اختبار استجابة الديناميكيات الهيكلية

📅 آخر تحديث: ١ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ١ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 1 صور
الموسوعة الحرة

يُعد اختبار استجابة الديناميكيات الهيكلية (SDR) نوعًا من الاختبارات الفيزيائية الحيوية المستخدمة لقياس ارتباط الليجاند ببروتين مستهدف . يتميز هذا الاختبار بسهولة إجرائه، حيث يتم مزج العينة وقراءتها مباشرةً، ويمكن إجراؤه بكميات صغيرة جدًا، مما يجعله مناسبًا لتطبيقات اكتشاف الأدوية ، مثل الفحص عالي الإنتاجية (HTS)، أو في تطوير مرشح دوائي خلال دورات تحسين الكيمياء الطبية .

الشكل 1. مفهوم اختبار استجابة الديناميكيات البنيوية (SDR). (أعلى) يعتمد اختبار SDR على استشعار ارتباط الليجاند ببروتين الهدف (TOI) من خلال تغير شدة الضوء المنبعث من إنزيم لوسيفيراز المرتبط به. في الشكل، يمثل بروتين الهدف (أحمر) المدمج مع إنزيم لوسيفيراز (معين أصفر) بروتينًا في هيئات مختلفة قبل ارتباط الليجاند. أما بروتين الهدف المرتبط بالليجاند (أزرق) المدمج مع إنزيم لوسيفيراز (نجمة صفراء) فيمثل بروتين الهدف الأكثر تقييدًا من الناحية الهيكلية، وما ينتج عنه من زيادة في شدة الإضاءة . (أسفل) مخططات استجابة التركيز التي توضح حدث ارتباط الليجاند النموذجي، كما تم قياسه إما عن طريق تثبيط النشاط الوظيفي لبروتين الهدف (المنحنى الأسود) أو عن طريق اختبار SDR (المنحنيات الزرقاء)، حيث يؤدي ارتباط الليجاند إلى زيادة في إشارة الخرج، والتي يمكن أن تختلف في سعتها تبعًا لطبيعة بروتين الهدف والليجاند.

مبدأ

يعتمد اختبار ارتباط الليجاند SDR على ملاحظة أن ارتباط الليجاند ببروتين مستهدف (TOI) يؤثر على شدة إشارة إنزيم الاستشعار المرتبط به (الشكل 1). تشير الدراسات الأولية إلى أن اختبار SDR قد يكون مفيدًا لمجموعة واسعة من البروتينات، بما في ذلك البروتينات المستهدفة للأدوية والبروتينات ذات الأهمية في مجال المبيدات الزراعية . [ 1 ] [ 2 ]

يبدو أن اختبار SDR يستغل التغيرات المرتبطة بالرابطة في الديناميكيات البنيوية أو التكوين الفراغي للبروتين المستهدف ( ديناميكيات البروتين ) لتعديل تألق إنزيم حساس ملتحم إما بالنهاية الأمينية أو الكربوكسيلية للبروتين المستهدف. لا يتطلب اختبار SDR رابطًا منافسًا كما هو الحال في تقنيات مثل المقايسة المناعية للاستقطاب الفلوري (FP) [ 3 ] أو غيرها من المقايسات التنافسية ذات الصلة. كما أن اختبار SDR مستقل عن وظيفة البروتين المستهدف. وهذا ذو أهمية خاصة بالنسبة للإنزيمات المستهدفة التي تحفز تفاعلات تكون ركائزها، على سبيل المثال، غير متوفرة أو غير مستقرة أو غير معروفة.

أثبتت هذه الطريقة قدرتها على الكشف عن ارتباط الأسيمينيب بموقع ارتباط حمض الميريستيك في نطاق التيروزين كيناز أبيلسون . ويكتسب هذا أهمية بالغة لأن الأسيمينيب لا يثبط النشاط التحفيزي للتيروزين كيناز في التحليلات الكيميائية الحيوية التي تقيس فسفرة الركيزة أو معدل دوران الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) للعامل المساعد ، مما يشير إلى أن تحليل SDR قد يكون مفيدًا في الكشف عن الروابط المرتبطة بمواقع تنظيمية مختلفة .

لقد تم إثبات عمومية هذه الطريقة باستخدام فئات مختلفة من الإنزيمات، إما باستخدام إنزيم لوسيفيراز نانولوس (NLuc) الكامل أو تسلسل HiBiT المكون من 11 حمضًا أمينيًا والذي يسمح بالتكامل ألفا. [ 4 ] وقد ثبت أن الحساسية العالية للغاية لهذه الطريقة تُمكّن من تقييم هدف مستهدف (TOI) تم اختباره كمستخلص خلوي تم الحصول عليه بواسطة تحرير الجينات المستهدفة بوساطة CRISPR/Cas9 .

طلب

تم إثبات فعالية اختبار SDR في الفحص الكمي عالي الإنتاجية (qHTS) [ 5 ] في شكل لوحة ميكروية ذات 1536 بئراً باستخدام إنزيمات من فئات الإنزيمات التالية : أحادي الأكسجيناز المعتمد على عامل ATP المساعد باستخدام لوسيفيراز اليراعة (FLuc)؛ [ 6 ] أوكسيدوريدوكتاز باستخدام ديهيدروفولات ريدوكتاز (DHFR)؛ [ 7 ] تيروسين كيناز باستخدام نطاق تيروسين كيناز أبيلسون (ABL1)؛ [ 8 ] بروتين كيناز سيرين/ثريونين باستخدام بروتين كيناز A (PKA)؛ [ 9 ] إيزوميراز باستخدام فوسفوجليسيرات ميوتيز غير المعتمد على العامل المساعد (iPGM)؛ [ 10 ] ليغازات الحمض النووي المعتمدة على NAD+ وATP، باستخدام ليغاز الحمض النووي E. coli [ 11 ] وليغاز الحمض النووي العاثي T7 ، [ 12 ] على التوالي.

مراجع

  1. ↑ سيولا، د.أ.؛ درانشاك، ب.ك.؛ أيثا، م.؛ فان نير، ر.هـ.ب.؛ شاه، د.؛ ثاراكان، ر.؛ ويلسون، ك.م.؛ وانغ، ي.؛ بريستيد، ج.س.؛ إنجليز، ج. (2025). "منصة فحص عامة لدراسة علم الأدوية البروتينية باستخدام الديناميكيات البنيوية المعتمدة على الربيطة" . نات كوميون . 16 (1) 4342. Bibcode : 2025NatCo..16.4342C . doi : 10.1038/s41467-025-59658-6 . PMC 12064818. PMID 40346061 .  
  2. ↑ لوي، د. (1 يوليو 2025). "التحليلات الجديدة مرحب بها دائمًا" . قيد الإعداد .
  3. ↑ ليا، دبليو إيه؛ سيميونوف، أ . (2011). "مقايسات استقطاب التألق في فحص الجزيئات الصغيرة" . رأي الخبراء في اكتشاف الأدوية . 6 (1): 17-32 . doi : 10.1517/17460441.2011.537322 . PMC 3277431. PMID 22328899 .  
  4. ↑ شوين، إم كيه؛ ماشليدت، تي؛ زيمرمان، كيه؛ إيغرز، سي تي؛ ديكسون، إيه إس؛ هيرست، آر؛ هول، إم بي؛ إنسيل، إل بي؛ بينكوفسكي، بي إف؛ وود، كيه في (2018). "وسم البروتينات الذاتية بببتيد مضيء باستخدام تقنية كريسبر" . مجلة ACS للكيمياء الحيوية . 13 (2): 467-474 . doi : 10.1021/acschembio.7b00549 . PMID 28892606 . 
  5. ↑ إنجليز، ج.؛ أولد، د.س.؛ جادهاف، أ.؛ جونسون، ر.ل.؛ سيميونوف، أ.؛ ياسجار، أ.؛ تشنغ، و.؛ أوستن، س.ب. (2006). "الفحص الكمي عالي الإنتاجية (qHTS): نهج قائم على المعايرة لتحديد الأنشطة البيولوجية بكفاءة في المكتبات الكيميائية الكبيرة" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 103 (31): 11473-11478 . doi : 10.1073/pnas.0604348103 . PMC 1518803. PMID 16864780 .  
  6. ↑ ثورن، ن.؛ شين، م.؛ ليا، و.أ.؛ سيميونوف، أ.؛ لوفيل، س.؛ أولد، د.س.؛ إنجليز، ج. (2012). "إنزيم لوسيفيراز اليراع في البيولوجيا الكيميائية: خلاصة للمثبطات، وتقييم آلي للأنماط الكيميائية، واستخدام مقترح كمؤشر" . الكيمياء والبيولوجيا . 19 (8): 1060-1072 . doi : 10.1016/j.chembiol.2012.07.015 . PMC 3449281. PMID 22921073 .  
  7. ↑ بنكوفيتش، إس جيه؛ فيرك، سي إيه؛ نايلور، إيه إم (1988). "رؤى حول وظيفة الإنزيم من دراسات على طفرات إنزيم ديهيدروفولات ريدوكتاز". مجلة ساينس . 239 (4844): 1105-1110 . رمز Bibcode : 1988Sci...239.1105B . doi : 10.1126/science.3125607 . PMID 3125607 . 
  8. ↑ ناجار، ب.؛ هانتشل، أ.؛ يونغ، م.أ.؛ شيفزيك، ك.؛ فيتش، د.؛ بورنمان، و.؛ كلاركسون، ب.؛ سوبرتي-فورغا، ج.؛ كوريان، ج. (2003). "الأساس البنيوي للتثبيط الذاتي لكيناز التيروزين c-Abl". الخلية . 112 (6): 859-871 . doi : 10.1016/s0092-8674(03)00194-6 . PMID 12654251 . 
  9. ↑ تايلور، إس إس؛ تشانغ، ب؛ ستيتشن، جيه إم؛ كيشواني، إم إم؛ كورنيف، إيه بي (2013). " PKA: دروس مستفادة بعد عشرين عامًا" . بيوشيم. بيوفيز. أكتا . 1834 (7): 1271-1278 . doi : 10.1016/j.bbapap.2013.03.007 . PMC 3763834. PMID 23535202 .  
  10. ↑ وايدمان، م.؛ درانشاك، ب.ك.؛ أيثا، م.؛ لامي، ل.؛ كولموس، س.د.؛ كيم، ب.؛ كانتر، ل.؛ باتايل، ك.ب.؛ راي، ج.؛ لوفيل، س.؛ سوغا، هـ.؛ إنجليز، ج. (2021). "العلاقة بين بنية ونشاط ارتباط إيبوجليسيريد بميوتيزات الفوسفوجليسيرات" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 296 100628. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100628 . PMC 8113725. PMID 33812994 .  
  11. ↑ بيرغوليزي، جي.؛ فاغنر، جي. كيه.؛ بووتر، آر. بي. (2016). "التوصيف البيوكيميائي والبنيوي لإنزيمات ربط الحمض النووي من البكتيريا والعتائق" . تقارير العلوم البيولوجية 36 (5) e00391: 00391. doi : 10.1042/BSR20160003 . PMC 5052709. PMID 27582505 .  
  12. ↑ دوهرتي، أ. ج.؛ أشفورد، س. ر.؛ سوبرامانيا، هـ. س.؛ ويجلي، د. ب. (1996). "إنزيم ربط الحمض النووي لفيروس T7: الإفراط في التعبير، والتنقية، والتبلور، والخصائص" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 271 (19): 11083-11089 . doi : 10.1074/jbc.271.19.11083 . PMID 8626651 .