ناقل الاستنساخ

تتميز جميع نواقل الاستنساخ بخصائص تسمح بإدخال الجين فيها أو إزالته منها بسهولة. قد يكون ذلك موقع استنساخ متعدد (MCS) أو رابط متعدد، يحتوي على العديد من مواقع التقييد الفريدة . تُقطع مواقع التقييد في موقع الاستنساخ المتعدد أولًا بواسطة إنزيمات التقييد، ثم يُربط الجين المستهدف المُضخّم بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والمُهضّم أيضًا بنفس الإنزيمات، بالنواقل باستخدام إنزيم ربط الحمض النووي (DNA ligase ). يمكن إدخال تسلسل الحمض النووي المستهدف في الناقل باتجاه محدد إذا لزم الأمر. كما يمكن استخدام مواقع التقييد لاحقًا للاستنساخ الفرعي في ناقل آخر عند الحاجة.

قد تستخدم بعض نواقل الاستنساخ الأخرى إنزيم توبويزوميراز بدلاً من الليغاز، مما يُسرّع عملية الاستنساخ دون الحاجة إلى هضم الحمض النووي للناقل أو الجزء المُدخل. في طريقة استنساخ TOPO هذه ، يُفعّل ناقل خطي بربط إنزيم توبويزوميراز I بنهايتيه، ثم يستقبل هذا الناقل "المُفعّل بواسطة TOPO" ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بربط نهايتي 5' لناتج PCR، مما يُحرر إنزيم توبويزوميراز ويُشكّل ناقلاً دائرياً. ^{[ 2 ]} وهناك طريقة أخرى للاستنساخ دون استخدام هضم الحمض النووي أو الليغاز، وهي إعادة تركيب الحمض النووي ، كما هو مُستخدم في نظام استنساخ Gateway ، وتجميع Gibson . ^{[ 3 ] [ 4 ]} وبمجرد استنساخ الجين في ناقل الاستنساخ (المُسمى بنسخة الإدخال في هذه الطريقة)، يُمكن إدخاله بسهولة في مجموعة متنوعة من نواقل التعبير عن طريق إعادة التركيب. ^{[ 5 ]}

يحمل الناقل علامة اختيارية تسمح بانتقاء الخلايا المتحولة إيجابياً . غالباً ما تُستخدم مقاومة المضادات الحيوية كعلامة، ومن الأمثلة على ذلك جين بيتا لاكتاماز ، الذي يُكسب مقاومة لمجموعة البنسلين من مضادات بيتا لاكتام مثل الأمبيسيلين أو فئات أخرى من المضادات الحيوية، مثل التتراسيكلين ، والكاناميسين أ ، والكلورامفينيكول . ^{[ 6 ]} تحتوي بعض النواقل على علامتين اختياريتين، على سبيل المثال، يحتوي البلازميد pACYC177 على جين مقاومة كل من الأمبيسيلين والكاناميسين . ^{[ 7 ]} قد يتطلب ناقل النقل، المصمم للبقاء في كائنين مختلفين، علامتين اختياريتين أيضاً، على الرغم من أن بعض العلامات الاختيارية مثل مقاومة الزيوسين والهيغروميسين ب فعالة في أنواع مختلفة من الخلايا. كما يمكن استخدام علامات اختيار التغذية الذاتية التي تسمح للكائن الحي ذي التغذية الذاتية بالنمو في وسط نمو بسيط . ومن الأمثلة على ذلك LEU2 و URA3 اللذان يستخدمان مع سلالات الخميرة ذاتية التغذية المقابلة لهما. ^{[ 8 ]}

يُتيح نوع آخر من الواسمات الانتقائية الاختيار الإيجابي للبلازميد الحامل للجين المستنسخ. وقد يتضمن ذلك استخدام جين قاتل للخلايا المضيفة، مثل بارناز [ ^{9 ] ،} و Ccda ^{[ 10} ] ، وسموم parD/parE ^{[ 11 ] [ 12 ]} . ويعمل هذا عادةً عن طريق تعطيل أو إزالة الجين القاتل أثناء عملية الاستنساخ، حيث ^أن المستنسخات غير الناجحة التي يبقى فيها الجين القاتل سليمًا ستؤدي إلى موت الخلايا المضيفة، وبالتالي يتم اختيار المستنسخات الناجحة فقط.

تُستخدم الجينات المُبلِّغة في بعض نواقل الاستنساخ لتسهيل فحص المستنسخات الناجحة، وذلك بالاستفادة من خصائص هذه الجينات التي تُتيح تحديد المستنسخ الناجح بسهولة. قد تتضمن هذه الخصائص الموجودة في نواقل الاستنساخ جزء lacZ α للتكامل α في عملية الاختيار بين الأزرق والأبيض ، و/أو جينات واسمة أو جينات مُبلِّغة مُتوافقة مع إطار قراءة موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) ومُحيطة به، وذلك لتسهيل إنتاج البروتينات الاندماجية . ومن أمثلة البروتينات الاندماجية التي يُمكن استخدامها في الفحص: البروتين الفلوري الأخضر (GFP) واللوسيفيراز .

لا يشترط أن يحتوي ناقل الاستنساخ على عناصر مناسبة للتعبير عن الجين المستهدف المستنسخ، مثل المحفز وموقع ارتباط الريبوسوم (RBS)، إلا أن العديد منها يحتوي عليها، وبالتالي يمكن استخدامه كناقل تعبير . يُدخل الحمض النووي المستهدف في موقع يخضع لسيطرة محفز معين ضروري للتعبير عن الجين المستهدف في الكائن المضيف المُختار. في حال وجود المحفز، يُفضل أن يكون التعبير عن الجين مُتحكمًا به بدقة وقابلًا للتحفيز ، بحيث لا تُنتج البروتينات إلا عند الحاجة. من المحفزات الشائعة الاستخدام محفزات T7 و lac . يُعد وجود المحفز ضروريًا عند استخدام تقنيات الفرز، مثل اختيار اللون الأزرق والأبيض .

تُستخدم أحيانًا نواقل الاستنساخ الخالية من المحفز وموقع ارتباط الريبوسوم (RBS) لتسلسل الحمض النووي المستنسخ، على سبيل المثال عند استنساخ الجينات التي تكون منتجاتها سامة لخلايا الإشريكية القولونية . كما أن المحفز وموقع ارتباط الريبوسوم لتسلسل الحمض النووي المستنسخ غير ضروريين عند إنشاء مكتبة جينومية أو مكتبة cDNA للمستنسخات، حيث يتم عادةً استنساخ الجينات المستنسخة في ناقل تعبير أكثر ملاءمة إذا لزم التعبير عنها.

صُممت بعض النواقل لغرض النسخ فقط، دون إنتاج أي بروتين غير متجانس، كما هو الحال في إنتاج الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في المختبر . تُسمى هذه النواقل بنواقل النسخ. وقد تفتقر إلى التسلسلات اللازمة لعملية إضافة ذيل عديد الأدينين وإنهاء النسخ، لذا لا يمكن استخدامها لإنتاج البروتين.

البلازميدات هي جزيئات دائرية من الحمض النووي خارج الكروموسومات تتضاعف ذاتيًا. وهي نواقل الاستنساخ القياسية والأكثر شيوعًا. يمكن استخدام معظم البلازميدات العامة لاستنساخ أجزاء من الحمض النووي يصل حجمها إلى 15 كيلوبايت. يُعد البلازميد pBR322 من أوائل نواقل الاستنساخ الشائعة الاستخدام . تشمل نواقل الاستنساخ الأخرى سلسلة بلازميدات pUC ، ويتوفر عدد كبير من نواقل بلازميدات الاستنساخ المختلفة. تتميز العديد من البلازميدات بأعداد نسخ عالية، فعلى سبيل المثال، يحتوي البلازميد pUC19 على عدد نسخ يتراوح بين 500 و700 نسخة لكل خلية، ^{[ 7 ]} ويُعد العدد الكبير من النسخ مفيدًا لأنه يُنتج كمية أكبر من البلازميد المُعاد تركيبه لإجراء تعديلات لاحقة. مع ذلك، قد يُفضل استخدام البلازميدات ذات العدد المنخفض من النسخ في بعض الحالات، على سبيل المثال، عندما يكون البروتين الناتج من الجين المُستنسخ سامًا للخلايا. ^{[ 13 ]}

تحتوي بعض البلازميدات على أصل تضاعف لفيروس M13، ويمكن استخدامها لإنتاج الحمض النووي أحادي السلسلة. تُسمى هذه البلازميدات بالفاجيميدات ، ومن أمثلتها سلسلة نواقل الاستنساخ pBluescript .

نظراً لاعتماد نواقل الاستنساخ القائمة على البلازميد على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية، يتم الاحتفاظ بأمثلة موصوفة جيداً كمواد مرجعية في مراكز الموارد البيولوجية العامة والمستودعات غير الربحية، مما يدعم إمكانية التكرار في البحث؛ وتشمل هذه المستودعات Addgene والمجموعات العامة مثل BCCM/GeneCorner.

تُستخدم عاثيات λ و M13 في الاستنساخ . ^{[ 14 ]} يوجد حد أقصى لكمية الحمض النووي التي يمكن حشرها في العاثية (53 كيلوبايت كحد أقصى)، لذا، للسماح بإدخال الحمض النووي الغريب في الحمض النووي للعاثية، قد يلزم حذف بعض الجينات غير الأساسية من نواقل استنساخ العاثيات، مثل جينات التحلل، لأن استخدام عاثية λ كناقل استنساخ يقتصر على دورة التحلل. ^{[ 15 ]} يوجد نوعان من نواقل عاثية λ: ناقل الإدخال وناقل الاستبدال. يحتوي ناقل الإدخال على موقع قطع فريد يسمح بإدخال الحمض النووي الغريب الذي يتراوح حجمه بين 5 و11 كيلوبايت. في نواقل الاستبدال، تحيط مواقع الانقسام بمنطقة تحتوي على جينات غير ضرورية لدورة التحلل، ويمكن حذف هذه المنطقة واستبدالها بقطعة الحمض النووي المُدخلة في عملية الاستنساخ، ويمكن إدخال قطعة حمض نووي أكبر حجماً تتراوح بين 8 و24 كيلوبايت. ^{[ 7 ]}

يوجد أيضًا حد أدنى لحجم الحمض النووي الذي يمكن تغليفه داخل العاثية، ولا يمكن تغليف الحمض النووي الناقل الصغير جدًا داخل العاثية بشكل صحيح. يمكن استخدام هذه الخاصية للاختيار - فقد يكون الناقل بدون إدخال صغيرًا جدًا، وبالتالي لا يمكن اختيار سوى النواقل التي تحتوي على إدخال للتكاثر. ^{[ 16 ]}

الكوزميدات هي بلازميدات تتضمن جزءًا من الحمض النووي لفيروس العاثية λ، والذي يحتوي على موقع النهاية المتماسكة ( cos ) الذي يضم العناصر اللازمة لتغليف الحمض النووي في جسيمات λ. ويمكنها التضاعف كبلازميد في ظل وجود أصل التضاعف المناسب (ori). ويُستخدم عادةً لاستنساخ أجزاء كبيرة من الحمض النووي يتراوح طولها بين 28 و45 كيلوبايت. ^{[ 7 ]}

يمكن استنساخ قطع جينية يصل حجمها إلى 350 كيلوبايت في الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC). تُحفظ كروموسومات BAC في بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) بنسخة واحدة فقط لكل خلية. ^{[ 7 ]} تعتمد كروموسومات BAC على بلازميد F ، بينما يعتمد كروموسوم اصطناعي آخر يُسمى PAC على عاثية P1 .

تُستخدم الكروموسومات الاصطناعية للخميرة كحوامل لاستنساخ أجزاء الحمض النووي التي يزيد حجمها عن 1 ميجا قاعدة (1 ميجا قاعدة = 1000 كيلو قاعدة). وهي مفيدة في استنساخ أجزاء الحمض النووي الكبيرة، كما هو مطلوب في رسم خرائط الجينوم، مثل مشروع الجينوم البشري . تحتوي هذه الكروموسومات على تسلسل تيلوميري، وتسلسل يتضاعف ذاتيًا (وهي خصائص ضرورية لتضاعف الكروموسومات الخطية في خلايا الخميرة). كما تحتوي هذه الحوامل على مواقع تقييد مناسبة لاستنساخ الحمض النووي الغريب، بالإضافة إلى جينات تُستخدم كعلامات انتقائية.

قد يكون الكروموسوم الاصطناعي البشري مفيدًا كناقل لنقل الجينات إلى الخلايا البشرية، وأداة لدراسات التعبير الجيني وتحديد وظيفة الكروموسوم البشري. فهو قادر على حمل أجزاء كبيرة جدًا من الحمض النووي (لا يوجد حد أقصى للحجم عمليًا)، وبالتالي لا يعاني من مشكلة محدودية قدرة الاستنساخ التي تعاني منها النواقل الأخرى، كما أنه يتجنب الطفرات الإدخالية المحتملة الناتجة عن اندماجه في كروموسومات الخلية المضيفة بواسطة ناقل فيروسي. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

تم التلاعب بالفيروسات التي تصيب الخلايا النباتية والحيوانية لإدخال جينات غريبة إليها. وقد جعلت قدرة الفيروسات الطبيعية على الالتصاق بالخلايا، وإدخال حمضها النووي، والتكاثر، منها ناقلات مثالية لنقل الحمض النووي الغريب إلى الخلايا حقيقية النواة في المزارع الخلوية. استُخدم ناقل قائم على فيروس القرود 40 (SV40) في أول تجربة استنساخ شملت خلايا ثديية. كما استُخدم عدد من النواقل القائمة على أنواع أخرى من الفيروسات، مثل الفيروسات الغدية وفيروس الورم الحليمي، لاستنساخ الجينات في الثدييات. في الوقت الحاضر، تُعد النواقل الفيروسية القهقرية شائعة الاستخدام لاستنساخ الجينات في خلايا الثدييات. أما في حالة النباتات، فقد استُخدمت فيروسات مثل فيروس موزاييك القرنبيط ، وفيروس موزاييك التبغ ، وفيروسات جيميني بنجاح محدود.