعددة المواقع لا تعتمد على التسلسل، ويمكنها تشبع ما يصل إلى خمسة كودونات مستقلة على الجين.

الطفرات الثلاثية الثنائية

تزيل هذه الطريقة الكودونات الزائدة وكودونات التوقف.

الطفرات المستحثة بالكاسيت

هذه طريقة تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تبدأ عملية الطفرات الكاسيتية بتخليق كاسيت DNA يحتوي على الجين المطلوب، محاطًا من كلا الجانبين بمواقع تقييد. يقوم الإندونوكلياز الذي يقطع مواقع التقييد هذه بقطع مواقع أخرى في البلازميد المستهدف. يُعالج كل من كاسيت DNA والبلازميد المستهدف بالإنزيمات الداخلية لقطع مواقع التقييد هذه وتكوين نهايات لاصقة. بعد ذلك، تُربط نواتج هذا القطع معًا، مما يؤدي إلى إدخال الجين في البلازميد المستهدف. يُستخدم شكل بديل من الطفرات الكاسيتية يُسمى الطفرات الكاسيتية التوافقية لتحديد وظائف بقايا الأحماض الأمينية الفردية في البروتين المطلوب. ثم تستخدم الطفرات التجميعية المتكررة المعلومات من الطفرات الكاسيتية التوافقية السابقة. تسمح لك الطفرات الكاسيتية للكودون بإدخال أو استبدال كودون واحد في موقع معين في DNA مزدوج السلاسل. ^{[ 5 ]}

الأساليب الجنسية

تتضمن الطرق الجنسية للتطور الموجه إعادة التركيب في المختبر، والتي تحاكي إعادة التركيب الطبيعية في الكائن الحي . تتطلب هذه التقنيات عمومًا تشابهًا عاليًا في تسلسل الحمض النووي بين التسلسلات الأبوية. تُستخدم هذه التقنيات غالبًا لإعادة تركيب جينين أبويين مختلفين، وتُحدث هذه الطرق عمليات عبور بين هذين الجينين. ^{[ 5 ]}

إعادة التركيب المتماثل في المختبر

يمكن تصنيف إعادة التركيب المتماثل إلى نوعين: داخل الكائن الحي (in vivo) وخارجه (in vitro). تحاكي إعادة التركيب المتماثل في المختبر (in vitro) عملية إعادة التركيب الطبيعية داخل الكائن الحي . تتطلب هذه الطرق لإعادة التركيب في المختبر تماثلًا عاليًا في تسلسل الجينات الأبوية. تستغل هذه التقنيات التنوع الطبيعي في الجينات الأبوية عن طريق إعادة تركيبها لإنتاج جينات هجينة. تُظهر الجينات الهجينة الناتجة مزيجًا من خصائص الجينات الأبوية. ^[⁵^]

إعادة ترتيب الحمض النووي

كانت هذه التقنية المختبرية من أوائل التقنيات في عصر إعادة التركيب الجيني. تبدأ بهضم الجينات الأبوية المتماثلة إلى أجزاء صغيرة بواسطة إنزيم DNase1. ثم تُنقى هذه الأجزاء الصغيرة من الجينات الأبوية غير المهضومة. بعد ذلك، يُعاد تجميع الأجزاء المنقاة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بدون بادئات. يتضمن هذا التفاعل ارتباط أجزاء متماثلة من جينات أبوية مختلفة ببعضها البعض، مما ينتج عنه حمض نووي هجين. ثم يُضخّم الحمض النووي الهجين بحجم الحمض النووي الأبوي باستخدام بادئات طرفية في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي. ^{[ 5 ]}

إعادة التركيب في المختبر باستخدام التمهيد العشوائي (RPR)

تبدأ هذه الطريقة لإعادة التركيب المتماثل في المختبر بتخليق العديد من أجزاء الجينات القصيرة التي تحمل طفرات نقطية باستخدام بادئات ذات تسلسل عشوائي. تُعاد تجميع هذه الأجزاء لتكوين الجينات الأصلية كاملة الطول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بدون بادئات. ثم تُضخّم هذه التسلسلات المُعاد تجميعها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتُخضع لعمليات انتقاء إضافية. تتميز هذه الطريقة عن إعادة ترتيب الحمض النووي (DNA shuffling) بعدم استخدام إنزيم DNase1، وبالتالي لا يوجد تحيز لإعادة التركيب بجوار نيوكليوتيد البيريميدين. كما تتميز هذه الطريقة باستخدامها لبادئات اصطناعية عشوائية موحدة الطول وخالية من التحيزات. وأخيرًا، لا تعتمد هذه الطريقة على طول تسلسل قالب الحمض النووي، وتتطلب كمية صغيرة من الحمض النووي الأصلي. ^{[ 5 ]}

تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بجين الميتاجينوم المختصر

تُنتج هذه الطريقة جينات هجينة مباشرةً من عينات الميتاجينوم. تبدأ بعزل الجين المطلوب عن طريق الفحص الوظيفي لعينة الحمض النووي للميتاجينوم. بعد ذلك، تُصمَّم بادئات محددة وتُستخدم لتضخيم الجينات المتماثلة من عينات بيئية مختلفة. وأخيرًا، تُنشأ مكتبات هجينة لاسترجاع المستنسخات الوظيفية المطلوبة عن طريق إعادة ترتيب هذه الجينات المتماثلة المُضخَّمة. ^{[ 5 ]}

عملية التمديد التدريجي (StEP)

تعتمد هذه الطريقة المختبرية على تبديل القالب لإنتاج جينات هجينة. تبدأ هذه الطريقة، القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بفصل أولي للقالب، يليه ارتباط البادئات وفترة استطالة قصيرة. في كل دورة لاحقة، يحدث ارتباط بين القطع القصيرة الناتجة في الدورات السابقة وأجزاء مختلفة من القالب. ترتبط هذه القطع القصيرة مع القالب بناءً على تكامل التسلسل. تُعرف هذه العملية، التي يتم فيها ارتباط القطع بقالب الحمض النووي، بتبديل القالب. تعمل هذه القطع المرتبطة كبادئات لمزيد من الاستطالة. تُجرى هذه الطريقة حتى الحصول على تسلسل الجين الهجين بطول الجين الأصلي. لا تتطلب هذه الطريقة سوى بادئات جانبية للبدء، كما أنها لا تحتاج إلى إنزيم Dnase1. ^{[ 5 ]}

التخلق العشوائي للكائنات الهجينة على قوالب عابرة (RACHITT)

أثبتت هذه الطريقة قدرتها على توليد مكتبات جينية هجينة بمتوسط 14 عملية عبور لكل جين هجين. تبدأ العملية بمحاذاة أجزاء من السلسلة العلوية الأصلية على السلسلة السفلية لقالب يحتوي على اليوراسيل من جين مماثل. ثم تُقطع الأطراف المتدلية 5' و3' وتُملأ الفجوات بواسطة نشاطي الإكسونوكلياز والإندونوكلياز لإنزيمات بوليميراز الحمض النووي Pfu وtaq. بعد ذلك، يُزال قالب اليوراسيل من الحمض النووي الهجين بمعالجته بإنزيم جلوكوزيلاز اليوراسيل، ثم يُجرى تضخيم إضافي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تتميز هذه الطريقة بقدرتها على توليد جينات هجينة بتردد عبور مرتفع نسبيًا. مع ذلك، فهي محدودة نوعًا ما نظرًا لتعقيدها والحاجة إلى توليد حمض نووي أحادي السلسلة وقالب حمض نووي أحادي السلسلة يحتوي على اليوراسيل. ^{[ 5 ]}

خلط اصطناعي

يُضفي خلط النيوكليوتيدات الاصطناعية المتدهورة مرونة على طرق الخلط، حيث يمكن تضمين النيوكليوتيدات التي تحتوي على الكودونات المثلى والطفرات المفيدة. ^{[ 5 ]}

إعادة التركيب المتماثل في الجسم الحي

تتضمن عملية الاستنساخ في الخميرة إعادة تجميع متجهات التعبير المجزأة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم تُدخل هذه المتجهات المُعاد تجميعها إلى الخميرة وتُستنسخ فيها. استخدام الخميرة لاستنساخ المتجه يتجنب السمية والانتقاء المضاد اللذين قد يحدثان عند الربط والتكاثر في بكتيريا الإشريكية القولونية. ^{[ 5 ]}

عملية إعادة التركيب المنظمة المسببة للطفرات عن طريق التجميع المتماثل في الجسم الحي (التحول)

تُدخل هذه الطريقة طفرات في مناطق محددة من الجينات مع الحفاظ على الأجزاء الأخرى سليمة، وذلك من خلال الاستفادة من التردد العالي لإعادة التركيب المتماثل في الخميرة. ^{[ 5 ]}

التطور المستمر بمساعدة العاثيات (PACE)

تعتمد هذه الطريقة على استخدام عاثية بكتيرية ذات دورة حياة معدلة لنقل الجينات المتطورة من عائل إلى آخر. صُممت دورة حياة العاثية بحيث يرتبط النقل بنشاط الإنزيم المطلوب. تتميز هذه الطريقة بأنها تتطلب الحد الأدنى من التدخل البشري لضمان التطور المستمر للجين. ^{[ 5 ]}

طرق إعادة التركيب غير المتجانسة في المختبر

تعتمد هذه الأساليب على حقيقة أن البروتينات يمكن أن تُظهر هوية هيكلية متشابهة مع افتقارها إلى تماثل التسلسل.

إعادة ترتيب إكسون

إعادة ترتيب الإكسونات هي عملية دمج الإكسونات من بروتينات مختلفة عن طريق عمليات إعادة التركيب التي تحدث في الإنترونات. تتضمن إعادة ترتيب الإكسونات المتماثلة دمج الإكسونات من جينات متماثلة من أنواع مختلفة. أما إعادة ترتيب النطاقات المتماثلة فتتضمن إعادة ترتيب نطاقات بروتينية كاملة من جينات متماثلة من أنواع مختلفة. بينما تتضمن إعادة ترتيب الإكسونات المتوازية إعادة ترتيب الإكسونات من جينات مختلفة من نفس النوع. وتتضمن إعادة ترتيب النطاقات المتوازية إعادة ترتيب نطاقات بروتينية كاملة من بروتينات متوازية من نفس النوع. أما إعادة ترتيب التماثل الوظيفي فتتضمن إعادة ترتيب نطاقات غير متماثلة ذات صلة وظيفية. تبدأ جميع هذه العمليات بتضخيم الإكسونات المطلوبة من جينات مختلفة باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعية الهجينة. ثم يُعاد تجميع نواتج التضخيم هذه في جينات كاملة الطول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون بادئات. خلال دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه، تعمل القطع كقوالب وبادئات. ينتج عن ذلك جينات هجينة كاملة الطول، والتي تخضع بعد ذلك للفحص. ^{[ 5 ]}

التقطيع التدريجي لإنشاء إنزيمات هجينة (ITCHY)

تُنتَج أجزاء من الجينات الأصلية باستخدام هضم مُتحكَّم به بواسطة إنزيم إكسونوكلياز III. تُزال نهايات هذه الأجزاء باستخدام إنزيم إندونوكلياز، ثم تُربط معًا لإنتاج جينات هجينة. تقنية THIOITCHY هي تقنية مُعدَّلة من تقنية ITCHY، تستخدم نظائر ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات، مثل α-فوسفوثيوات dNTPs . يُؤدي إدخال هذه النيوكليوتيدات إلى منع الهضم بواسطة إنزيم إكسونوكلياز III. يُطلق على هذا التثبيط للهضم بواسطة إنزيم إكسونوكلياز III اسم "التضمين". يُمكن تحقيق التضمين عن طريق اقتطاع الجينات أولًا باستخدام إنزيم إكسونوكلياز لإنتاج أجزاء ذات نهايات قصيرة أحادية السلسلة. تعمل هذه الأجزاء بعد ذلك كقوالب للتضخيم بواسطة بوليميراز الحمض النووي في وجود كميات صغيرة من فوسفوثيوات dNTPs. تُربط هذه الأجزاء الناتجة معًا لتكوين جينات كاملة الطول. بدلاً من ذلك، يُمكن تضخيم الجينات الأصلية السليمة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في وجود dNTPs العادية و dNTPs الفوسفوثيوات. تُخضع نواتج التضخيم كاملة الطول هذه للهضم بواسطة إنزيم إكسونيوكلياز. يستمر الهضم حتى يصادف الإكسونيوكلياز نيوكليوتيد ألفا-pdNTP، مما ينتج عنه شظايا بأطوال مختلفة. ثم تُربط هذه الشظايا معًا لتكوين جينات هجينة. ^{[ 5 ]}

خشن

تُنتج هذه الطريقة مكتبات من الجينات الهجينة التي تمنع عمليات العبور المتعددة، وذلك بدمج إعادة ترتيب الحمض النووي وتقنية ITCHY. تبدأ هذه الطريقة بإنشاء مكتبتين مستقلتين من مكتبات ITCHY، الأولى تحتوي على الجين A في الطرف الأميني، والأخرى تحتوي على الجين B في الطرف الأميني. تُفصل أجزاء الجينات الهجينة هذه باستخدام إما هضم إنزيم التقييد أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات طرفية عبر الترحيل الكهربائي على هلام الأغاروز. تُخلط هذه الأجزاء المعزولة معًا وتُهضم مرة أخرى باستخدام إنزيم DNase1. ثم يُعاد تجميع الأجزاء المهضومة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون بادئات مع تبديل القالب. ^{[ 5 ]}

امتداد مُعاد تركيبه على قوالب مُقتطعة (RETT)

تُنتج هذه الطريقة مكتبات من الجينات الهجينة عن طريق تبديل القالب لسلاسل متعددة النوكليوتيدات أحادية الاتجاه في وجود شظايا الحمض النووي أحادي السلسلة كقوالب للجينات الهجينة. تبدأ هذه الطريقة بتحضير شظايا الحمض النووي أحادي السلسلة عن طريق النسخ العكسي من الحمض النووي الريبوزي الرسول المستهدف. ثم تُربط بادئات خاصة بالجين بالحمض النووي أحادي السلسلة. بعد ذلك، تُمدد هذه الجينات خلال دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تلي هذه الدورة عملية تبديل القالب وربط الشظايا القصيرة الناتجة عن تمديد البادئات السابق بشظايا أخرى من الحمض النووي أحادي السلسلة. تُكرر هذه العملية حتى الحصول على حمض نووي أحادي السلسلة كامل الطول. ^{[ 5 ]}

إعادة تركيب البروتين المستقلة عن تماثل التسلسل (SHIPREC)

تُنتج هذه الطريقة إعادة تركيب بين جينات ذات تشابه تسلسلي ضئيل أو معدوم. تُدمج هذه الجينات الهجينة عبر تسلسل رابط يحتوي على عدة مواقع تقييد. ثم يُهضم هذا التركيب باستخدام إنزيم DNase1. تُصنع شظايا ذات نهايات غير لاصقة باستخدام نوكلياز S1. تُجمع هذه الشظايا ذات النهايات غير اللاصقة في تسلسل دائري عن طريق الربط. ثم يُخطط هذا التركيب الدائري باستخدام إنزيمات تقييد توجد مواقع تقييدها في منطقة الرابط. ينتج عن ذلك مكتبة من الجينات الهجينة حيث ينعكس فيها توزيع الجينات على النهايتين 5' و3' مقارنةً بالتركيب الأصلي. ^{[ 5 ]}

التخلق الكيميائي الموجه للموقع المستقل عن التسلسل (SISDC)

تُنتج هذه الطريقة مكتبة جينية تحتوي على عمليات عبور متعددة من عدة جينات أبوية. لا تتطلب هذه الطريقة تطابقًا في تسلسل الجينات الأبوية، ولكنها تتطلب وجود حمض أميني واحد أو اثنين محفوظين في كل موقع عبور. تبدأ العملية بمحاذاة التسلسلات الأبوية وتحديد المناطق المتفق عليها التي تعمل كمواقع عبور. يلي ذلك دمج علامات محددة تحتوي على مواقع تقييد، ثم إزالة هذه العلامات عن طريق الهضم باستخدام إنزيم Bac1، مما ينتج عنه جينات ذات نهايات متماسكة. تُخلط هذه الشظايا الجينية وتُربط بترتيب مناسب لتكوين مكتبات جينية هجينة. ^{[ 5 ]}

إعادة التركيب المتماثل المزدوج المتدهور (DHR)

تبدأ هذه الطريقة بمحاذاة الجينات المتماثلة، ثم تحديد مناطق التعدد الشكلي. بعد ذلك، يُقسّم الشريط العلوي للجين إلى أوليغونوكليوتيدات صغيرة متحللة. ويُهضم الشريط السفلي أيضًا إلى أوليغونوكليوتيدات لتكون بمثابة دعامات. تُجمع هذه الشظايا في محلول، حيث تُركّب أوليغونوكليوتيدات الشريط العلوي على أوليغونوكليوتيدات الشريط السفلي. تُملأ الفجوات بين هذه الشظايا باستخدام البوليميراز، ثم تُربط. ^{[ 5 ]}

تفاعل البوليميراز المتسلسل العشوائي متعدد التركيب (RM-PCR)

تتضمن هذه الطريقة إعادة ترتيب أجزاء متعددة من الحمض النووي (DNA) غير المتماثلة، في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) واحد. وينتج عن ذلك إعادة بناء البروتينات الكاملة من خلال تجميع وحدات ترميزية لوحدات هيكلية مختلفة. ^{[ 5 ]}

إعادة تركيب الحمض النووي سهلة الاستخدام (USERec)

تبدأ هذه الطريقة بتضخيم أجزاء الجينات المراد إعادة تركيبها، باستخدام نيوكليوتيدات اليوراسيل (dNTPs). يحتوي محلول التضخيم أيضًا على بادئات، وإنزيم PfuTurbo، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Cx Hotstart. تُحضن نواتج التضخيم بعد ذلك مع إنزيم USER، الذي يحفز إزالة بقايا اليوراسيل من الحمض النووي، مُحدثًا فجوات أحادية القاعدة. تُخلط الأجزاء المعالجة بإنزيم USER وتُربط باستخدام إنزيم T4 DNA ligase، ثم تُخضع لهضم Dpn1 لإزالة قالب الحمض النووي. تُخضع هذه الأجزاء الناتجة، ذات السلسلة المزدوجة، للتضخيم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ثم تُنقل إلى بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli). ^{[ 5 ]}

إعادة تركيب غولدن غيت (GGS)

تتيح هذه الطريقة إعادة تركيب ما لا يقل عن 9 أجزاء مختلفة في ناقل مستقبل باستخدام إنزيم تقييد من النوع الثاني، والذي يقطع خارج مواقع التقييد. تبدأ العملية باستنساخ الأجزاء في نواقل منفصلة لإنشاء تسلسلات Bsa1 المجاورة على كلا الجانبين. ثم تُقطع هذه النواقل باستخدام إنزيم التقييد Bsa1 من النوع الثاني، مما يُنتج أربعة نهايات أحادية السلسلة من النيوكليوتيدات. تُهجن الأجزاء ذات النهايات المكملة وتُربط باستخدام إنزيم T4 DNA ligase. وأخيرًا، تُنقل هذه التركيبات إلى خلايا الإشريكية القولونية، والتي تُفحص مستويات التعبير الجيني فيها. ^{[ 5 ]}

طريقة إعادة تركيب الحمض النووي القائمة على الفوسفورو ثيوات (PRTec)

يمكن استخدام هذه الطريقة لإعادة تركيب العناصر البنيوية أو نطاقات البروتين الكاملة. تعتمد هذه الطريقة على كيمياء الفوسفوروثيوات التي تسمح بالفصل النوعي لروابط الفوسفوروثيودايستر. تبدأ الخطوة الأولى في العملية بتضخيم الأجزاء المراد إعادة تركيبها مع هيكل الناقل. يتم هذا التضخيم باستخدام بادئات تحتوي على نيوكليوتيدات فوسفوروثيواتية في نهاياتها 5'. تُفصل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُضخمة في محلول إيثانول-يود عند درجات حرارة عالية. بعد ذلك، تُهجن هذه الأجزاء عند درجة حرارة الغرفة وتُنقل إلى بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) التي تُصلح أي شقوق. ^{[ 5 ]}

إنتغرون

يعتمد هذا النظام على نظام إعادة تركيب طبيعي خاص بموقع محدد في بكتيريا الإشريكية القولونية. يُسمى هذا النظام بنظام الإنتغرون، ويُنتج إعادة ترتيب طبيعية للجينات. استُخدمت هذه الطريقة لبناء وتحسين أوبيرون وظيفي لتخليق التربتوفان في بكتيريا الإشريكية القولونية المُفتقرة إلى التربتوفان، وذلك عن طريق إدخال كاسيتات إعادة تركيب فردية أو جينات trpA-E مع عناصر تنظيمية ضمن نظام الإنتغرون. ^{[ 5 ]}

الخلط القائم على الربط على شكل حرف Y (YLBS)

تُنتج هذه الطريقة خيوطًا مفردة من الحمض النووي، تتضمن تسلسلًا واحدًا إما في الطرف 5' أو 3'، وتسلسلات مكملة في منطقة الحلقة الجذعية، ومنطقة تفرع D تعمل كموقع ارتباط للبادئات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تُخلط كميات متساوية من نصفي الخيوط 5' و3' لتكوين هجين نتيجةً للتكامل في منطقة الحلقة الجذعية. ثم تُربط الهجائن ذات الطرف 5' المفسفر الحر في نصفي الخيوط 3' مع النهايات 3' الحرة في نصفي الخيوط 5' باستخدام إنزيم T4 DNA ligase بوجود 0.1 ملي مول من ATP. بعد ذلك، تُضخّم نواتج الربط بنوعين من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنتاج نواتج PCR لنصفي الخيوط 5' و3'. تُحوّل نواتج PCR هذه إلى خيوط مفردة عبر ارتباط الأفيدين-بيوتين بالطرف 5' للبادئات التي تحتوي على تسلسلات الحلقة الجذعية الموسومة بالبيوتين. بعد ذلك، تُستخدم أنصاف الخيوط 5' المُبيوتينية وأنصاف الخيوط 3' غير المُبيوتينية كأنصاف خيوط 5' و 3' لدورة ربط Y التالية. ^{[ 5 ]}

التصميم شبه العقلاني

يعتمد التصميم شبه العقلاني على معلومات حول تسلسل البروتينات وبنيتها ووظيفتها، بالتزامن مع خوارزميات تنبؤية. وتُستخدم هذه المعلومات مجتمعةً لتحديد بقايا الأحماض الأمينية المستهدفة التي يُرجح أن تؤثر على وظيفة البروتين. وتُؤدي طفرات هذه الأحماض الأمينية الرئيسية إلى إنشاء مكتبات من البروتينات الطافرة التي يُرجح أن تمتلك خصائص مُحسّنة. ^{[ 11 ]}

تُتيح التطورات في هندسة الإنزيمات شبه العقلانية وتصميم الإنزيمات من الصفر للباحثين أُطرًا فعّالة لمعالجة المحفزات الحيوية. وقد أثبت دمج المناهج القائمة على التسلسل والبنية في إعادة تصميم الإنزيمات قدرته على تقليل عدد التكرارات بشكل ملحوظ، مما يُغني عن الحاجة إلى التحليل عالي الإنتاجية. مع ذلك، فإن أساليب التصميم من الصفر وإعادة التصميم الحاسوبية الحالية أقل كفاءة من المتغيرات المُطوَّرة من حيث الأداء التحفيزي. ولتضييق هذه الفجوة، يُتوقع أن تُسهم تحسينات خوارزميات التصميم - مثل دمج ديناميكيات البروتين في عمليات المحاكاة المستقبلية - في زيادة دقة التنبؤات البنيوية وتعزيز القدرة التحفيزية. ^{[ 11 ]}

ستكون الدراسات البيوكيميائية والبيوفيزيائية، إلى جانب تحسين الأطر التنبؤية، مفيدة لتقييم الأهمية الوظيفية لخصائص التصميم الفردية تجريبياً. وسيؤدي فهم أفضل لهذه المساهمات الوظيفية إلى توفير تغذية راجعة لتحسين التصاميم المستقبلية. ^{[ 11 ]}

من المرجح ألا يُستبدل التطور الموجه كطريقة مُفضلة لهندسة البروتينات، على الرغم من أن تصميم البروتينات الحاسوبي قد غيّر جذريًا طريقة معالجة الجزيئات الحيوية الكبيرة في هندسة البروتينات. يُمكن توليد مكتبات أصغر حجمًا وأكثر تركيزًا وغنىً وظيفيًا باستخدام طرق تتضمن أُطرًا تنبؤية لهندسة البروتينات القائمة على الفرضيات. بدأت استراتيجيات التصميم الجديدة والتقدم التقني في الابتعاد عن البروتوكولات التقليدية، مثل التطور الموجه، الذي يُمثل الاستراتيجية الأكثر فعالية لتحديد أفضل المرشحين أداءً في المكتبات المُركزة. يحل تركيب مكتبات الجينات الكاملة محل بروتوكولات إعادة الترتيب والطفرات في تحضير المكتبات. كما يتم تطبيق فحوصات الفرز منخفضة الإنتاجية عالية التخصص بشكل متزايد بدلًا من جهود الفرز والاختيار الضخمة لملايين المرشحين. مجتمعةً، تُهيئ هذه التطورات لنقل هندسة البروتينات إلى ما هو أبعد من التطور الموجه، نحو استراتيجيات عملية وأكثر كفاءة لتخصيص المحفزات الحيوية. ^{[ 11 ]}

تقنيات الفرز والاختيار

بعد أن يخضع البروتين للتطور الموجه، أو تصميم الحصة، أو تصميم الحصة شبه الموجه، يجب فحص مكتبات البروتينات الطافرة لتحديد الطفرات التي تُظهر خصائص مُحسَّنة. تُعدّ طرق عرض العاثيات أحد الخيارات لفحص البروتينات. تتضمن هذه الطريقة دمج الجينات التي تُشفِّر عديدات الببتيد المتغيرة مع جينات بروتين غلاف العاثية. يتم اختيار متغيرات البروتين المُعبَّر عنها على أسطح العاثيات عن طريق الارتباط بأهداف مُثبَّتة في المختبر. بعد ذلك، يتم تضخيم العاثيات التي تحمل متغيرات البروتين المُختارة في البكتيريا، يليها تحديد المستنسخات الإيجابية بواسطة مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم. ثم تُخضع هذه العاثيات المُختارة لتسلسل الحمض النووي. ^{[ 5 ]}

يمكن أيضًا استخدام أنظمة عرض البروتينات على سطح الخلية لفحص مكتبات عديدات الببتيد الطافرة. تُدمج جينات الطفرات في المكتبة ضمن نواقل التعبير، والتي تُنقل بعد ذلك إلى خلايا مضيفة مناسبة. تخضع هذه الخلايا المضيفة لمزيد من طرق الفحص عالية الإنتاجية لتحديد الخلايا ذات الأنماط الظاهرية المطلوبة. ^{[ 5 ]}

طُوِّرت أنظمة العرض الخالية من الخلايا للاستفادة من ترجمة البروتين في المختبر أو الترجمة الخالية من الخلايا. تشمل هذه الطرق عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، وعرض الريبوسوم، وعرض الحمض النووي (DNA) بروابط تساهمية وغير تساهمية، والتجزئة الخلوية في المختبر . ^{[ 5 ]}^{: 53}

هندسة الإنزيمات

الهندسة الإنزيمية هي تطبيق تعديل بنية الإنزيم (وبالتالي وظيفته) أو تعديل النشاط التحفيزي للإنزيمات المعزولة لإنتاج مستقلبات جديدة، أو للسماح بمسارات جديدة (محفزة) لحدوث التفاعلات، ^{[ 12 ]} أو لتحويل مركبات معينة إلى أخرى ( التحول الحيوي ). تُستخدم هذه المنتجات كمواد كيميائية، ومستحضرات صيدلانية، ووقود، وأغذية، ومضافات زراعية.

يتكون مفاعل الإنزيم ^{[ 13 ]} من وعاء يحتوي على وسط تفاعلي يُستخدم لإجراء التحويل المطلوب بواسطة الإنزيمات. وتكون الإنزيمات المستخدمة في هذه العملية حرة في المحلول.

أمثلة على البروتينات المهندسة

استُخدمت أساليب الحوسبة لتصميم بروتين ذي بنية جديدة، مثل Top7 ، ^{[ 14 ]} ومستشعرات للجزيئات غير الطبيعية. ^{[ 15 ]} وقد أسفرت هندسة البروتينات المدمجة عن دواء ريلوناسيبت ، وهو دواء حصل على موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لعلاج متلازمة كريوبيرين الدورية .

نجحت طريقة حسابية أخرى، تُعرف باسم IPRO، في هندسة تغيير خصوصية العامل المساعد لإنزيم اختزال الزيلوز في فطر كانديدا بويديني . ^{[ 16 ]} تعتمد طريقة إعادة تصميم البروتين وتحسينه التكراري (IPRO) على إعادة تصميم البروتينات لزيادة خصوصيتها تجاه الركائز والعوامل المساعدة الأصلية أو الجديدة، أو لمنحها خصوصية أكبر. ويتم ذلك من خلال تغيير بنية البروتينات بشكل عشوائي ومتكرر حول مواقع تصميم محددة، وتحديد أقل توليفة طاقة من المتصاوغات الدورانية ، وتحديد ما إذا كان التصميم الجديد يتمتع بطاقة ارتباط أقل من التصاميم السابقة. تسمح الطبيعة التكرارية لهذه العملية لـ IPRO بإجراء طفرات تراكمية على تسلسل البروتين، مما يُحسّن بشكل جماعي الخصوصية تجاه الركائز و/أو العوامل المساعدة المطلوبة. ^{[ 16 ]}

استُخدم التصميم بمساعدة الحاسوب أيضًا لهندسة خصائص معقدة لتجميع بروتيني نانوي عالي التنظيم. ^{[ 17 ]} يُعدّ بروتين القفص، وهو بكتيريوفيريتين الإشريكية القولونية (EcBfr)، الذي يُظهر بطبيعته عدم استقرار بنيوي وسلوك تجميع ذاتي غير مكتمل من خلال وجود حالتين من حالات التجميع، البروتين النموذجي في هذه الدراسة. من خلال التحليل الحاسوبي والمقارنة مع نظائره ، وُجد أن لهذا البروتين واجهة ثنائية أصغر من المتوسط على محور التناظر الثنائي الخاص به، ويعود ذلك أساسًا إلى وجود جيب مائي بيني متمركز على بقايا أسباراجين متصلة بجسر مائي. للتحقق من إمكانية هندسة EcBfr لتحسين استقراره البنيوي، استُخدمت طريقة حسابية شبه تجريبية لاستكشاف فروق الطاقة لـ 480 طفرة محتملة عند الواجهة الثنائية مقارنةً بالنوع البري EcBfr. كما تقاربت هذه الدراسة الحسابية أيضًا على بقايا الأسباراجين المتصلة بجسر مائي . يؤدي استبدال هذين الأسباراجينين بأحماض أمينية كارهة للماء إلى بروتينات تتخذ شكل مونومرات حلزونية ألفا وتتجمع في هياكل شبيهة بالأقفاص، كما يتضح من خلال قياس الاستقطاب الدائري والمجهر الإلكتروني النافذ. ويؤكد كل من التمسخ الحراري والكيميائي أن جميع البروتينات المُعاد تصميمها، بما يتوافق مع الحسابات، تتمتع بثبات مُعزز. إحدى الطفرات الثلاث تُغير التركيب لصالح حالة التجميع ذات الرتبة الأعلى في المحلول، كما يتضح من خلال كل من كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي والرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي. ^{[ 17 ]}

طُوِّرت طريقة حاسوبية ، تُدعى PoreDesigner، [ ^{18 ] لإعادة} تصميم بروتين القناة البكتيرية (OmpF) لتقليل حجم مسامها البالغ 1 نانومتر إلى أي بُعد دون النانومتر المطلوب. وكشفت تجارب النقل على أضيق المسام المصممة عن رفض كامل للأملاح عند تجميعها في مصفوفات بوليمرية كتلية تحاكي البنية الحيوية.

مراجع

↑ "هندسة البروتين - أحدث الأبحاث والأخبار | نيتشر" . www.nature.com . تاريخ الاطلاع: 24 يناير 2023 .
↑ وودلي، جون م. (مايو 2022). "دمج هندسة البروتين في توسيع نطاق العمليات الحيوية التحفيزية" . اتجاهات في الكيمياء . 4 (5): 371-373 . doi : 10.1016/j.trechm.2022.02.007 . S2CID 247489691 .
↑ "تسريع خط تجميع البروتين" . أخبار الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية . 13 فبراير 2015. مؤرشف من الأصل في 7 أبريل 2020. تم الاطلاع عليه في 7 أبريل 2020 .
↑ فارمر، تايلر سيا؛ بوهس، باتريك؛ كير، ديان (2017). "التصميم العقلاني لهندسة البروتين من خلال التعهيد الجماعي" . مجلة أبحاث الطلاب . 6 (2): 31-38 . doi : 10.47611/jsr.v6i2.377 . S2CID 57679002 .
١ ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ ٧ ٨ ٩ ١٠ ١١ ١٢ ١٣ ١٤ ١٥ ١٦ ١٧ ١٨ ١٩ ٢٠ ٢١ ٢٢ ٢٣ ٢٤ ٢٥ ٢٦ ٢٧ ٢٨ ٢٩ ٣٠ ٣١ ٣٢ ٣٣ ٣٤ ٣٥ ٣٦ ٣٧ ٣٨ ٣٩ ٤٠ ٤١ ٤٢ ٤٣ ٤٤ ٤٥ ٤٦ ٤٧ ٤٨ ٤٩ ٥٠ ٥١ ٥٢ ٥٣ ٥٤ ٥٥ ٥٦ ٥٧ ٥٨ ٥٩ ٦٠ ٦١ ٦٢ ٦٣ بولوري، كريشنا موهان؛ جولاتي، خوشبو (٢٠١٧). تقنيات هندسة البروتين . سلسلة سبرينغر الموجزة في العلوم والتكنولوجيا التطبيقية. سبرينغر. دوى : 10.1007 / 978-981-10-2732-1 . رقم ISBN 978-981-10-2731-4.
↑ ليو، كاسي جيه؛ كوكران، جينيفر آر (2014)، "هندسة العلاجات البروتينية متعددة التكافؤ ومتعددة التخصصات" ، في كاي، ويبو (محرر)، الهندسة في الطب الانتقالي ، لندن: سبرينغر، ص 365-396 ، doi : 10.1007/978-1-4471-4372-7_14 ، ISBN 978-1-4471-4372-7تم الاطلاع عليه بتاريخ 2021-12-08
↑ هوليجر، ب.؛ بروسبيرو، ت.؛ وينتر، ج. (15-07-1993). ""الأجسام المضادة ثنائية التكافؤ: أجزاء صغيرة من الأجسام المضادة ثنائية التكافؤ وثنائية التخصص" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 90 (14): 6444-6448 . Bibcode : 1993PNAS...90.6444H . doi : 10.1073/pnas.90.14.6444 . ISSN 0027-8424 . PMC 46948. PMID 8341653 .
↑ برينكمان، أولريش؛ كونترمان، رولاند إي . (17 فبراير 2017). "صناعة الأجسام المضادة ثنائية التخصص" . mAbs . 9 (2): 182–212 . doi : 10.1080/19420862.2016.1268307 . ISSN 1942-0862 . PMC 5297537. PMID 28071970 .
↑ جاكيل، كريستيان؛ كاست، بيتر؛ هيلفرت، دونالد (يونيو 2008). "تصميم البروتين عن طريق التطور الموجه". المراجعة السنوية للفيزياء الحيوية . 37 (1): 153-173 . doi : 10.1146/annurev.biophys.37.032807.125832 . PMID 18573077 .
↑ شيفانج، أمول ف؛ ماريينهاجن، يان؛ موندهادا، هيمانشو؛ شينك، ألكسندر؛ شوانبيرج، أولريش (2009). "تطورات في توليد التنوع الوظيفي للتطور الموجه للبروتين". الرأي الحالي في البيولوجيا الكيميائية . 13 (1): 19-25 . doi : 10.1016/j.cbpa.2009.01.019 . PMID 19261539 .
1 2 3 4 لوتز، ستيفان (ديسمبر 2010). "ما وراء التطور الموجه - هندسة وتصميم البروتينات شبه العقلانية" . الرأي الحالي في التكنولوجيا الحيوية . 21 (6): 734-743 . Bibcode : 2010COBt...21..734L . doi : 10.1016/ j.copbio.2010.08.011 . PMC 2982887. PMID 20869867 .
↑ ""الإنزيمات المصممة التي ابتكرها الكيميائيون لها استخدامات دفاعية وطبية" . ساينس ديلي . 20 مارس 2008.
↑ "مفاعلات الإنزيمات" . مؤرشف من الأصل بتاريخ 2012-05-02 . تم الاطلاع عليه بتاريخ 2013-11-02 .
↑ كولمان، برايان؛ دانتاس، غوتام؛ إيريتون، غريغوري سي؛ فاراني، غابرييل؛ ستودارد، باري إل؛ وبيكر، ديفيد (2003)، "تصميم طية بروتينية كروية جديدة بدقة على المستوى الذري"، مجلة ساينس ، 302 (5649): 1364-1368 ، رمز Bibcode : 2003Sci...302.1364K ، doi : 10.1126/science.1089427 ، PMID 14631033 ، S2CID 1939390
↑ لوغر، لورين ل.؛ دوير، ماري أ.؛ سميث، جيمس ج.؛ وهيلينغا، هوم و. (2003)، "التصميم الحاسوبي لبروتينات المستقبلات والمستشعرات ذات الوظائف الجديدة"، مجلة نيتشر ، 423 (6936): 185-190 ، رمز Bibcode : 2003Natur.423..185L ، doi : 10.1038/nature01556 ، PMID 12736688 ، S2CID 4387641
1 2 خوري، غ. أ.؛ فازلينيا، هـ.؛ تشين، ج. و.؛ بانتازيس، ر. ج.؛ سيرينو، ب. س.؛ ماراناس، س. د. (أكتوبر 2009)، "التصميم الحاسوبي لإنزيم اختزال الزيلوز من كانديدا بويديني لتغيير خصوصية العامل المساعد"، علم البروتين ، 18 (10): 2125-38 ، doi : 10.1002/pro.227 ، PMC 2786976 ، PMID 19693930
1 2 أردجاني، إم إس؛ لي، إن إكس؛ أورنر، بي بي (أبريل 2011)، "تثبيت قفص نانوي بروتيني من خلال سد جيب مائي بين البروتينات"، الكيمياء الحيوية ، 50 (19): 4029-4037 ، doi : 10.1021/bi200207w ، PMID 21488690
↑ تشودري، راتول؛ رين، تينغوي؛ شانكلا، مانيش؛ ديكر، كارل؛ غريسوود، ماثيو؛ برابهاكار، جيفان؛ بيكر، كارول؛ غولبيك، جون هـ.؛ أكسيمينتييف، أليكسي؛ كومار، مانيش؛ ماراناس، كوستاس د. (10 سبتمبر 2018). "مصمم المسام لضبط انتقائية المذاب في مسام غشاء خارجي قوي وعالي النفاذية" . نيتشر كوميونيكيشنز . 9 (1): 3661. Bibcode : 2018NatCo...9.3661C . doi : 10.1038/ s41467-018-06097-1 . PMC 6131167. PMID 30202038 .

روابط خارجية

خوادم هندسة البروتين ( مؤرشفة بتاريخ 18 يوليو 2011 في أرشيف الإنترنت Wayback Machine) ومواضيع ذات صلة مستندة إلى برنامج WHAT IF
إنزيمات مصممة من الصفر - باحثون يصممون محفزات لم يسبق لها مثيل باستخدام تقنية حسابية جديدة، مجلة التكنولوجيا ، 10 مارس 2008

[1] "هندسة البروتين - أحدث الأبحاث والأخبار | نيتشر" . www.nature.com . تاريخ الاطلاع: 24 يناير 2023 .

[2] وودلي، جون م. (مايو 2022). "دمج هندسة البروتين في توسيع نطاق العمليات الحيوية التحفيزية" . اتجاهات في الكيمياء . 4 (5): 371-373 . doi : 10.1016/j.trechm.2022.02.007 . S2CID 247489691 .

[3] "تسريع خط تجميع البروتين" . أخبار الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية . 13 فبراير 2015. مؤرشف من الأصل في 7 أبريل 2020. تم الاطلاع عليه في 7 أبريل 2020 .

[4] فارمر، تايلر سيا؛ بوهس، باتريك؛ كير، ديان (2017). "التصميم العقلاني لهندسة البروتين من خلال التعهيد الجماعي" . مجلة أبحاث الطلاب . 6 (2): 31-38 . doi : 10.47611/jsr.v6i2.377 . S2CID 57679002 .

[PoluriBook-5] ١ ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ ٧ ٨ ٩ ١٠ ١١ ١٢ ١٣ ١٤ ١٥ ١٦ ١٧ ١٨ ١٩ ٢٠ ٢١ ٢٢ ٢٣ ٢٤ ٢٥ ٢٦ ٢٧ ٢٨ ٢٩ ٣٠ ٣١ ٣٢ ٣٣ ٣٤ ٣٥ ٣٦ ٣٧ ٣٨ ٣٩ ٤٠ ٤١ ٤٢ ٤٣ ٤٤ ٤٥ ٤٦ ٤٧ ٤٨ ٤٩ ٥٠ ٥١ ٥٢ ٥٣ ٥٤ ٥٥ ٥٦ ٥٧ ٥٨ ٥٩ ٦٠ ٦١ ٦٢ ٦٣ بولوري، كريشنا موهان؛ جولاتي، خوشبو (٢٠١٧). تقنيات هندسة البروتين . سلسلة سبرينغر الموجزة في العلوم والتكنولوجيا التطبيقية. سبرينغر. دوى : 10.1007 / 978-981-10-2732-1 . رقم ISBN 978-981-10-2731-4.

[6] ليو، كاسي جيه؛ كوكران، جينيفر آر (2014)، "هندسة العلاجات البروتينية متعددة التكافؤ ومتعددة التخصصات" ، في كاي، ويبو (محرر)، الهندسة في الطب الانتقالي ، لندن: سبرينغر، ص 365-396 ، doi : 10.1007/978-1-4471-4372-7_14 ، ISBN 978-1-4471-4372-7تم الاطلاع عليه بتاريخ 2021-12-08

[7] هوليجر، ب.؛ بروسبيرو، ت.؛ وينتر، ج. (15-07-1993). ""الأجسام المضادة ثنائية التكافؤ: أجزاء صغيرة من الأجسام المضادة ثنائية التكافؤ وثنائية التخصص" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 90 (14): 6444-6448 . Bibcode : 1993PNAS...90.6444H . doi : 10.1073/pnas.90.14.6444 . ISSN 0027-8424 . PMC 46948. PMID 8341653 .

[8] برينكمان، أولريش؛ كونترمان، رولاند إي . (17 فبراير 2017). "صناعة الأجسام المضادة ثنائية التخصص" . mAbs . 9 (2): 182–212 . doi : 10.1080/19420862.2016.1268307 . ISSN 1942-0862 . PMC 5297537. PMID 28071970 .

[9] جاكيل، كريستيان؛ كاست، بيتر؛ هيلفرت، دونالد (يونيو 2008). "تصميم البروتين عن طريق التطور الموجه". المراجعة السنوية للفيزياء الحيوية . 37 (1): 153-173 . doi : 10.1146/annurev.biophys.37.032807.125832 . PMID 18573077 .

[10] شيفانج، أمول ف؛ ماريينهاجن، يان؛ موندهادا، هيمانشو؛ شينك، ألكسندر؛ شوانبيرج، أولريش (2009). "تطورات في توليد التنوع الوظيفي للتطور الموجه للبروتين". الرأي الحالي في البيولوجيا الكيميائية . 13 (1): 19-25 . doi : 10.1016/j.cbpa.2009.01.019 . PMID 19261539 .

[pmid20869867-11] 1 2 3 4 لوتز، ستيفان (ديسمبر 2010). "ما وراء التطور الموجه - هندسة وتصميم البروتينات شبه العقلانية" . الرأي الحالي في التكنولوجيا الحيوية . 21 (6): 734-743 . Bibcode : 2010COBt...21..734L . doi : 10.1016/ j.copbio.2010.08.011 . PMC 2982887. PMID 20869867 .

[12] ""الإنزيمات المصممة التي ابتكرها الكيميائيون لها استخدامات دفاعية وطبية" . ساينس ديلي . 20 مارس 2008.

[13] "مفاعلات الإنزيمات" . مؤرشف من الأصل بتاريخ 2012-05-02 . تم الاطلاع عليه بتاريخ 2013-11-02 .

[14] كولمان، برايان؛ دانتاس، غوتام؛ إيريتون، غريغوري سي؛ فاراني، غابرييل؛ ستودارد، باري إل؛ وبيكر، ديفيد (2003)، "تصميم طية بروتينية كروية جديدة بدقة على المستوى الذري"، مجلة ساينس ، 302 (5649): 1364-1368 ، رمز Bibcode : 2003Sci...302.1364K ، doi : 10.1126/science.1089427 ، PMID 14631033 ، S2CID 1939390

[15] لوغر، لورين ل.؛ دوير، ماري أ.؛ سميث، جيمس ج.؛ وهيلينغا، هوم و. (2003)، "التصميم الحاسوبي لبروتينات المستقبلات والمستشعرات ذات الوظائف الجديدة"، مجلة نيتشر ، 423 (6936): 185-190 ، رمز Bibcode : 2003Natur.423..185L ، doi : 10.1038/nature01556 ، PMID 12736688 ، S2CID 4387641

[chin-16] 1 2 خوري، غ. أ.؛ فازلينيا، هـ.؛ تشين، ج. و.؛ بانتازيس، ر. ج.؛ سيرينو، ب. س.؛ ماراناس، س. د. (أكتوبر 2009)، "التصميم الحاسوبي لإنزيم اختزال الزيلوز من كانديدا بويديني لتغيير خصوصية العامل المساعد"، علم البروتين ، 18 (10): 2125-38 ، doi : 10.1002/pro.227 ، PMC 2786976 ، PMID 19693930

[Ardejani-17] 1 2 أردجاني، إم إس؛ لي، إن إكس؛ أورنر، بي بي (أبريل 2011)، "تثبيت قفص نانوي بروتيني من خلال سد جيب مائي بين البروتينات"، الكيمياء الحيوية ، 50 (19): 4029-4037 ، doi : 10.1021/bi200207w ، PMID 21488690

[18] تشودري، راتول؛ رين، تينغوي؛ شانكلا، مانيش؛ ديكر، كارل؛ غريسوود، ماثيو؛ برابهاكار، جيفان؛ بيكر، كارول؛ غولبيك، جون هـ.؛ أكسيمينتييف، أليكسي؛ كومار، مانيش؛ ماراناس، كوستاس د. (10 سبتمبر 2018). "مصمم المسام لضبط انتقائية المذاب في مسام غشاء خارجي قوي وعالي النفاذية" . نيتشر كوميونيكيشنز . 9 (1): 3661. Bibcode : 2018NatCo...9.3661C . doi : 10.1038/ s41467-018-06097-1 . PMC 6131167. PMID 30202038 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

18 ] لإعادة