عرض mRNA

تقنية عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) هي تقنية تُستخدم لتطوير البروتينات و/أو الببتيدات في المختبر ، بهدف إنتاج جزيئات قادرة على الارتباط بالهدف المطلوب. ينتج عن هذه العملية ببتيدات أو بروتينات مترجمة مرتبطة بجزيء mRNA الأصلي عبر رابطة البوروميسين . ثم يرتبط هذا المركب بهدف مُثبَّت في خطوة انتقاء ( كروماتوغرافيا التقارب ). بعد ذلك، تُنسخ جزيئات mRNA-البروتين المدمجة التي ترتبط جيدًا عكسيًا إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA)، ويُضخَّم تسلسلها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ( PCR ). والنتيجة هي تسلسل نيوكليوتيدي يُشفِّر ببتيدًا ذا ألفة عالية للجزيء المطلوب.

البوروميسين هو نظير للنهاية 3' لجزيء تيروسيل-tRNA، حيث يُحاكي جزء من بنيته جزيء الأدينوزين ، بينما يُحاكي الجزء الآخر جزيء التيروسين . وبالمقارنة مع رابطة الإستر القابلة للكسر في جزيء تيروسيل-tRNA، يحتوي البوروميسين على رابطة أميدية غير قابلة للتحلل. ونتيجة لذلك، يُعيق البوروميسين عملية الترجمة، مما يؤدي إلى إطلاق نواتج الترجمة قبل الأوان.

تحتوي جميع قوالب mRNA المستخدمة في تقنية عرض mRNA على البوروميسين في نهايتها 3'. أثناء عملية الترجمة، يتحرك الريبوسوم على طول قالب mRNA، وبمجرد وصوله إلى النهاية 3' للقالب، يدخل البوروميسين المدمج إلى الموقع A في الريبوسوم ويُدمج في الببتيد المتكون حديثًا. ثم يُطلق اندماج mRNA-الببتيد من الريبوسوم (الشكل 1).

لتخليق جزيء mRNA-بوليببتيد مُدمج، لا يُعدّ دمج البوروميسين التعديل الوحيد على قالب mRNA. ^{[ 1 ]} بل يجب إضافة قليل النوكليوتيدات وفواصل أخرى إلى جانب البوروميسين لتوفير المرونة والطول المناسبين لدخول البوروميسين إلى الموقع A. من الناحية المثالية، يجب أن يكون الرابط بين الطرف 3' لجزيء mRNA والبوروميسين مرنًا وطويلًا بما يكفي للسماح للبوروميسين بالدخول إلى الموقع A عند ترجمة الكودون الأخير. وهذا يُتيح إنتاج جزيء mRNA-بوليببتيد مُدمج عالي الجودة وكامل الطول بكفاءة. قام ريهي ليو وزملاؤه بتحسين فاصل قليل النوكليوتيدات 3'-بوروميسين. وأفادوا بأنّ dA25 مع الفاصل 9 (من شركة Glen Research)، وdAdCdCP عند الطرف 5'، حقق أفضل النتائج لتفاعل الدمج. وجدوا أن الروابط التي يزيد طولها عن 40 نيوكليوتيدًا والأقصر من 16 نيوكليوتيدًا أظهرت كفاءة منخفضة للغاية في تكوين الاندماج. كذلك، عندما وُضِعَ التسلسل rUrUP بجوار البوروميسين، لم يتشكل الاندماج بكفاءة. ^{[ 2 ]}

إضافةً إلى توفير المرونة والطول، يسمح جزء البولي دي أي من الرابط بتنقية إضافية لجزيء mRNA-بولي ببتيد المدمج نظرًا لتقاربه العالي مع راتنج السليلوز دي تي. ^{[ 3 ]} يمكن اختيار جزيئات mRNA-بولي ببتيد المدمجة على أهداف اختيار مثبتة لعدة جولات بدرجات متفاوتة من الدقة. بعد كل جولة اختيار، يتم تضخيم عناصر المكتبة التي تبقى مرتبطة بالهدف المثبت باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، بينما تُغسل العناصر غير المرتبطة.

تبدأ عملية تصنيع مكتبة عرض mRNA بتصنيع مكتبة DNA. يمكن تصنيع مكتبة DNA لأي بروتين أو ببتيد صغير مرغوب فيه باستخدام التخليق على الطور الصلب متبوعًا بتضخيم PCR. عادةً، يحتوي كل عنصر من عناصر مكتبة DNA هذه على موقع نسخ لإنزيم بوليميراز RNA T7 وموقع ارتباط ريبوسومي في الطرف 5'. تسمح منطقة محفز T7 بنسخ مكتبة DNA على نطاق واسع في المختبر باستخدام T7، مما يوفر قوالب لتفاعل الترجمة في المختبر لاحقًا. يُصمم موقع الارتباط الريبوسومي في المنطقة غير المترجمة 5' (5' UTR) وفقًا لنظام الترجمة في المختبر المستخدم. يوجد نظامان شائعان للترجمة في المختبر متوفران تجاريًا . أحدهما هو نظام E. coli S30 Extract System (Promega) الذي يتطلب تسلسل Shine-Dalgarno في المنطقة غير المترجمة 5' كموقع ارتباط ريبوسومي؛ ^{[ 4 ]} والآخر هو Red Nova Lysate (Novagen)، والذي يحتاج إلى موقع ارتباط ريبوسومي ΔTMV.

بعد إنشاء مكتبة mRNA، تُنقى باستخدام تقنية Urea-PAGE، ثم تُربط باستخدام إنزيم T4 DNA ligase برابط DNA الفاصل الذي يحتوي على البوروميسين عند الطرف 3'. في هذه الخطوة، يُربط جزء من mRNA بسلسلة DNA أحادية بمساعدة إنزيم T4 DNA ligase. هذا ليس تفاعل ربط T4 DNA ligase القياسي، حيث تُربط قطعتان من DNA مزدوج السلسلة معًا. لزيادة كفاءة هذا الربط الخاص، يمكن استخدام قالب DNA أحادي السلسلة للمساعدة في تفاعل الربط. صُمم الطرف 5' للقالب ليكون مكملاً للطرف 3' من mRNA، وصُمم الطرف 3' للقالب ليكون مكملاً للطرف 5' من رابط DNA الفاصل، الذي يتكون عادةً من نيوكليوتيدات متعددة dA (الشكل 2).

تُترجم مكتبة mRNA-DNA-puromycin المربوطة في مستخلص Red Nova Lysate (Novagen) أو نظام E. coli S30 Extract System (Promega)، مما ينتج عنه عديدات ببتيد مرتبطة تساهميًا في وضع cis مع mRNA المشفر. يمكن أيضًا إجراء الترجمة في المختبر باستخدام نظام PURE (تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلفة). نظام PURE هو نظام ترجمة خالٍ من الخلايا يعتمد على E. coli، ويحتوي فقط على مكونات الترجمة الأساسية. يمكن حذف بعض المكونات، مثل الأحماض الأمينية وإنزيمات أمينو أسيل-tRNA سينثاز (AARSs)، من النظام. بدلاً من ذلك، يمكن إضافة tRNA المؤَسْتَل كيميائيًا إلى نظام PURE. وقد ثبت أنه يمكن دمج بعض الأحماض الأمينية غير الطبيعية، مثل tRNA المؤَسْتَل N-ميثيل-حمض أميني، في الببتيدات أو اندماجات mRNA-عديد الببتيد في نظام PURE. ^{[ 5 ]}

بعد الترجمة، تُحوَّل أجزاء mRNA أحادية السلسلة من الجزيئات المدمجة إلى جزيئات RNA/DNA غير متجانسة بواسطة إنزيم النسخ العكسي للتخلص من أي بنى ثانوية غير مرغوب فيها في RNA، ولجعل جزء الحمض النووي من الجزيء المدمج أكثر استقرارًا. هذه الخطوة هي تفاعل نسخ عكسي قياسي. على سبيل المثال، يمكن إجراؤها باستخدام إنزيم Superscript II (GIBCO-BRL) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

يمكن اختيار جزيئات mRNA/DNA-polypeptide المدمجة على أهداف اختيار مثبتة لعدة جولات (الشكل 3). قد يكون هناك مستوى عالٍ نسبيًا من الخلفية في الجولات القليلة الأولى من الاختيار، ويمكن تقليله عن طريق زيادة دقة الاختيار، مثل تعديل تركيز الملح، وكمية المنظف، و/أو درجة الحرارة أثناء فترة ارتباط الهدف/الجزيء المدمج. بعد اختيار الارتباط، يتم تضخيم عناصر المكتبة التي تبقى مرتبطة بالهدف المثبت باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ستؤدي خطوة تضخيم PCR إلى إثراء المجموعة من مكتبة عرض mRNA التي تتمتع بألفة أعلى للهدف المثبت. يمكن أيضًا إجراء تفاعل PCR المعرض للخطأ بين كل جولة من جولات الاختيار لزيادة تنوع مكتبة عرض mRNA وتقليل الخلفية في الاختيار. ^{[ 6 ]}

نُشر مؤخراً بروتوكول أقل استهلاكاً للوقت لعرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA). ^{[ 7 ]}

على الرغم من وجود العديد من تقنيات العرض الجزيئي الأخرى، مثل عرض العاثيات ، وعرض البكتيريا ، وعرض الخميرة ، وعرض الريبوسومات ، إلا أن تقنية عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) تتميز بالعديد من المزايا مقارنةً بغيرها. ^{[ 8 ]} تحتوي مكتبات العرض البيولوجي الثلاث الأولى المذكورة على عديدات ببتيد أو بروتينات مُعبر عنها على سطح الكائنات الحية الدقيقة المعنية، ويمكن استرجاع المعلومات الترميزية المصاحبة لكل عديد ببتيد أو بروتين من جينوم الكائن الحي الدقيق. ومع ذلك، فإن حجم المكتبة لهذه الأنظمة الثلاثة للعرض الحيوي محدود بكفاءة تحويل كل كائن حي. على سبيل المثال، يقتصر حجم مكتبة عرض العاثيات والبكتيريا على 1-10 × 10^9 عنصر مختلف. أما حجم مكتبة عرض الخميرة فهو أصغر من ذلك. علاوة على ذلك، لا تسمح أنظمة العرض الخلوية هذه إلا بفحص وإثراء الببتيدات/البروتينات التي تحتوي على أحماض أمينية طبيعية. في المقابل، يُعد عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) وعرض الريبوسومات طريقتين للاختيار في المختبر . وهما تسمحان بحجم مكتبة يصل إلى 10^15 عنصرًا مختلفًا. يزيد حجم المكتبة الكبير من احتمالية اختيار التسلسلات النادرة جدًا، كما يُحسّن من تنوّع التسلسلات المختارة. إضافةً إلى ذلك، تُزيل طرق الاختيار المختبري ضغوط الاختيار غير المرغوب فيها، مثل ضعف التعبير البروتيني، والتحلل السريع للبروتين، والتي قد تُقلّل من تنوّع التسلسلات المختارة. وأخيرًا، تُتيح طرق الاختيار المختبري تطبيق تقنيات الطفرات المُستحثة ^{[ 9 ]} وتقنيات إعادة التركيب طوال عملية الاختيار.

على الرغم من أن كلاً من تقنية عرض الريبوسوم وتقنية عرض mRNA تُعتبران من طرق الانتقاء المختبري ، إلا أن تقنية عرض mRNA تتميز ببعض المزايا على تقنية عرض الريبوسوم. ^{[ 10 ]} إذ تستخدم تقنية عرض mRNA معقدات mRNA-ببتيد مرتبطة تساهميًا عبر البوروميسين، بينما تستخدم تقنية عرض الريبوسوم معقدات ريبوسوم-mRNA-ببتيد غير تساهمية ثابتة. ^{[ 11 ]} في تقنية عرض الريبوسوم، تكون دقة الانتقاء محدودة للحفاظ على معقد الريبوسوم-mRNA-ببتيد ضمن المعقد نظرًا لعدم تساهمية هذه المعقدات. قد يُسبب هذا صعوبات في تقليل الارتباط غير المرغوب فيه أثناء دورة الانتقاء. إضافةً إلى ذلك، ترتبط الببتيدات الخاضعة للانتقاء في نظام عرض الريبوسوم بمعقد بروتين-rRNA ضخم، وهو الريبوسوم، الذي يزيد وزنه الجزيئي عن 2,000,000 دالتون. قد يحدث تفاعل غير متوقع بين الهدف الانتقائي والريبوسوم، مما قد يؤدي إلى فقدان بعض الروابط المحتملة خلال دورة الانتقاء. في المقابل، فإن رابط فاصل الحمض النووي البوروميسين المستخدم في تقنية عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) أصغر بكثير من الريبوسوم، وبالتالي تقل احتمالية تفاعله مع الهدف الانتقائي المثبت. لذا، من المرجح أن تعطي تقنية عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول نتائج أقل تحيزًا.

في عام 1997، أظهر روبرتس وسزوستاك أنه يمكن إثراء عمليات الاندماج بين mRNA اصطناعي وعلامة myc المشفرة له من مجموعة من عمليات اندماج mRNA-بوليببتيد ذات التسلسل العشوائي عن طريق الترسيب المناعي. ^{[ 6 ]}

بعد تسع سنوات، اختار فوكودا وزملاؤه طريقة عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لتطوير أجزاء الأجسام المضادة أحادية السلسلة (scFv) في المختبر . ^{[ 12 ]} اختاروا ستة طفرات مختلفة من scFv بخمس طفرات متفق عليها. ومع ذلك، أظهر التحليل الحركي لهذه الطفرات أن خصوصيتها تجاه المستضد ظلت مماثلة للنوع البري. كما أثبتوا أن اثنتين من الطفرات الخمس المتفق عليها تقعان ضمن المناطق المحددة للتكامل (CDRs). وخلصوا إلى أن طريقة عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لديها القدرة على التطوير الاصطناعي السريع للأجسام المضادة التشخيصية والعلاجية عالية الألفة من خلال تحسين المناطق المحددة للتكامل (CDRs).

أثبت روبرتس وزملاؤه إمكانية تصنيع ببتيدات قليلة الوحدات غير طبيعية، تتكون من حمض أميني مُستبدل في الموقع N، على شكل اندماجات بين الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والببتيد. ^{[ 13 ]} وقد ارتبطت الببتيدات المحتوية على حمض أميني مُستبدل في الموقع N بثبات بروتيني جيد وخصائص حركية دوائية محسّنة. يشير هذا العمل إلى أن تقنية عرض الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لديها القدرة على اختيار ببتيدات شبيهة بالأدوية للاستخدام العلاجي، مقاومة للتحلل البروتيني. ^{[ 14 ]}

• عرض الريبوسوم
• هندسة البروتين
• فحص تفاعلات البروتين-البروتين