التخليق الجيني الاصطناعي

📅 آخر تحديث: ١ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ١ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 11 صور
الموسوعة الحرة

يشير مصطلح التخليق الجيني الاصطناعي ، أو ببساطة تخليق الجينات ، إلى مجموعة من الطرق المستخدمة في البيولوجيا التركيبية لبناء وتجميع الجينات من النيوكليوتيدات من الصفر . على عكس تخليق الحمض النووي في الخلايا الحية، لا يتطلب التخليق الجيني الاصطناعي وجود قالب من الحمض النووي، مما يسمح بتخليق أي تسلسل من الحمض النووي تقريبًا في المختبر. يتألف هذا التخليق من خطوتين رئيسيتين، الأولى هي تخليق الحمض النووي على الطور الصلب ، والمعروفة أحيانًا باسم طباعة الحمض النووي . [ 1 ] ينتج عن هذه العملية شظايا قليلة النيوكليوتيدات ، يقل طولها عادةً عن 200 زوج قاعدي. أما الخطوة الثانية، فتتضمن ربط هذه الشظايا باستخدام طرق تجميع الحمض النووي المختلفة. ولأن التخليق الجيني الاصطناعي لا يتطلب وجود قالب من الحمض النووي، فمن الممكن نظريًا صنع جزيء حمض نووي اصطناعي بالكامل دون أي قيود على تسلسل النيوكليوتيدات أو حجمها.

أثبت هار غوبيند خورانا وزملاؤه تخليق أول جين كامل، وهو جين الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA ) الخاص بالخميرة ، عام 1972. [ 2 ] أُجري تخليق أول جينات ترميز الببتيدات والبروتينات في مختبري هربرت بوير وألكسندر ماركهام ، على التوالي. [ 3 ] [ 4 ] وفي الآونة الأخيرة، طُوّرت طرق لتخليق الجينات الاصطناعية تسمح بتجميع الكروموسومات والمجينات الكاملة. تم تخليق أول كروموسوم خميرة اصطناعي عام 2014، كما تم تخليق كروموسومات بكتيرية وظيفية كاملة. [ 5 ] إضافةً إلى ذلك، قد يستفيد تخليق الجينات الاصطناعي في المستقبل من أزواج قواعد نووية جديدة (أزواج قواعد غير طبيعية). [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]

الطرق القياسية لتخليق الحمض النووي

تخليق الأوليغونوكليوتيدات

تُصنّع الأوليغونوكليوتيدات كيميائيًا باستخدام وحدات بناء تُسمى فوسفوراميديتات النيوكليوزيد . قد تكون هذه الفوسفوراميديتات عادية أو مُعدّلة، حيث تحتوي على مجموعات حماية لمنع تفاعل مجموعات الأمين والهيدروكسيل والفوسفات فيها بشكل غير صحيح. تُضاف فوسفوراميديتة واحدة في كل مرة، ثم تُزال الحماية عن مجموعة الهيدروكسيل الموجودة في الطرف 5'، وتُضاف قاعدة جديدة، وهكذا. ينمو التسلسل في الاتجاه من 3' إلى 5'، وهو عكس اتجاه التخليق الحيوي. في النهاية، تُزال جميع مجموعات الحماية. مع ذلك، ونظرًا لكونها عملية كيميائية، تحدث العديد من التفاعلات غير الصحيحة، مما يؤدي إلى بعض المنتجات المعيبة. كلما زاد طول تسلسل الأوليغونوكليوتيد المُصنّع، زادت العيوب، لذا فإن هذه العملية عملية فقط لإنتاج تسلسلات قصيرة من النيوكليوتيدات . الحد العملي الحالي هو حوالي 200 زوج قاعدي (bp ) للأوليغونوكليوتيد ذي الجودة الكافية للاستخدام المباشر في التطبيقات البيولوجية. يمكن استخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) لعزل المنتجات ذات التسلسل الصحيح. في الوقت نفسه، يمكن تصنيع عدد كبير من الأوليغومرات بالتوازي على رقائق الجينات . وللحصول على الأداء الأمثل في إجراءات تصنيع الجينات اللاحقة، ينبغي تحضيرها بشكل فردي وعلى نطاق أوسع.

ربط قليل النوكليوتيدات باستخدام التلدين

عادةً، تُصنع مجموعة من النيوكليوتيدات المصممة بشكل فردي باستخدام أجهزة تركيب آلية على الطور الصلب، ثم تُنقى وتُربط معًا عبر عملية تلدين محددة وتفاعلات ربط أو بوليميراز قياسية . ولتحسين خصوصية تلدين النيوكليوتيدات، تعتمد خطوة التركيب على مجموعة من إنزيمات ربط وبوليميراز الحمض النووي المقاومة للحرارة . حتى الآن، وُصفت عدة طرق لتخليق الجينات، مثل ربط النيوكليوتيدات المتداخلة المفسفرة، [ 2 ] [ 3 ] وطريقة Fok I، [ 4 ] وشكل مُعدّل من تفاعل سلسلة الربط لتخليق الجينات. بالإضافة إلى ذلك، وُصفت عدة طرق لتجميع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) . [ 9 ] وتستخدم هذه الطرق عادةً نيوكليوتيدات يتراوح طولها بين 40 و50 نيوكليوتيدًا تتداخل مع بعضها البعض. صُممت هذه النيوكليوتيدات قليلة العدد لتغطية معظم تسلسل كلا الشريطين، ويتم توليد الجزيء كامل الطول تدريجيًا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل (OE-PCR) [ 9 ]، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوازن ديناميكيًا حراريًا من الداخل إلى الخارج (TBIO-PCR) [ 10 ] ، أو طرق مُدمجة. [ 11 ] يتراوح حجم الجينات المُصنّعة الأكثر شيوعًا بين 600 و1200 زوج قاعدي، على الرغم من أنه تم تصنيع جينات أطول بكثير عن طريق ربط أجزاء مُجمّعة مسبقًا يقل طولها عن 1000 زوج قاعدي. في هذا النطاق الحجمي، من الضروري اختبار العديد من النسخ المُرشّحة للتأكد من تسلسل الجين المُصنّع المُستنسخ باستخدام طرق التسلسل الآلي.

القيود

علاوة على ذلك، ولأن تجميع ناتج الجين كامل الطول يعتمد على محاذاة دقيقة وفعّالة لسلاسل قليلة النوكليوتيدات أحادية السلسلة الطويلة، فإن المعايير الحاسمة لنجاح التخليق تشمل مناطق تسلسلية ممتدة تتضمن بنى ثانوية ناتجة عن تكرارات معكوسة، أو محتوى GC مرتفع أو منخفض بشكل استثنائي، أو بنى متكررة. عادةً ما لا يمكن تخليق هذه الأجزاء من جين معين إلا بتقسيم العملية إلى عدة خطوات متتالية وتجميع نهائي لتسلسلات فرعية أقصر، مما يؤدي بدوره إلى زيادة كبيرة في الوقت والجهد اللازمين لإنتاجه. تعتمد نتيجة تجربة تخليق الجينات بشكل كبير على جودة قليل النوكليوتيدات المستخدمة. بالنسبة لبروتوكولات تخليق الجينات القائمة على التلدين، تعتمد جودة المنتج بشكل مباشر وأسّي على صحة قليل النوكليوتيدات المستخدمة. بدلاً من ذلك، بعد إجراء تخليق الجينات باستخدام قليل النوكليوتيدات ذات جودة أقل، يجب بذل المزيد من الجهد في ضمان الجودة اللاحق أثناء تحليل المستنسخات، والذي يتم عادةً من خلال إجراءات الاستنساخ والتسلسل القياسية التي تستغرق وقتًا طويلاً. من المشاكل الأخرى المرتبطة بجميع طرق تركيب الجينات الحالية ارتفاع معدل أخطاء التسلسل نتيجة استخدام قليل النوكليوتيدات المصنعة كيميائيًا. يزداد معدل الخطأ مع زيادة طول قليل النوكليوتيدات، وبالتالي تنخفض نسبة المنتج الصحيح بشكل كبير مع زيادة عدد قليل النوكليوتيدات المستخدمة. يمكن حل مشكلة الطفرات باستخدام قليل النوكليوتيدات أقصر لتجميع الجين. مع ذلك، تتطلب جميع طرق التجميع القائمة على التلدين خلط البادئات معًا في أنبوب واحد. في هذه الحالة، لا تسمح التداخلات الأقصر دائمًا بالتلدين الدقيق والمحدد للبادئات المتكاملة، مما يؤدي إلى تثبيط تكوين المنتج كامل الطول. يُعد التصميم اليدوي لقليل النوكليوتيدات إجراءً شاقًا ولا يضمن نجاح تركيب الجين المطلوب. لتحقيق الأداء الأمثل لجميع الطرق القائمة على التلدين تقريبًا، يُفترض أن تكون درجات انصهار المناطق المتداخلة متقاربة لجميع قليل النوكليوتيدات. يجب إجراء تحسين البادئات اللازم باستخدام برامج تصميم قليلة النوكليوتيدات المتخصصة. تم تقديم العديد من الحلول لتصميم البادئات الآلية لتخليق الجينات حتى الآن. [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]

إجراءات تصحيح الأخطاء

للتغلب على المشاكل المرتبطة بجودة الأوليغونوكليوتيدات، طُوِّرت عدة استراتيجيات مُعقَّدة، تستخدم إما أوليغونوكليوتيدات صيد مُحضَّرة بشكل منفصل، [ 15 ] أو إنزيمات ربط عدم التطابق من عائلة mutS ، [ 16 ] أو إنزيمات نووية داخلية مُحدَّدة من البكتيريا أو العاثيات. [ 17 ] ومع ذلك، فإن جميع هذه الاستراتيجيات تزيد من الوقت والتكاليف اللازمة لتخليق الجينات بناءً على تهجين الأوليغونوكليوتيدات المُصنَّعة كيميائيًا.

استُخدم التسلسل المتوازي عالي الإنتاجية كأداة لفحص مكتبات النيوكليوتيدات المعقدة واستخلاص الجزيئات الدقيقة. في إحدى الطرق، تُسلسل النيوكليوتيدات على منصة التسلسل الناري 454، ويقوم نظام آلي بتصوير واختيار الخرزات الفردية التي تتوافق مع التسلسل الدقيق. [ 18 ] وفي طريقة أخرى، تُعدّل مكتبة النيوكليوتيدات المعقدة بعلامات جانبية فريدة قبل التسلسل المتوازي عالي الإنتاجية. ثم تُمكّن البادئات الموجهة بالعلامات من استخلاص الجزيئات ذات التسلسلات المطلوبة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ذي الاتصال المباشر. [ 19 ]

تتزايد عمليات ترتيب الجينات في مجموعات تشمل الجينات ذات الصلة الوظيفية أو متغيرات تسلسلية متعددة على جين واحد. وتُحسَّن جميع البروتينات العلاجية قيد التطوير تقريبًا، مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، من خلال اختبار العديد من المتغيرات الجينية لتحسين وظيفتها أو تعبيرها. ولتحسين الكودونات تطبيقات في تصميم الجينات الاصطناعية ولقاحات الحمض النووي . وتشمل الأدوات الحديثة نماذج التعلم الآلي مثل ColiFormer، التي تستخدم خصائص التسلسل لتوجيه تحسين الكودونات؛ ويتوفر تطبيق مفتوح المصدر لها في فضاء Hugging Face Space العام. [ 20 ] [ 21 ]

أزواج القواعد غير الطبيعية

بينما يستخدم التخليق التقليدي للأحماض النووية 4 أزواج من القواعد فقط: الأدينين والثايمين والجوانين والسيتوزين ، فإن تخليق قليل النوكليوتيدات في المستقبل يمكن أن يتضمن استخدام أزواج قواعد غير طبيعية، وهي قواعد نووية مصممة ومصنعة بشكل اصطناعي لا توجد في الطبيعة.

في عام ٢٠١٢، نشر فريق من العلماء الأمريكيين بقيادة فلويد رومسبيرغ، عالم الأحياء الكيميائية في معهد سكريبس للأبحاث في سان دييغو، كاليفورنيا، أن فريقه صمم زوجًا قاعديًا غير طبيعي (UBP). سُمّي النيوكليوتيدان الاصطناعيان الجديدان، أو الزوج القاعدي غير الطبيعي (UBP)، d5SICS و dNaM . وبشكل أدق، يتميز هذان النيوكليوتيدان الاصطناعيان ، اللذان يحملان قواعد نووية كارهة للماء، بحلقتين عطريتين ملتحمتين تُشكلان مُركبًا (d5SICS–dNaM) أو زوجًا قاعديًا في الحمض النووي DNA. في عام ٢٠١٤، أفاد الفريق نفسه من معهد سكريبس للأبحاث أنهم قاموا بتخليق جزء من الحمض النووي الدائري يُعرف بالبلازميد، يحتوي على أزواج قاعدية طبيعية من نوع TA وCG بالإضافة إلى أفضل زوج قاعدي غير طبيعي (UBP) صممه مختبر رومسبيرغ، وأدخلوه في خلايا بكتيريا الإشريكية القولونية الشائعة ، التي نجحت في نسخ الأزواج القاعدية غير الطبيعية عبر أجيال متعددة. يُعد هذا أول مثال معروف لكائن حي ينقل شفرة وراثية موسعة إلى الأجيال اللاحقة. وقد تحقق ذلك جزئيًا بإضافة جين طحلبي داعم يُعبّر عن ناقل ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات ، والذي يستورد بكفاءة ثلاثي فوسفات كل من d5SICSTP وdNaMTP إلى بكتيريا الإشريكية القولونية . بعد ذلك، تستخدم مسارات التضاعف البكتيرية الطبيعية هذه الجزيئات لتضاعف البلازميد الذي يحتوي على d5SICS–dNaM بدقة.

يُعدّ إدخال زوج قاعدي ثالث بنجاح إنجازًا هامًا نحو هدف توسيع عدد الأحماض الأمينية التي يمكن ترميزها بواسطة الحمض النووي بشكل كبير، من 20 حمضًا أمينيًا حاليًا إلى 172 حمضًا أمينيًا نظريًا، مما يُعزز قدرة الكائنات الحية على إنتاج بروتينات جديدة . [ 22 ] في المستقبل، يُمكن تصنيع هذه الأزواج القاعدية غير الطبيعية وإدخالها في قليل النوكليوتيدات باستخدام تقنيات طباعة الحمض النووي.

تجميع الحمض النووي

وبالتالي، يمكن استخدام طباعة الحمض النووي لإنتاج أجزاء من الحمض النووي، والتي تُعرَّف بأنها تسلسلات من الحمض النووي تُشفِّر وظيفة بيولوجية محددة (على سبيل المثال، المحفزات ، أو تسلسلات تنظيم النسخ، أو أطر القراءة المفتوحة ). [ 23 ] ومع ذلك، ولأن تخليق قليل النوكليوتيدات لا يُمكنه عادةً إنتاج تسلسلات قليلة النوكليوتيدات بدقة تتجاوز بضع مئات من أزواج القواعد، فإنه لا بد من استخدام طرق تجميع الحمض النووي لربط هذه الأجزاء معًا لإنشاء جينات وظيفية، أو دوائر جينية متعددة، أو حتى كروموسومات أو جينومات اصطناعية كاملة. تُحدِّد بعض تقنيات تجميع الحمض النووي بروتوكولات ربط أجزاء الحمض النووي فقط، بينما تُحدِّد تقنيات أخرى أيضًا قواعد تنسيق أجزاء الحمض النووي المتوافقة معها. يُمكن توسيع نطاق هذه العمليات لتمكين تجميع كروموسومات أو جينومات كاملة. في السنوات الأخيرة، ازداد عدد معايير تجميع الحمض النووي المختلفة، حيث تم تطوير 14 معيارًا مختلفًا للتجميع حتى عام 2015، ولكل منها مزاياها وعيوبها. [ 24 ] بشكل عام، ساهم تطوير معايير تجميع الحمض النووي بشكل كبير في تسهيل سير العمل في مجال البيولوجيا التركيبية، وساعد في تبادل المواد بين المجموعات البحثية، كما أتاح إمكانية إنشاء أجزاء من الحمض النووي قابلة لإعادة الاستخدام وذات بنية معيارية. [ 24 ]

يمكن تصنيف طرق تجميع الحمض النووي المختلفة إلى ثلاث فئات رئيسية: التجميع بوساطة الإندونوكلياز، وإعادة التركيب الموضعي، والتجميع القائم على التداخل الطويل. [ 24 ] ولكل مجموعة من هذه الطرق خصائصها المميزة ومزاياها وقيودها الخاصة.

التجميع بوساطة الإندونوكلياز

الإنزيمات الداخلية هي إنزيمات تتعرف على أجزاء الحمض النووي وتقطعها، ويمكن استخدامها لتوجيه عملية تجميع الحمض النووي. من بين أنواع إنزيمات القطع المختلفة، تُعد إنزيمات القطع من النوع الثاني الأكثر شيوعًا واستخدامًا، نظرًا لوجود مواقع القطع الخاصة بها بالقرب من مواقع التعرف أو داخلها. ولذلك، تستفيد طرق التجميع المعتمدة على الإنزيمات الداخلية من هذه الخاصية لتحديد أجزاء الحمض النووي وبروتوكولات التجميع.

BioBricks

تجميع جزأين متوافقين مع BioBricks وفقًا لمعيار BBF RFC 10. تتيح معالجة الجزء العلوي باستخدام إنزيمي EcoRI وSpeI، والجزء السفلي باستخدام إنزيمي EcoRI وXbaI، التجميع بالتسلسل المطلوب. ولأن إنزيمي SpeI وXbaI يُنتجان نهايات متدلية متكاملة، فإنهما يُساعدان في ربط جزئي الحمض النووي معًا، مُنتجين تسلسلًا مُتبقيًا. يتم الحفاظ على جميع مواقع التقييد الأصلية في التركيب النهائي، والذي يُمكن استخدامه لاحقًا في تفاعلات BioBricks.

وُصِفَ معيار تجميع BioBricks وقُدِّمَ من قِبَل توم نايت في عام 2003، ويجري تحديثه باستمرار منذ ذلك الحين. [ 25 ] حاليًا، يُعدّ معيار التجميع 10، أو BBF RFC 10 ، المعيار الأكثر استخدامًا في BioBricks . يُحدِّد BioBricks تسلسلات البادئات واللواحق اللازمة لتوافق جزء الحمض النووي مع طريقة تجميع BioBricks، مما يسمح بربط جميع أجزاء الحمض النووي التي تأتي بتنسيق BioBricks.

يحتوي البادئة على مواقع التقييد للإنزيمات EcoRI وNotI وXBaI، بينما يحتوي اللاحقة على مواقع التقييد للإنزيمات SpeI وNotI وPstI. يجب ألا يحتوي جزء الحمض النووي خارج منطقتي البادئة واللاحقة على هذه المواقع. لربط جزأين من BioBrick معًا، يُهضم أحد البلازميدات باستخدام EcoRI وSpeI، بينما يُهضم البلازميد الثاني باستخدام EcoRI وXbaI. طرفا EcoRI المتدليان متكاملان، وبالتالي سيرتبطان معًا، بينما يُنتج SpeI وXbaI أيضًا أطرافًا متدلية متكاملة يمكن ربطها معًا. نظرًا لأن البلازميد الناتج يحتوي على تسلسلات البادئة واللاحقة الأصلية، يمكن استخدامه للربط مع المزيد من أجزاء BioBrick. [ 26 ] وبسبب هذه الخاصية، يُقال إن معيار تجميع BioBricks يتميز بطبيعته المتكررة . مع ذلك، ستتشكل أيضًا سلسلة "ندبة" (إما TACTAG أو TACTAGAG) بين وحدتي BioBrick المدمجتين. يمنع هذا استخدام وحدات BioBrick لإنشاء بروتينات اندماجية، حيث أن سلسلة الندبة المكونة من 6 أزواج قاعدية تشفر التيروسين وكودون توقف، مما يؤدي إلى إنهاء الترجمة بعد التعبير عن النطاق الأول، بينما تتسبب سلسلة الندبة المكونة من 8 أزواج قاعدية في حدوث انزياح في إطار القراءة ، مما يمنع القراءة المستمرة للكودونات. ولتوفير سلاسل ندبة بديلة، مثل سلسلة ندبة مكونة من 6 أزواج قاعدية، أو سلاسل ندبة لا تحتوي على كودونات توقف، تم تصميم معايير تجميع أخرى مثل BB-2 Assembly وBglBricks Assembly وSilver Assembly وFreiburg Assembly. [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]

على الرغم من أن أسهل طريقة لتجميع أجزاء BioBrick موصوفة أعلاه، إلا أن هناك أيضًا عدة طرق تجميع أخرى شائعة الاستخدام توفر مزايا عديدة مقارنةً بالتجميع القياسي. يسمح تجميع المضادات الحيوية الثلاثة (3A) باختيار التجميع الصحيح من خلال اختيار المضاد الحيوي، بينما يسعى تجميع الإدخال المُضخّم إلى التغلب على انخفاض كفاءة التحويل الملحوظة في تجميع 3A. [ 31 ] [ 32 ]

كما شكل معيار تجميع BioBrick مصدر إلهام لاستخدام أنواع أخرى من الإنزيمات النووية الداخلية لتجميع الحمض النووي. فعلى سبيل المثال، يستخدم كل من معيار iBrick ومعايير تجميع متجهات HomeRun إنزيمات نووية داخلية موجهة بدلاً من إنزيمات التقييد من النوع الثاني. [ 33 ] [ 34 ]

تجميع إنزيمات التقييد من النوع الثاني

تستخدم بعض طرق التجميع أيضًا إنزيمات القطع من النوع الثاني (Type IIs). وتختلف هذه الإنزيمات عن غيرها من النوع الثاني في أنها تقطع عدة أزواج قاعدية من موقع التعرف. ونتيجة لذلك، يمكن تعديل التسلسل المتدلي ليحتوي على التسلسل المطلوب. وهذا يمنح طرق التجميع من النوع الثاني ميزتين: فهي تُمكّن من التجميع دون ترك أي أثر، وتسمح بالتجميع متعدد الأجزاء في وعاء واحد. ومن طرق التجميع التي تستخدم إنزيمات القطع من النوع الثاني طريقة Golden Gate ومتغيراتها.

استنساخ بوابة غولدن غيت
يمكن توجيه تسلسل أجزاء الحمض النووي لتجميع غولدن غيت بتحديد نهايات متراكبة مكملة فريدة لكل جزء. فعلى سبيل المثال، لتجميع الجين 1 بالترتيب A وB وC، تكون النهاية المتراكبة 3' للجزء A مكملة للنهاية المتراكبة 5' للجزء B، وكذلك بالنسبة للجزء B والجزء C. بالنسبة للبلازميد المستهدف، يُحاط الواسم الانتقائي بمواقع تقييد BsaI القاطعة للخارج. يؤدي ذلك إلى استئصال الواسم الانتقائي، مما يسمح بإدخال التركيب النهائي. يُستخدم إنزيم T4 ليغاز لربط الأجزاء معًا ومع البلازميد المستهدف.

تم تعريف بروتوكول تجميع غولدن غيت من قِبل إنجلر وآخرون عام 2008 لتحديد طريقة تجميع الحمض النووي التي تُنتج بنية نهائية خالية من تسلسل الندبة، مع غياب مواقع التقييد الأصلية. يسمح هذا بالتعبير عن البروتين دون احتواء تسلسلات بروتينية غير مرغوب فيها قد تؤثر سلبًا على طي البروتين أو تعبيره. باستخدام إنزيم التقييد BsaI الذي يُنتج امتدادًا بطول 4 أزواج قاعدية، يُمكن استخدام ما يصل إلى 240 تسلسلًا فريدًا غير متناظر للتجميع. [ 35 ]

تصميم وتجميع البلازميد

في تقنية استنساخ غولدن غيت، يُوضع كل جزء من الحمض النووي المراد تجميعه في بلازميد، محاطًا بمواقع تقييد BsaI داخلية تحتوي على تسلسلات التداخل المُبرمجة. بالنسبة لكل جزء من الحمض النووي، يكون تسلسل التداخل 3' مكملاً لتسلسل التداخل 5' لجزء الحمض النووي التالي في اتجاه المصب. بالنسبة للجزء الأول، يكون تسلسل التداخل 5' مكملاً لتسلسل التداخل 5' للبلازميد المستهدف، بينما يكون تسلسل التداخل 3' للجزء الأخير مكملاً لتسلسل التداخل 3' للبلازميد المستهدف. يسمح هذا التصميم بتجميع جميع أجزاء الحمض النووي في تفاعل واحد (حيث تُخلط جميع المواد المتفاعلة معًا)، مع ترتيب جميع الأجزاء بالتسلسل الصحيح. يتم اختيار التركيبات المُجمّعة بنجاح عن طريق الكشف عن فقدان وظيفة كاسيت الفحص الذي كان موجودًا في الأصل في البلازميد المستهدف. [ 35 ]

موكلو والضفيرة الذهبية

لا يسمح تجميع البوابة الذهبية الأصلي إلا بإنشاء بنية واحدة في متجه الوجهة. ولتمكين استخدام هذه البنية في تفاعل لاحق كمتجه دخول، تم تصميم معايير MoClo و Golden Braid. [ 36 ]

يتضمن معيار MoClo تحديد مستويات متعددة لتجميع الحمض النووي:

  • يسمح معيار تجميع MoClo بتجميع تركيبات Golden Gate في مستويات لاحقة. في المثال المذكور هنا، يتم تجميع أربعة جينات تم تجميعها عبر المستوى الأول من تجميع Golden Gate في تركيب متعدد الجينات في المستوى الثاني.
    يعتمد معيار تجميع Golden Braid أيضًا على المستوى الأول من تجميع Golden Gate، ويُجمّع مستويات إضافية عبر بروتوكول ثنائي. تُجمّع أربعة متجهات وجهة من المستوى الأول (مُجمّعة عبر تجميع Golden Gate) في متجهي وجهة من المستوى الثاني، واللذان يُستخدمان بعد ذلك كمتجهي دخول من المستوى الثالث لمتجه الوجهة من المستوى الثالث. تُستخدم إنزيمات تقييد متناوبة (BpiI للمستوى الثاني وBsaI للمستوى الثالث).
    تُعد معايير التجميع MoClo و Golden Braid مشتقة من معيار التجميع الأصلي Golden Gate.
    المستوى الأول: يُعدّ تجميع المستوى الأول هو تجميع غولدن غيت القياسي، حيث تُجمّع الجينات من أجزائها المكونة (أجزاء الحمض النووي التي تُشفّر العناصر الوراثية مثل المناطق غير المترجمة ، والمحفزات، ومواقع ارتباط الريبوسوم، أو تسلسلات الإنهاء ). ويُحيط بموقع إدخال نواقل الوجهة في المستوى الأول زوج من مواقع التقييد BpiI للقطع الداخلي. وهذا يسمح باستخدام هذه البلازميدات كنواقل دخول لنواقل الوجهة في المستوى الثاني.
  • المستوى الثاني: يتضمن تجميع المستوى الثاني تجميع الجينات التي تم تجميعها في المستوى الأول لتكوين تركيبات متعددة الجينات. في حال الحاجة إلى تجميع إضافي على مستوى أعلى، يمكن إضافة مواقع تقييد BsaI للقطع الداخلي لتطويق مواقع الإدخال. يمكن استخدام هذه النواقل بعد ذلك كنواقل إدخال لتركيبات المستوى الأعلى.

تتناوب كل مرحلة من مراحل التجميع في استخدام مواقع التقييد BsaI وBpiI لتقليل عدد المواقع المحظورة، ويتم التجميع المتسلسل لكل مرحلة باتباع تصميم بلازميد البوابة الذهبية. بشكل عام، يسمح معيار MoClo بتجميع بنية تحتوي على وحدات نسخ متعددة، جميعها مُجمّعة من أجزاء DNA مختلفة، من خلال سلسلة من تفاعلات البوابة الذهبية أحادية الوعاء. مع ذلك، يتمثل أحد عيوب معيار MoClo في أنه يتطلب استخدام "أجزاء وهمية" بدون وظيفة بيولوجية، إذا كانت البنية النهائية تتطلب أقل من أربعة أجزاء مكونة. [ 37 ] من ناحية أخرى، قدم معيار Golden Braid معيارًا لتجميع البوابة الذهبية الثنائي.

يستخدم معيار Golden Braid نفس التجميع المتدرج المستخدم في MoClo، ولكن كل مستوى يتضمن تجميع قطعتين من الحمض النووي فقط، أي نهجًا ثنائيًا. وبالتالي، في كل مستوى، يتم استنساخ أزواج من الجينات في قطعة هدف بالتسلسل المطلوب، ثم يتم تجميعها لاحقًا اثنين في كل مرة في مستويات متتالية. ومثل MoClo، يتناوب معيار Golden Braid بين استخدام إنزيمي التقييد BsaI وBpiI بين كل مستوى.

أتاح تطوير طرق تجميع Golden Gate ومشتقاتها للباحثين تصميم مجموعات أدوات لتسريع سير العمل في مجال البيولوجيا التركيبية. فعلى سبيل المثال، طُوِّرت EcoFlex كمجموعة أدوات لبكتيريا الإشريكية القولونية ( E. coli) تستخدم معيار MoClo لأجزاء الحمض النووي الخاصة بها، كما طُوِّرت مجموعة أدوات مماثلة لهندسة الطحالب الدقيقة Chlamydomonas reinhardtii . [ 38 ] [ 39 ]

إعادة التركيب الخاصة بالموقع

يجب أولاً إنتاج متجهات الدخول لتقنية الاستنساخ البوابية باستخدام قطعة من الحمض النووي المصنّع تحتوي على مواقع attB المطلوبة. ويتم تحفيز إعادة التركيب مع متجه المانح بواسطة مزيج إنزيم BP clonase، مما ينتج عنه متجه الدخول المطلوب الذي يحتوي على مواقع attL.
يُحصل على التركيب المطلوب بإعادة دمج ناقل الإدخال مع ناقل الوجهة. في هذه الحالة، يتضمن التركيب النهائي تجميع قطعتين من الحمض النووي (DNA) المرغوب فيهما. تتحد مواقع attL على ناقل الإدخال مع مواقع attR على ناقل الوجهة. يُفقد الجين القاتل ccdB من ناقل الوجهة، وأي بكتيريا تبتلع الناقل غير المرغوب فيه ستموت، مما يسمح بانتقاء الناقل المطلوب.
أتاح اكتشاف مواقع att المتعامدة والمتخصصة (أي أن كل موقع attL متعامد يتفاعل فقط مع نظيره attR) تطوير تقنية استنساخ البوابة متعددة المواقع. تسمح هذه التقنية بتجميع أجزاء متعددة من الحمض النووي، ويتم تحديد ترتيب التجميع بواسطة مواقع att.
ملخص لأهم تقنيات استنساخ البوابات.

تستخدم عملية إعادة التركيب الموجهة للموقع إنزيمات دمج العاثيات بدلاً من إنزيمات التقييد، مما يلغي الحاجة إلى وجود مواقع تقييد في شظايا الحمض النووي. وبدلاً من ذلك، تستخدم إنزيمات الدمج مواقع ارتباط فريدة (att)، وتحفز إعادة ترتيب الحمض النووي بين الشظية المستهدفة وناقل الوجهة. تم ابتكار نظام استنساخ Invitrogen Gateway في أواخر التسعينيات، وهو يستخدم مزيجين إنزيميين خاصين، هما BP clonase وLR clonase. يحفز مزيج BP clonase إعادة التركيب بين موقعي attB وattP، مُنتجًا مواقع attL وattR الهجينة، بينما يحفز مزيج LR clonase إعادة تركيب موقعي attL وattR لإنتاج موقعي attB وattP. ولأن كل مزيج إنزيمي يتعرف فقط على مواقع att محددة، فإن إعادة التركيب تكون عالية التخصص، ويمكن تجميع الشظايا بالتسلسل المطلوب. [ 40 ]

تصميم وتجميع متجهي

نظرًا لأن تقنية استنساخ Gateway هي تقنية خاصة، يجب إجراء جميع تفاعلات Gateway باستخدام مجموعة Gateway التي توفرها الشركة المصنعة. يمكن تلخيص التفاعل في خطوتين: الأولى تتضمن تجميع النسخ الأولية التي تحتوي على قطعة الحمض النووي المطلوبة، والثانية تتضمن إدخال هذه القطعة في النسخة النهائية.

  1. يجب إنتاج نسخ الإدخال باستخدام نواقل "المانح" المرفقة التي تحتوي على كاسيت بوابة محاط بمواقع attP. يحتوي كاسيت البوابة على جين انتحار بكتيري (مثل ccdB ) يسمح ببقاء نسخ الإدخال المُعاد تركيبها بنجاح واختيارها. يُضاف زوج من مواقع attB ليحيط بقطعة الحمض النووي المطلوبة، مما يسمح بإعادة التركيب مع مواقع attP عند إضافة مزيج إنزيم BP clonase. تُنتج نسخ الإدخال، وتُحاط قطعة الحمض النووي المطلوبة بمواقع attL.
  2. يحتوي ناقل الوجهة أيضًا على كاسيت بوابة، ولكنه محاط بموقعين من نوع attR. يسمح مزج بلازميد الوجهة هذا مع مستنسخات الإدخال ومزيج إنزيم LR clonase بإعادة التركيب بين موقعي attR و attL. ينتج عن ذلك مستنسخ وجهة، حيث تم إدخال الجزء المطلوب بنجاح. يتم إدخال الجين المميت في الناقل الأصلي، وستموت البكتيريا المحولة بهذا البلازميد. وبالتالي، يمكن اختيار الناقل المطلوب بسهولة.

كانت النسخ الأولى من طريقة استنساخ البوابة تسمح باستخدام نسخة دخول واحدة فقط لكل نسخة وجهة يتم إنتاجها. ومع ذلك، كشفت أبحاث لاحقة أنه يمكن توليد أربع متواليات att متعامدة إضافية، مما يسمح بتجميع ما يصل إلى أربع قطع مختلفة من الحمض النووي، وتُعرف هذه العملية الآن بتقنية بوابة المواقع المتعددة. [ 41 ]

إلى جانب تقنية الاستنساخ Gateway، طُوِّرت أيضًا طرق غير تجارية تستخدم إنزيمات دمج أخرى. على سبيل المثال، تستخدم طريقة التجميع التأشيبية لإنزيم دمج السيرين (SIRA) إنزيم دمج ΦC31، بينما تستخدم طريقة التجميع الترادفي القائم على إعادة التركيب الموضعي (SSRTA) إنزيم دمج عاثية Streptomyces φBT1. [ 42 ] [ 43 ] وتعتمد طرق أخرى، مثل نظام تجميع متجه HomeRun (HVAS)، على نظام الاستنساخ Gateway وتُدمج فيه إنزيمات نووية داخلية موجهة لتصميم بروتوكول يُمكن أن يدعم التخليق الصناعي لبنى الحمض النووي الاصطناعية. [ 33 ]

تتطلب طرق التجميع القائمة على التداخل الطويل وجود مناطق تداخل طويلة على أجزاء الحمض النووي المراد تجميعها. وهذا يُتيح بناء نهايات متراكبة متكاملة يمكنها الارتباط عبر اقتران القواعد المتكاملة. توجد طرق متنوعة، مثل تجميع جيبسون، وCPEC، وMODAL، التي تستخدم هذا المفهوم لتجميع الحمض النووي.

التجميع القائم على التداخل الطويل

ظهرت في السنوات الأخيرة مجموعة متنوعة من طرق التجميع القائمة على التداخل الطويل. ومن أكثر هذه الطرق شيوعًا طريقة جيبسون، التي طُوّرت عام ٢٠٠٩، وهي طريقة لتجميع الحمض النووي في خطوة واحدة لا تتطلب استخدام إنزيمات التقييد أو الإنزيمات المدمجة. [ ٤٤ ] تشمل طرق التجميع الأخرى المشابهة القائمة على التداخل: استنساخ تمديد البوليميراز الدائري (CPEC)، والاستنساخ المستقل عن التسلسل والربط (SLIC)، واستخراج الاستنساخ بالربط السلس (SLiCE). [ ٤٥ ] [ ٤٦ ] [ ٤٧ ] على الرغم من وجود العديد من طرق التجميع القائمة على التداخل، لا تزال طريقة جيبسون الأكثر شيوعًا. [ ٤٨ ] بالإضافة إلى الطرق المذكورة أعلاه، استند باحثون آخرون إلى المفاهيم المستخدمة في طريقة جيبسون وغيرها من طرق التجميع لتطوير استراتيجيات تجميع جديدة، مثل استراتيجية التجميع الموجه بالتداخل المعياري باستخدام الروابط (MODAL)، أو طريقة معيار تجميع الأجزاء الحيوية للاستنساخ المتماثل (BASIC). [ 49 ] [ 50 ]

تجميع جيبسون

تُعدّ طريقة جيبسون لتجميع الحمض النووي طريقةً بسيطةً نسبيًا، ولا تتطلب سوى عدد قليل من الكواشف الإضافية: إنزيم إكسونوكلياز 5' T5 ، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Phusion ، وإنزيم ربط الحمض النووي Taq . تُصنّع قطع الحمض النووي المراد تجميعها بحيث تتداخل نهايتاها 5' و3' بالترتيب المطلوب لتجميعها. تُخلط هذه الكواشف مع قطع الحمض النووي المراد تجميعها عند درجة حرارة 50 درجة مئوية، وتحدث التفاعلات التالية: 

  1. يقوم إنزيم T5 exonuclease بمضغ الحمض النووي من الطرف 5' لكل قطعة، مما يكشف عن نتوءات 3' على كل قطعة من الحمض النووي.
  2. تتحد الأجزاء المتدلية المتكاملة على شظايا الحمض النووي المتجاورة عبر اقتران القواعد المتكاملة.
  3. يقوم إنزيم بوليميراز الحمض النووي Phusion بملء أي فجوات حيث تتحد القطع.
  4. يقوم إنزيم Taq DNA ligase بإصلاح الشقوق الموجودة على كلا شريطي الحمض النووي.

نظرًا لأن إنزيم T5 إكسونوكلياز حساس للحرارة، فإنه يُعطَّل عند 50  درجة مئوية بعد خطوة التحلل العكسي الأولية. وبذلك يكون الناتج مستقرًا، وتُجمَّع الشظايا بالترتيب المطلوب. يمكن لهذا البروتوكول أحادي الوعاء تجميع ما يصل إلى 5 شظايا مختلفة بدقة، بينما توفر العديد من الشركات التجارية مجموعات لتجميع ما يصل إلى 15 شظية مختلفة بدقة في تفاعل من خطوتين. [ 51 ] مع ذلك، ورغم أن بروتوكول جيبسون للتجميع سريع ويستخدم عددًا قليلًا نسبيًا من الكواشف، فإنه يتطلب تركيبًا مخصصًا للحمض النووي، حيث يجب تصميم كل شظية بحيث تحتوي على تسلسلات متداخلة مع الشظايا المجاورة وتضخيمها عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قد يؤثر هذا الاعتماد على تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا على دقة التفاعل عند استخدام شظايا طويلة، أو شظايا ذات محتوى GC عالٍ، أو تسلسلات متكررة. [ 50 ]

يُوفر معيار MODAL تنسيقًا موحدًا يسمح بجعل أي جزء من الحمض النووي متوافقًا مع تجميع جيبسون أو طرق التجميع المتداخلة الأخرى. يخضع جزء الحمض النووي المطلوب لدورتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، الأولى لإضافة بادئات ولواحق المحول، والثانية لإضافة تسلسلات الربط المُحددة مسبقًا. بمجرد أن تصبح الأجزاء بالتنسيق المطلوب، يُمكن تطبيق طرق التجميع مثل تجميع جيبسون. يُحدد ترتيب الأجزاء بواسطة روابط الربط، أي يتم ربط نفس تسلسل الربط بالطرف 3' للجزء العلوي والطرف 5' للجزء السفلي.

تعتمد استراتيجية MODAL على تحديد تسلسلات متداخلة تُعرف باسم "الروابط" لتقليل الحاجة إلى تخصيص كل قطعة من الحمض النووي. صُممت هذه الروابط باستخدام برنامج R2oDNA Designer ، وبلغ طول مناطق التداخل 45 زوجًا قاعديًا لتتوافق مع تقنية جيبسون وغيرها من طرق التجميع المتداخل. ولربط هذه الروابط بالأجزاء المراد تجميعها، يُجرى تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات خاصة بكل جزء تحتوي على تسلسلات محولات بطول 15 زوجًا قاعديًا. ثم تُربط الروابط بتسلسلات المحولات عبر تفاعل PCR ثانٍ. ولتحديد مواقع قطع الحمض النووي، يُربط الرابط نفسه بنهاية القطعة العلوية المطلوبة وبادئة القطعة السفلية المطلوبة. بعد ربط الروابط، يمكن استخدام تقنيات التجميع المتداخل، مثل جيبسون، وCPEC، وغيرها، لتجميع قطع الحمض النووي بالترتيب المطلوب.

أساسي

طُوِّرت استراتيجية تجميع BASIC في عام 2015 وسعت إلى معالجة قيود تقنيات التجميع السابقة، من خلال دمج ستة مفاهيم رئيسية منها: أجزاء قياسية قابلة لإعادة الاستخدام؛ تنسيق أحادي الطبقة (جميع الأجزاء بنفس التنسيق ويتم تجميعها باستخدام نفس العملية)؛ استنساخ متماثل؛ تجميع الحمض النووي المتوازي (متعدد الأجزاء)؛ استقلالية الحجم؛ إمكانية التشغيل الآلي. [ 50 ]

تصميم أجزاء الحمض النووي والوصلات

صُممت أجزاء الحمض النووي (DNA) واستُنسخت في بلازميدات تخزين، حيث يُحاط كل جزء بتسلسل بادئة مُدمجة ( iP ) وتسلسل لاحقة مُدمجة ( iS ). تحتوي تسلسلات iP و iS على مواقع تقييد BsaI مُتجهة للداخل، والتي بدورها تحتوي على نهايات بارزة مُكملة لوصلات BASIC. [ 50 ] كما هو الحال في MODAL، صُممت الوصلات القياسية السبع المُستخدمة في BASIC باستخدام برنامج R2oDNA Designer، وخضعت للفحص للتأكد من خلوها من التسلسلات المُتشابهة مع جينومات الهيكل، ومن خلوها من التسلسلات غير المرغوب فيها مثل تسلسلات البنية الثانوية، أو مواقع التقييد، أو مواقع ارتباط الريبوسوم. ينقسم كل تسلسل وصلة إلى نصفين، يحتوي كل منهما على نهاية بارزة بطول 4 أزواج قاعدية مُكملة لموقع تقييد BsaI، وتسلسل مزدوج السلاسل بطول 12 زوجًا قاعديًا، ويشترك في تسلسل تداخل بطول 21 زوجًا قاعديًا مع النصف الآخر. يُعرف النصف الذي سيرتبط بجزء الحمض النووي العلوي بجزء الربط اللاحق (مثل L1S)، بينما يُعرف النصف الذي سيرتبط بالجزء السفلي بجزء الربط السابق (مثل L1P). تُشكل هذه الروابط أساس تجميع أجزاء الحمض النووي معًا.

إلى جانب توجيه ترتيب التجميع، يمكن تعديل روابط BASIC القياسية لأداء وظائف أخرى. وللسماح بالتجميع المتكرر، صُممت الروابط أيضًا بإضافة تسلسلات iP و iS مثيلة لحمايتها من التعرف عليها بواسطة إنزيم BsaI. يزول هذا المثيلة بعد التحويل وتضاعف البلازميد داخل الكائن الحي، ويمكن استخلاص البلازميدات وتنقيها واستخدامها في تفاعلات لاحقة.

نظرًا لطول تسلسلات الروابط نسبيًا (45 زوجًا قاعديًا للرابط القياسي)، تتوفر إمكانية دمج تسلسلات الحمض النووي الوظيفية لتقليل عدد أجزاء الحمض النووي اللازمة أثناء التجميع. يوفر معيار تجميع BASIC عدة روابط مُدمجة بمواقع ربط الريبوسوم (RBS) بدرجات قوة مختلفة. وبالمثل، لتسهيل بناء البروتينات الاندماجية التي تحتوي على نطاقات بروتينية متعددة، صُممت أيضًا عدة روابط اندماجية تسمح بالقراءة الكاملة لبنية الحمض النووي. تُشفّر هذه الروابط الاندماجية عديد ببتيد مكون من 15 حمضًا أمينيًا من الجليسين والسيرين، وهو ببتيد رابط مثالي للبروتينات الاندماجية متعددة النطاقات.

يجب أن تحتوي أجزاء الحمض النووي المستخدمة في تجميع BASIC على تسلسلات بادئة ولاحقة مدمجة (iP و iS). تحتوي هذه التسلسلات على مواقع تقييد BsaI التي تسمح بربط وصلات iP و iS (التي تحتوي على تسلسلات متدلية مكملة) بجزء الحمض النووي. بمجرد ربط الوصلات، يصبح الجزء جاهزًا للتجميع.
تُحدد مواقع الروابط تسلسل عملية التجميع. يُربط رابط اللاحقة بالطرف 3' للجزء العلوي، بينما يُربط رابط البادئة بالطرف 5' للجزء السفلي. يوضح الشكل هنا مثالًا على بنية تجميع BASIC باستخدام أربعة أجزاء من الحمض النووي.

حَشد

هناك ثلاث خطوات رئيسية في تجميع الهيكل النهائي.

  1. أولاً، يتم استئصال أجزاء الحمض النووي من بلازميد التخزين، مما يعطي قطعة من الحمض النووي مع نتوءات BsaI على الطرفين 3' و 5'.
  2. بعد ذلك، يتم ربط كل جزء من أجزاء الرابط بجزء الحمض النووي الخاص به عن طريق حضنه مع إنزيم T4 DNA ligase. يحتوي كل جزء من الحمض النووي على جزء رابط لاحق وبادئة من رابطين مختلفين لتحديد ترتيب التجميع. على سبيل المثال، يحتوي الجزء الأول في التسلسل على L1P وL2S، بينما يحتوي الجزء الثاني على L2P وL3S. يمكن تغيير أجزاء الرابط لتغيير تسلسل التجميع.
  3. أخيرًا، تُجمّع الأجزاء مع الروابط المرفقة في بلازميد عن طريق الحضانة عند 50  درجة مئوية. تلتصق الأطراف المتدلية بطول 21 زوجًا قاعديًا من روابط P و S، ويمكن تحويل التركيب النهائي إلى خلايا بكتيرية للاستنساخ. تُصلح الشقوق أحادية السلسلة داخل الخلية الحية بعد التحويل، مما ينتج عنه تركيب نهائي مستقر يُستنسخ في البلازميدات.

التطبيقات

مع انخفاض تكلفة تصنيع الجينات تجاريًا بشكل مطرد ومتزايد خلال السنوات الماضية بفضل تقنيات طباعة وتجميع الحمض النووي [ 52 ] ، أصبح تصنيع الجينات الاصطناعي أداة هندسية قوية ومرنة لإنشاء وتصميم تسلسلات الحمض النووي ووظائف البروتينات الجديدة. إلى جانب البيولوجيا التركيبية، ستستفيد مجالات بحثية متنوعة، مثل تلك المتعلقة بالتعبير الجيني غير المتجانس ، وتطوير اللقاحات ، والعلاج الجيني ، والهندسة الجزيئية، استفادةً كبيرة من وجود طرق سريعة ورخيصة لتصنيع الحمض النووي لترميز البروتينات والببتيدات [ 53 ] . بل إن الطرق المستخدمة في طباعة وتجميع الحمض النووي قد مكّنت من استخدامه كوسيط لتخزين المعلومات .

تخليق الجينومات البكتيرية

مختبر سينثيا ومايكوبلازما

في 28 يونيو 2007، نشر فريق من معهد جيه كريج فينتر مقالاً في مجلة ساينس إكسبريس ، ذكروا فيه أنهم نجحوا في زرع الحمض النووي الطبيعي من بكتيريا الميكوبلازما ميكويدس في خلية الميكوبلازما كابريكولوم ، مما أدى إلى إنشاء بكتيريا تتصرف مثل الميكوبلازما ميكويدس . [ 54 ]

في السادس من أكتوبر/تشرين الأول عام 2007، أعلن كريغ فينتر في مقابلة مع صحيفة الغارديان البريطانية أن الفريق نفسه قد قام بتخليق نسخة معدلة من الكروموسوم الوحيد لبكتيريا الميكوبلازما التناسلية اصطناعياً. وقد عُدّل الكروموسوم لإزالة جميع الجينات التي أظهرت الاختبارات التي أُجريت على البكتيريا الحية أنها غير ضرورية. وتتمثل الخطوة التالية المخطط لها في مشروع الجينوم الأدنى هذا في زرع الجينوم الأدنى المُصنّع في خلية بكتيرية بعد إزالة حمضها النووي القديم؛ وستُسمى البكتيريا الناتجة بالميكوبلازما المختبرية . وفي اليوم التالي، أصدرت مجموعة الأخلاقيات الحيوية الكندية ، مجموعة ETC ، بياناً عبر ممثلها، بات موني ، قالت فيه إن "ابتكار" فينتر كان "هيكلاً يُمكن بناء أي شيء تقريباً عليه". ولم يتم بعد زرع الجينوم المُصنّع في خلية عاملة. [ 55 ]

في 21 مايو/أيار 2010، أفادت مجلة ساينس أن فريق فينتر نجح في تخليق جينوم بكتيريا الميكوبلازما ميكويدس من سجل حاسوبي، وزرع الجينوم المُصنّع في خلية موجودة لبكتيريا الميكوبلازما كابريكولوم التي أُزيل حمضها النووي. وكانت البكتيريا "المُصنّعة" قابلة للحياة، أي قادرة على التكاثر مليارات المرات. وكان الفريق قد خطط في الأصل لاستخدام بكتيريا الميكوبلازما جينيتاليوم التي كانوا يعملون عليها سابقًا، لكنهم تحولوا إلى الميكوبلازما ميكويدس لأن الأخيرة تنمو بشكل أسرع بكثير، مما أدى إلى تسريع التجارب. [ 56 ] يصفها فينتر بأنها "أول نوع... يكون أصله حاسوبًا". [ 57 ] أطلقت شركة ETC على البكتيريا المُحوّلة اسم " سينثيا ". وامتنع متحدث باسم فينتر عن تأكيد أي إنجاز حتى وقت كتابة هذا التقرير.

الخميرة الاصطناعية 2.0

في إطار مشروع الخميرة الاصطناعية 2.0، شاركت مجموعات بحثية متعددة حول العالم في مشروع لتخليق جينومات الخميرة الاصطناعية، ومن خلال هذه العملية، تحسين جينوم الكائن النموذجي Saccharomyces cerevisiae . [ 58 ] طبق مشروع الخميرة 2.0 طرقًا مختلفة لتجميع الحمض النووي سبق ذكرها، وفي مارس 2014، كشف جيف بوكي من مركز لانغون الطبي بجامعة نيويورك أن فريقه قد نجح في تخليق الكروموسوم الثالث من S. cerevisiae . [ 59 ] [ 60 ] تضمنت العملية استبدال الجينات في الكروموسوم الأصلي بنسخ اصطناعية، ثم دُمج الكروموسوم الاصطناعي النهائي في خلية خميرة. تطلب ذلك تصميم وإنشاء 273,871 زوجًا من قواعد الحمض النووي - أي أقل من 316,667 زوجًا في الكروموسوم الأصلي. في مارس 2017، اكتمل تركيب 6 من أصل 16 كروموسومًا، بينما لا يزال تركيب الكروموسومات الأخرى جاريًا. [ 61 ]

القضايا الأخلاقية

قضايا أخلاقية عامة

إذا أصبح إنتاج الحمض النووي البشري عبر التخليق الجيني الاصطناعي ممكنًا تقنيًا، فقد حدد الباحثون العديد من القضايا الأخلاقية والاجتماعية [ 62 ] . وأشار باحثون مثل أدريان فيلالبا وآنا سماجدور إلى أن الحمض النووي الاصطناعي قد يُشكك في الافتراضات السائدة حول طبيعة وأهمية المادة الوراثية البشرية. ومن بين هذه القضايا مفهوم الملكية الجينية. فإذا أمكن إعادة إنتاج تسلسل الحمض النووي لشخص ما اصطناعيًا في المختبر، يصبح من غير الواضح من يملك الحقوق أو السيطرة على المادة الناتجة، وما إذا كانت الأطر القانونية والأخلاقية الحالية كافية لمعالجة مثل هذه الحالات.

تُثار أيضًا تساؤلات حول الهوية. لطالما نُظر إلى الجينوم البشري على أنه وثيق الصلة بالهوية الشخصية والتراث البيولوجي. إلا أن إمكانية إعادة بناء أو تصميم التسلسلات الجينومية عبر الحمض النووي الاصطناعي من شأنها أن تُضعف هذه الصلة بشكل كبير. فإذا أمكن إنشاء الجينومات أو تعديلها أو استنساخها بمعزل عن الوراثة الطبيعية، يصبح من الصعب بشكل متزايد التمسك بالرأي القائل بأن التركيب الجيني يُحدد السمات الشخصية بشكل قاطع. في هذا السياق، يُقترح أن الحمض النووي الاصطناعي يُقوّض الحتمية الجينية بشكل فعّال، ويدفع إلى إعادة تقييم الافتراضات المتعلقة بدور الجينات في تشكيل الهوية الفردية.

تُعدّ الخصوصية قضية بالغة الأهمية. إذ إنّ إمكانية توليف تسلسلات جينية مطابقة أو مشابهة لتلك الموجودة لدى الأفراد تُثير مخاوف بشأن حماية البيانات الجينية وإمكانية إساءة استخدامها. وقد لا تُغطي الضمانات التقليدية للمعلومات الجينية بشكل كامل الحالات التي يُمكن فيها إعادة إنتاج الحمض النووي بشكل مستقل عن العينة البيولوجية.

التكاثر

قد تؤثر هذه التقنية أيضاً على النقاشات المتعلقة بالإنجاب والأبوة. فإذا استُخدمت الجينومات الاصطناعية، أو الأمشاج الاصطناعية، أو التسلسلات المُصنّعة جزئياً في سياقات الإنجاب، فقد يصبح من الصعب تحديد النسب الجيني أو تطبيق اللوائح التي تعتمد على النسب البيولوجي. وقد يكون لهذا الأمر تداعيات على الإنجاب بمساعدة طبية، وسرية هوية المتبرع، والتعريفات القانونية للعلاقات الأسرية.

تقترح دراسات نظرية أخرى حول الحمض النووي البشري الاصطناعي بديلاً لتقنيات استبدال الميتوكوندريا، وذلك باستخدام الحمض النووي الاصطناعي لإعادة بناء عضيات الميتوكوندريا [ 63 ] . ومن خلال إنشاء الحمض النووي للميتوكوندريا من الصفر، يُلغي هذا النهج الحاجة إلى متبرع ميتوكوندريا منفصل في التدخلات الإنجابية. ويجادل الباحثون بأن هذا التطور يُضعف فكرة ما يُسمى بـ" طفل الثلاثة آباء"، لأن تسلسل الميتوكوندريا لن يكون من فرد ثالث. إضافةً إلى ذلك، فإن إمكانية تصميم واستبدال جينومات الميتوكوندريا عبر الوسائل الاصطناعية تُضعف الحتمية الجينية ، إذ يُمكن توليد عناصر الوراثة البيولوجية التي كانت تُعتبر ثابتة بشكل مستقل عن السلالة الطبيعية.

إن إمكانية بناء الحمض النووي البشري الاصطناعي من الصفر قد تُمكّن الأفراد من إنتاج أمشاج تحمل تسلسلات محددة من مادتهم الوراثية، بدلاً من الاعتماد على الوراثة الطبيعية أو الأمشاج المختارة عشوائياً في تقنيات الإنجاب المساعدة. [ 64 ] . وعلى عكس التقنيات التقليدية، مثل تعديل جينات الأجنة ، التي تُغير مباشرةً جينوم الجنين الموجود، وبالتالي تؤثر على الشخص، فإن هذه الأمشاج الاصطناعية تُبنى من الصفر وتُنتج أفراداً لم يكونوا ليوجدوا لولاها، مما يجعل التدخل غير مؤثر على الشخص وفقاً لمبدأ بارفيت . وتثير الأمشاج المنتجة بهذه الطريقة، والتي تختلف عن الأمشاج الاصطناعية المُستحصلة من خلال تكوين الأمشاج في المختبر، تساؤلات أخلاقية حول الاستقلالية الإنجابية والهوية وتصميم الصفات البشرية دون التأثير على الأشخاص الموجودين مسبقاً.

انظر أيضاً

ملحوظات

  1. ↑ شتاين ر (7 مايو 2015). "بصمة الحمض النووي: طفرة كبيرة للبحوث، لكن البعض يثير مخاوف" . برنامج "كل شيء يؤخذ في الاعتبار " . الإذاعة الوطنية العامة.
  2. 1 2 خورانا إتش جي، أغاروال كيه إل، بوشي إتش، كاروثرز إم إتش، غوبتا إن كيه، كليبي كيه، وآخرون . (ديسمبر 1972). "دراسات على عديدات النوكليوتيدات. 103. التخليق الكلي للجين البنيوي لحمض نووي ريبوزي ناقل للألانين من الخميرة". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 72 (2): 209-17 . doi : 10.1016/0022-2836(72)90146-5 . PMID 4571075 .  
  3. 1 2 إيتاكورا ك، هيروس تي، كريا آر، ريجز إيه دي، هينيكر إتش إل، بوليفار إف، بوير إتش دبليو (ديسمبر 1977). “التعبير في الإشريكية القولونية عن الجين المركب كيميائيًا لهرمون السوماتوستاتين”. علوم . 198 (4321): 1056– 63. بيب كود : 1977Sci...198.1056I . دوى : 10.1126/science.412251 . بميد 412251 . 
  4. 1 2 إيدج إم دي، غرين إيه آر، هيثكليف جي آر، ميكوك بي إيه، شوتش دبليو، سكانلون دي بي، وآخرون . (أغسطس 1981). "التخليق الكامل لجين إنترفيرون الكريات البيضاء البشرية". نيتشر . 292 (5825): 756-62 . Bibcode : 1981Natur.292..756E . doi : 10.1038 / 292756a0 . PMID 6167861. S2CID 4330168 .   
  5. ↑ شوكمان د (27 مارس 2014). "إشادة بالتقدم في مجال الحمض النووي الاصطناعي" . بي بي سي نيوز . تم الاطلاع عليه بتاريخ 11 أبريل 2020 .
  6. ↑ كيموتو م، ياماشيغي ر، ماتسوناغا ك، يوكوياما س، هيراو إ (مايو 2013). "توليد أبتاميرات الحمض النووي عالية الألفة باستخدام أبجدية جينية موسعة". مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 31 (5): 453-457 . doi : 10.1038/nbt.2556 . PMID 23563318. S2CID 23329867 .  
  7. ↑ مالشيف د.أ، دهامي ك، كواش هـ.ت، لافيرن ت، أوردوخانيان ب، توركاماني أ، رومسبيرغ ف.إ (يوليو 2012). "تضاعف الحمض النووي بكفاءة وبشكل مستقل عن التسلسل، والذي يحتوي على زوج قاعدي ثالث، يُنشئ أبجدية جينية وظيفية مكونة من ستة أحرف" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 109 (30): 12005-12010 . Bibcode : 2012PNAS..10912005M . doi : 10.1073/pnas.1205176109 . PMC 3409741. PMID 22773812 .  
  8. ↑ مالشيف، د.أ.، دهامي، ك.، لافيرن، ت.، تشين، ت.، داي، ن.، فوستر، ج.م.، وآخرون . (مايو 2014). "كائن شبه اصطناعي ذو أبجدية جينية موسعة" . مجلة نيتشر . 509 (7500): 385-388 . Bibcode : 2014Natur.509..385M . doi : 10.1038/ nature13314 . PMC 4058825. PMID 24805238 .   
  9. 1 2 فورمان م، أورتل و، هيغمان ب (أغسطس 1999). "جين اصطناعي يرمز للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) هو مؤشر متعدد الاستخدامات في طحلب الكلاميدوموناس رينهاردتي" . مجلة النبات . 19 (3): 353-361 . doi : 10.1046/j.1365-313X.1999.00526.x . PMID 10476082 . 
  10. ↑ مانديكي دبليو، بولينغ تي جيه (أغسطس 1988). "طريقة فوكلي لتخليق الجينات". جين . 68 (1): 101-107 . doi : 10.1016/0378-1119(88)90603-8 . PMID 3265397 . 
  11. ↑ ستيمر دبليو بي، كراميري إيه، ها كيه دي، برينان تي إم، هاينيكر إتش إل (أكتوبر 1995). "تجميع جين وبلازميد كامل في خطوة واحدة من أعداد كبيرة من قليل النيوكليوتيدات منزوعة الأكسجين". جين . 164 (1): 49-53 . doi : 10.1016/0378-1119(95)00511-4 . PMID 7590320 . 
  12. ↑ غاو إكس، يو بي، كيث إيه، راغان تي جيه، هاريس تي كيه (نوفمبر 2003). "تخليق الجينات بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوازن حراريًا من الداخل إلى الخارج (TBIO): طريقة جديدة لتصميم البادئات من أجل تجميع عالي الدقة لتسلسلات جينية أطول" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 31 (22): 143هـ–143. doi : 10.1093/nar/gng143 . PMC 275580. PMID 14602936 .  
  13. ↑ يونغ إل، دونغ كيو (أبريل 2004). "طريقة التخليق الجيني الكامل بخطوتين" . أبحاث الأحماض النووية . 32 (7): e59. doi : 10.1093/nar/gnh058 . PMC 407838. PMID 15087491 .  
  14. ↑ هيلسون، ن. ج.، روزنغارتن، ر. د.، كيسلينغ، ج. د. (يناير 2012). "برنامج أتمتة تصميم تجميع الحمض النووي j5" . مجلة ACS للبيولوجيا التركيبية . 1 (1): 14-21 . doi : 10.1021/sb2000116 . PMID 23651006 . 
  15. ↑ هوفر، د.م.، ولوبكوفسكي، ج. (مايو 2002). "DNAWorks: طريقة آلية لتصميم قليل النوكليوتيدات لتخليق الجينات بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 30 (10): 43e–43. doi : 10.1093/nar/30.10.e43 . PMC 115297. PMID 12000848 .  
  16. ↑ فيلالوبوس أ، نيس جيه إي، غوستافسون سي، مينشول جيه، غوفينداراجان إس (يونيو 2006). "مصمم الجينات: أداة بيولوجيا تركيبية لبناء أجزاء الحمض النووي الاصطناعية" . بي إم سي بيوانفورماتيكس . 7 (1) 285. رمز Bibcode : 2006BMCBi...7..285V . doi : 10.1186/1471-2105-7-285 . PMC 1523223. PMID 16756672 .  
  17. ↑ تيان جيه، غونغ إتش، شينغ إن، تشو إكس، غولاري إي، غاو إكس، تشيرش جي (ديسمبر 2004). "تخليق جيني متعدد دقيق من رقائق الحمض النووي الدقيقة القابلة للبرمجة" ( ملف PDF) . مجلة نيتشر . 432 (7020): 1050-1054 . Bibcode : 2004Natur.432.1050T . doi : 10.1038/nature03151 . hdl : 2027.42/62677 . PMID 15616567. S2CID 4373350 .  
  18. ↑ ماتزاس م، ستالر ب ف، كيفر ن، سيبيلت ن، بويسغيرين ف، ليونارد ج ت، وآخرون . (ديسمبر 2010). "تخليق الجينات بدقة عالية عن طريق استرجاع الحمض النووي المُتحقق من تسلسله والمُحدد باستخدام تقنية التسلسل الناري عالي الإنتاجية" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 28 (12): 1291-1294 . doi : 10.1038/nbt.1710 . PMC 3579223. PMID 21113166 .   
  19. ↑ شوارتز جيه جيه، لي سي، شندور جيه (سبتمبر 2012). "تخليق الجينات بدقة مع استرجاع جزيئات الحمض النووي المُتحقق من تسلسلها والموجه بالعلامات" . نيتشر ميثودز . 9 (9): 913-915 . doi : 10.1038/nmeth.2137 . PMC 3433648. PMID 22886093 .  
  20. ↑ بادام س، إمام أ، الفيكي أ، كافاريتا ف، لوكا ج، فرج إ، سند ي (2026). "كولي فورمر: نموذج لتحسين الكودونات قائم على المحولات يوازن بين أهداف متعددة لتعزيز التعبير الجيني في الإشريكية القولونية" . الهندسة الحيوية . 13 (1) 114. MDPI. doi : 10.3390/bioengineering13010114 .
  21. ↑ Saketh11. "ColiFormer – تحسين الكودونات في بكتيريا الإشريكية القولونية" . Hugging Face . تم الاطلاع عليه بتاريخ 9 ديسمبر 2025 .{{cite web}}: صيانة CS1: الأسماء الرقمية: قائمة المؤلفين ( رابط )
  22. ↑ وايدمان سي (2017-12-06). "توسيع الأبجدية الجينية" . مدونة . جامعة هارفارد . تم الاسترجاع في 2020-04-17 .
  23. ↑ "مساعدة: علم الأحياء التركيبي - parts.igem.org" . parts.igem.org . تم الاطلاع عليه بتاريخ 11 أبريل 2020 .
  24. 1 2 3 كاسيني أ، ستورش م، بالدوين جي إس، إليس ت (سبتمبر 2015). "اللبنات والمخططات: طرق ومعايير تجميع الحمض النووي" . مراجعات الطبيعة. بيولوجيا الخلية الجزيئية . 16 (9): 568-76 . doi : 10.1038/nrm4014 . hdl : 10044/1/31281 . PMID 26081612. S2CID 3502437 .  
  25. ↑ نايت تي (2003). "تصميم متجهات متكررة للتجميع القياسي للوحدات الحيوية". مجموعة عمل البيولوجيا التركيبية في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا . hdl : 1721.1/21168 .
  26. ↑ روكي جي، كورفالد إي، باهر جي، أوياس أو، لالي آر (2014). "معايير وتقنيات تجميع BioBrick وأدوات البرمجيات المرتبطة بها". في فالا إس، لالي آر (محرران). طرق استنساخ وتجميع الحمض النووي . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 1116. كليفتون، نيوجيرسي، الصفحات 1-24. doi : 10.1007 / 978-1-62703-764-8_1 . ISBN   978-1-62703-763-1PMID 24395353​​ {{cite book}}: CS1 maint: موقع الناشر مفقود ( رابط )
  27. ↑ نايت تي (19-11-2008). "مسودة معيارية للأجزاء البيولوجية من Biobrick BB-2". BBF RFC . 12 . hdl : 1721.1/45139 .
  28. ↑ أندرسون، جيه سي، ديوبر، جيه إي، ليغيا، إم، وو، جي سي، غولر، جيه إيه، أركين، إيه بي، كيسلينغ، جيه دي (يناير 2010). " BglBricks: معيار مرن لتجميع الأجزاء البيولوجية" . مجلة الهندسة البيولوجية . 4 (1): 1. doi : 10.1186/1754-1611-4-1 . PMC 2822740. PMID 20205762 .  
  29. ↑ فيليبس آي، سيلفر بي (2006-04-20). "استراتيجية جديدة لتجميع الوحدات الحيوية مصممة لهندسة البروتين بسهولة" . hdl : 1721.1/32535 .
  30. ^ جرونبيرج آر، أرندت ك، مولر ك (2009-04-18). "معيار تجميع الطوب الحيوي للبروتين (فرايبورج)". BBF RFC . 25 . اتش دي ال : 1721.1/45140 .
  31. ↑ شيتي ر، ليزارازو م، ريتبرغ ر، نايت ت ف (2011). "تجميع الأجزاء البيولوجية القياسية لـ BioBrick باستخدام تجميع ثلاثة مضادات حيوية". البيولوجيا التركيبية، الجزء ب - التصميم بمساعدة الحاسوب وتجميع الحمض النووي . طرق في علم الإنزيمات. المجلد 498. الصفحات 311-326 . doi : 10.1016/B978-0-12-385120-8.00013-9 . hdl : 1721.1/65066 . ISBN   978-0-12-385120-8PMID 21601683​​ 
  32. ↑ سبير، إم. أ.، وريتشارد، تي. إل. (ديسمبر 2011). "تجميع الإدخال المُضخّم: نهج مُحسّن للتجميع القياسي للدوائر الجينية BioBrick™" . مجلة الهندسة البيولوجية . 5 (1): 17. doi : 10.1186/1754-1611-5-17 . PMC 3287150. PMID 22176971 .  
  33. 1 2 لي إم في، شوكلا دي، رودس بي إتش، لال إيه، شو جيه، موريارتي بي إس، لارجاسبادا دي إيه (24-06-2014). " نظام تجميع متجه هوم رن: نظام استنساخ مرن وموحد لتجميع تركيبات الحمض النووي متعددة الوحدات" . PLOS ONE . 9 (6) e100948. Bibcode : 2014PLoSO...9j0948L . doi : 10.1371/journal.pone.0100948 . PMC 4069157. PMID 24959875 .  
  34. ↑ ليو جيه كيه، تشين دبليو إتش، رين إس إكس، تشاو جي بي، وانغ جيه (2014-10-20). "آي بريك: معيار جديد للتجميع التكراري للأجزاء البيولوجية باستخدام إنزيمات نوكلياز داخلية موجهة" . PLOS ONE . 9 (10) e110852. Bibcode : 2014PLoSO...9k0852L . doi : 10.1371/journal.pone.0110852 . PMC 4203835. PMID 25329380 .  
  35. 1 2 إنجلر سي، كاندزيا آر، ماريلونيه إس (5 نوفمبر 2008). "طريقة استنساخ دقيقة بخطوة واحدة في وعاء واحد، ذات إنتاجية عالية" . PLOS ONE . 3 (11) e3647. Bibcode : 2008PLoSO...3.3647E . doi : 10.1371/journal.pone.0003647 . PMC 2574415. PMID 18985154 .  
  36. ↑ ويبر إي، إنجلر سي، غروتزنر آر، فيرنر إس، ماريونيه إس (فبراير 2011). "نظام استنساخ معياري للتجميع الموحد لبنى الجينات المتعددة" . PLOS ONE . 6 (2) e16765. Bibcode : 2011PLoSO...616765W . doi : 10.1371/journal.pone.0016765 . PMC 3041749. PMID 21364738 .  
  37. ↑ كلاين، سي. أ. ، إمدي، ل.، كويبرز، أ.، سوبيتزكو، ب. (17 أكتوبر 2019). "موكلوفليكس: نظام استنساخ معياري ومرن" . مجلة فرونتيرز في الهندسة الحيوية والتكنولوجيا الحيوية . 7 271. doi : 10.3389/fbioe.2019.00271 . PMC 6843054. PMID 31750294 .  
  38. ↑ مور إس جيه، لاي إتش إي، كيلويك آر جيه، تشي إس إم، بيل دي جيه، بوليزي كيه إم، فريمونت بي إس (أكتوبر 2016). "إيكوفليكس: مجموعة أدوات MoClo متعددة الوظائف لعلم الأحياء التركيبي لبكتيريا الإشريكية القولونية" . مجلة ACS لعلم الأحياء التركيبي . 5 (10): 1059-1069 . doi : 10.1021/acssynbio.6b00031 . hdl : 10044/1/31290 . PMID 27096716 . 
  39. ↑ كروزيه، ب.، نافارو، ف. ج.، ويلموند، ف.، مهرشاهي، ب.، باكوفسكي، ك.، لاورسن، ك. ج.، وآخرون . (سبتمبر 2018). "ولادة هيكل التمثيل الضوئي: مجموعة أدوات MoClo التي تُمكّن البيولوجيا التركيبية في الطحلب الدقيق كلاميدوموناس رينهاردتي" . مجلة ACS للبيولوجيا التركيبية . 7 (9): 2074-2086 . doi : 10.1021/acssynbio.8b00251 . PMID 30165733. S2CID 52131500 .   
  40. ↑ ريس-هويز جيه إس، وولهاوت إيه جيه (يناير 2018). " استنساخ إعادة التركيب البوابي" . بروتوكولات كولد سبرينغ هاربور . 2018 (1) pdb.top094912. doi : 10.1101/pdb.top094912 . PMC 5935001. PMID 29295908 .  
  41. ↑ ساساكي واي، سوني تي، يوشيدا إس، ياهاتا كيه، هوتا جيه، تشيستنت جيه دي، وآخرون (فبراير 2004). "دليل على الخصوصية العالية والكفاءة لإشارات إعادة التركيب المتعددة في استنساخ الحمض النووي المختلط بواسطة نظام بوابة المواقع المتعددة" . مجلة التكنولوجيا الحيوية . 107 (3): 233-243 . doi : 10.1016/j.jbiotec.2003.10.001 . PMID 14736459 .  
  42. ↑ كولومز إس دي، ميريك سي إيه، أولورونيجي إف جيه، ستارك دبليو إم، سميث إم سي، أوزبورن إيه، وآخرون . (فبراير 2014). "التجميع السريع للمسارات الأيضية وتعديلها باستخدام إعادة التركيب الموجه لموقع إنزيم سيرين إنتغراز" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 42 (4): e23. doi : 10.1093 / nar/gkt1101 . PMC 3936721. PMID 24225316 .   
  43. ↑ تشانغ ل، تشاو ج، دينغ إكس (2011-11-03). "التجميع المتسلسل لمجموعة جينات التخليق الحيوي للإيبوثيلون عن طريق إعادة التركيب الموضعي في المختبر" . التقارير العلمية . 1 (1) 141. Bibcode : 2011NatSR...1..141Z . doi : 10.1038/srep00141 . PMC 3216622. PMID 22355658 .  
  44. ↑ جيبسون دي جي، يونغ إل، تشوانغ آر واي، فينتر جي سي، هاتشيسون سي إيه، سميث إتش أو (مايو 2009). "التجميع الأنزيمي لجزيئات الحمض النووي التي يصل طولها إلى عدة مئات من الكيلوبايتات" . مجلة نيتشر ميثودز . 6 (5): 343-345 . doi : 10.1038/nmeth.1318 . PMID 19363495. S2CID 1351008 .  
  45. ↑ كوان جيه، تيان جيه (يوليو 2009). "استنساخ مكتبات الجينات والمسارات المعقدة باستخدام امتداد البوليميراز الدائري" . PLOS ONE . 4 (7) e6441. Bibcode : 2009PLoSO...4.6441Q . doi : 10.1371/ journal.pone.0006441 . PMC 2713398. PMID 19649325 .  
  46. ↑ لي إم زد، إليدج إس جيه (مارس 2007). "تسخير إعادة التركيب المتماثل في المختبر لتوليد الحمض النووي المؤتلف عبر SLIC" . Nature Methods . 4 (3): 251-256 . Bibcode : 2007NatCB...4..251L . doi : 10.1038/nmeth1010 . PMID 17293868. S2CID 30893882 .  
  47. ↑ تشانغ واي، ويرلينغ يو، إيدلمان دبليو (أبريل 2012). "SLiCE: طريقة جديدة لاستنساخ الحمض النووي تعتمد على مستخلص الخلايا البكتيرية" . أبحاث الأحماض النووية . 40 (8): e55. doi : 10.1093/nar/gkr1288 . PMC 3333860. PMID 22241772 .  
  48. ↑ "كيف يُغيّر تجميع جيبسون علم الأحياء التركيبي" . مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية . تم الاطلاع عليه بتاريخ 14 أبريل 2020 .
  49. ↑ كاسيني أ، ماكدونالد جيه تي، دي يونغ جيه، كريستودولو جي، فريمونت بي إس، بالدوين جي إس، إليس تي (يناير 2014). "بناء الحمض النووي في خطوة واحدة لعلم الأحياء التركيبي: استراتيجية التجميع الموجه بالتداخل المعياري مع الروابط (MODAL)" . أبحاث الأحماض النووية . 42 (1): e7. doi : 10.1093/nar/gkt915 . PMC 3874208. PMID 24153110 .  
  50. 1 2 3 4 ستورش م، كاسيني أ، ماكرو ب، فليمنج ت، ترويت هـ، إليس ت، بالدوين ج.س. (يوليو 2015). "BASIC: معيار جديد لتجميع الأجزاء الحيوية للاستنساخ المتكرر يوفر تجميعًا دقيقًا للحمض النووي أحادي الطبقة لعلم الأحياء التركيبي" . مجلة ACS لعلم الأحياء التركيبي . 4 (7): 781-787 . doi : 10.1021/sb500356d . hdl : 10044/1/29939 . PMID 25746445 . 
  51. ↑ "بروتوكول تجميع جيبسون" . Addgene . تم الاسترجاع في 14 أبريل 2020 .
  52. ↑ إل كاروي م، هويوس-فلايت م، فليتشر ل (2019). " الاتجاهات المستقبلية في البيولوجيا التركيبية - تقرير" . مجلة فرونتيرز في الهندسة الحيوية والتكنولوجيا الحيوية . 7 175. doi : 10.3389/fbioe.2019.00175 . PMC 6692427. PMID 31448268 .  
  53. ↑ كوسوري إس، تشيرش جي إم (مايو 2014). "تخليق الحمض النووي من الصفر على نطاق واسع: التقنيات والتطبيقات" (ملف PDF) . مجلة Nature Methods . 11 (5): 499-507 . Bibcode : 2014NatCB..11..499K . doi : 10.1038/nmeth.2918 . PMC 7098426. PMID 24781323 .  
  54. ↑ لارتيغ سي، غلاس جي آي، ألبروفيتش إن، بايبر آر، بارمار بي بي، هاتشيسون سي إيه، وآخرون . (أغسطس 2007). "زرع الجينوم في البكتيريا: تغيير نوع إلى آخر". مجلة ساينس . 317 (5838): 632-638 . Bibcode : 2007Sci...317..632L . CiteSeerX 10.1.1.395.4374 . doi : 10.1126/science.1144622 . PMID 17600181. S2CID 83956478 .    
  55. ↑ بيلكينغتون إي (2009-10-06). "أنا أصنع حياة اصطناعية، رائد علم الجينات الأمريكي يُعلن" . صحيفة الغارديان . لندن. مؤرشف من الأصل في 28 مايو 2010. تم الاطلاع عليه في 22 مايو 2010 .
  56. ↑ بينيسي، إي. (21 مايو 2010). "الجينوم الاصطناعي يُحيي البكتيريا" ( ملف PDF) . مجلة ساينس . 328 (5981): 958-959 . doi : 10.1126/science.328.5981.958 . PMID 20488994. مؤرشف (ملف PDF) من الأصل بتاريخ 25 مايو 2010. تاريخ الاسترجاع : 21 مايو 2010 . 
  57. ↑ "كيف صنع العلماء 'الحياة الاصطناعية'"" بي بي سي نيوز . 2010-05-20. مؤرشف من الأصل في 1 يونيو 2013. تم الاطلاع عليه في 21-05-2010 . "
  58. ↑ "الخميرة 2.0" . مجموعة نيتشر كوميونيكيشنز . سبرينغر نيتشر المحدودة. 22 مايو 2018. تم الاطلاع عليه بتاريخ 17 أبريل 2020 .
  59. ↑ شوكمان د (27 مارس 2014). "العلماء يشيدون بالتقدم في مجال الكروموسومات الاصطناعية" . بي بي سي نيوز . تم الاطلاع عليه بتاريخ 28 مارس 2014 .
  60. ↑ أنالورو ن، مولر إتش، ميتشل لوس أنجلوس، رامالينغام إس، ستراكوادينيو جي، ريتشاردسون إس إم، وآخرون . (أبريل 2014). "التوليف الكامل لكروموسوم حقيقي النواة مصمم وظيفي" . علوم . 344 (6179): 55– 8. بيب كود : 2014Sci...344...55A . دوى : 10.1126/science.1249252 . بمك 4033833 . بميد 24674868 .   
  61. ↑ عدد خاص: جينوم الخميرة الاصطناعية، مجلة ساينس، 10 مارس 2017، المجلد 355، العدد 6329
  62. ↑ فيلالبا، أدريان؛ سماجدور، آنا؛ براسينغتون، إيان؛ كوتاس، دانييلا (2024-11-20). "أخلاقيات الحمض النووي الاصطناعي" . مجلة الأخلاقيات الطبية : jme–2024–110124. doi : 10.1136/jme-2024-110124 . ISSN 0306-6800 . PMID 39567177 .  
  63. ↑ فيلالبا، أدريان؛ براسينغتون، إيان؛ سماجدور، آنا؛ كوتاس، دانييلا (2025-05-07). "الحمض النووي الاصطناعي والتبرع بالميتوكوندريا: هل هناك حاجة إلى بويضات متبرعة؟" . مجلة أخلاقيات الطب : jme–2024–110122. doi : 10.1136/jme-2024-110122 . ISSN 0306-6800 . PMID 40335280 .  
  64. ↑ فيلالبا، أدريان؛ راسانين، يونا (أكتوبر 2025). "الأمشاج الاصطناعية ومشكلة عدم التطابق: أطفال الغد" . اتجاهات في علم الوراثة . 41 (10): 845-848 . doi : 10.1016/j.tig.2025.08.004 .