تحليل الانصهار عالي الدقة

درجة انصهار الأمبليكون، التي ينفصل عندها شريطا الحمض النووي، قابلة للتنبؤ تمامًا، إذ تعتمد على تسلسل قواعد الحمض النووي. عند مقارنة عينتين من شخصين مختلفين، من المفترض أن تعطيا منحنى انصهار متطابقًا تمامًا. مع ذلك، إذا كان لدى أحد الشخصين طفرة في منطقة الحمض النووي التي تم تضخيمها، فسيؤدي ذلك إلى تغيير درجة انصهار شريطي الحمض النووي، وبالتالي سيبدو منحنى الانصهار مختلفًا. قد يكون الفرق ضئيلًا جدًا، ربما جزءًا من درجة، ولكن نظرًا لقدرة جهاز تحليل الانصهار عالي الدقة (HRM) على مراقبة هذه العملية بدقة عالية، فمن الممكن توثيق هذه التغييرات بدقة، ومن ثم تحديد وجود الطفرة من عدمه.

تصبح الأمور أكثر تعقيدًا بعض الشيء لأن الكائنات الحية تحتوي على نسختين ( أو أكثر ) من كل جين، تُعرفان بالأليلين . لذا، إذا أُخذت عينة من مريض وتم تضخيمها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، فسيتم تضخيم كلا نسختي منطقة الحمض النووي (الأليلين) محل الاهتمام. وبالتالي، إذا كنا نبحث عن طفرة، فهناك الآن ثلاثة احتمالات:

1. لا يحتوي أي من الأليلين على طفرة
2. يحتوي أحد الأليلين على طفرة
3. يحتوي كلا الأليلين على طفرة.

تُعرف هذه الحالات الثلاث على التوالي باسم "النمط البري" و"المتغاير الزيجوت" و"المتماثل الزيجوت". ويُعطي كل منها منحنى ذوبان مختلفًا قليلاً. وباستخدام تحليل HRM عالي الجودة، يُمكن التمييز بين هذه الحالات الثلاث.

قد تتميز المتغيرات الأليلية المتماثلة بتغير في درجة الحرارة على منحنى الذوبان الناتج عن تحليل HRM. في المقابل، تتميز المتغيرات غير المتماثلة بتغيرات في شكل منحنى الذوبان. ويعود ذلك إلى عدم تطابق أزواج القواعد الناتج عن عدم استقرار ارتباط الحمض النووي المزدوج غير المتجانس بين السلاسل الأصلية والمتغيرة. يمكن ملاحظة هذه الاختلافات بسهولة على منحنى الذوبان الناتج، ويمكن تضخيم اختلافات منحنى الذوبان بين الأنماط الجينية المختلفة بصريًا من خلال إنشاء منحنى الفرق ^{[ 2 ].}

تتسم طرق تحديد النمط الجيني التقليدية للنيوكليوتيدات المفردة (SNP) بأنها تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة، إذ تتطلب دمج عدة فحوصات تعتمد على المجسات معًا أو استخدام مصفوفات الحمض النووي الدقيقة. أما تقنية تحليل منحنى الذوبان عالي الدقة (HRM) فهي أكثر فعالية من حيث التكلفة، وتقلل الحاجة إلى تصميم أزواج متعددة من البادئات وشراء مجسات باهظة الثمن. وقد استُخدمت تقنية HRM بنجاح للكشف عن استبدال واحد من النيوكليوتيد G إلى A في جين Vssc ( قناة الصوديوم الحساسة للجهد )، والذي يُكسب عث الجرب مقاومة لمبيد القراد بيرميثرين . وتؤدي هذه الطفرة إلى تغيير في ترميز البروتين (G1535D). وأظهر تحليل عث الجرب الذي جُمع من مجموعات يُشتبه في حساسيتها وتحملها للبيرميثرين باستخدام تقنية HRM أنماط ذوبان متباينة. ولوحظ أن نواتج التضخيم من العث الحساس لها درجة حرارة ذوبان أعلى مقارنةً بالعث المتحمل، كما هو متوقع نظرًا لثبات زوج القاعدة GC الحراري العالي ^{[ 3 ].}

في مجالٍ أكثر صلةً بالتشخيص السريري، أثبتت تقنية تحليل الذوبان عالي الدقة (HRM) ملاءمتها من حيث المبدأ للكشف عن الطفرات في جينات الاستعداد للإصابة بسرطان الثدي BRCA1 و BRCA2 . وقد تم تحديد أكثر من 400 طفرة في هذه الجينات. يُعد تسلسل الجينات المعيار الذهبي لتحديد الطفرات، إلا أنه عملية تستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب جهدًا كبيرًا، وغالبًا ما تسبقها تقنيات تُستخدم لتحديد الحمض النووي غير المتجانس، مما يزيد من تعقيد هذه المشكلات. توفر تقنية HRM طريقةً أسرع وأكثر ملاءمةً في أنبوب مغلق لتقييم وجود الطفرات، وتعطي نتيجةً يمكن دراستها بشكلٍ أعمق إذا لزم الأمر. في دراسةٍ أجراها سكوت وآخرون عام 2006، ^{[ 4 ]} استُخدمت 3 سلالات خلوية تحمل طفرات BRCA مختلفة لتقييم منهجية HRM. ووجدوا أن منحنيات ذوبان نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الناتجة يمكن استخدامها للتمييز بين وجود الطفرة أو عدم وجودها في منطقة التضخيم. وبالمثل، في عام 2007، أجرى كريبوي وآخرون دراسةً مماثلة. أظهرت الدراسة ^{[ 5 ]} أن التصميم الدقيق لتحليلات HRM (فيما يتعلق بوضع البادئات) يُمكن استخدامه بنجاح للكشف عن الطفرات في جين TP53، الذي يُشفّر بروتين p53 الكابت للورم، في عينات سريرية من سرطان الثدي والمبيض . وأكدت كلتا الدراستين أن التغيرات في منحنى الذوبان قد تتخذ شكل تغير في درجة حرارة الذوبان أو اختلاف واضح في شكل المنحنى. ويعتمد كلا هذين العاملين على تسلسل المُضخّم. ويُجمع الخبراء على أن تحليل HRM طريقة فعّالة من حيث التكلفة، يُمكن استخدامها كفحص أولي للعينات المشتبه في احتوائها على تعدد أشكال جينية أو طفرات. وهذا من شأنه أن يُقلل عدد العينات التي تحتاج إلى مزيد من الفحص باستخدام الطرق التقليدية.

تُستخدم حاليًا العديد من الطرق لتحديد حالة التماثل الجيني (الزيجوتية ) لجينٍ ما في موقعٍ جينيٍّ مُحدد. تشمل هذه الطرق استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع مجساتٍ مُصممة خصيصًا للكشف عن مُتغيرات الجينات (يُعدّ تحديد النمط الجيني للنيوكليوتيدات المفردة SNP أبسط هذه الطرق). في الحالات التي تشمل امتداداتٍ أطول من التباين، قد يكون من الضروري إجراء تحليلٍ لاحقٍ لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمنتجات المُضخّمة. يُمكن قياس التغييرات في خصائص التقييد الإنزيمي، والملامح الكهربائية، والملامح الكروماتوغرافية. عادةً ما تكون هذه الطرق أكثر استهلاكًا للوقت، وتزيد من خطر تلوث المنتجات المُضخّمة في المختبر، نظرًا للحاجة إلى العمل مع تركيزاتٍ عاليةٍ من المنتجات المُضخّمة بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يُقلل استخدام تحليل منحنى الذوبان عالي الدقة (HRM) من الوقت اللازم للتحليل وخطر التلوث. يُعدّ تحليل منحنى الذوبان عالي الدقة حلاً أكثر فعالية من حيث التكلفة، ولا يسمح عنصر الدقة العالية بتحديد التماثل الجيني والتباين الجيني فحسب ، بل يُحدد أيضًا معلوماتٍ حول نوع التماثل الجيني والتباين الجيني، حيث تُؤدي مُتغيرات الجينات المختلفة إلى أشكالٍ مُختلفةٍ لمنحنى الذوبان. دراسةٌ أجراها غوندري وآخرون. أظهرت دراسة أجريت عام 2003 ^{[ 6 ]} أن استخدام الصبغة الفلورية لأحد البادئين (في الزوج) أفضل من استخدام صبغة متداخلة مثل SYBR green I. ومع ذلك، فقد تم إحراز تقدم في تطوير واستخدام أصباغ متداخلة محسنة ^{[ 7 ]} تقلل من مشكلة تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والمخاوف المتعلقة بعدم تشبع الصبغة بالتداخل.

استُخدمت منهجية تحليل الذوبان عالي الدقة (HRM) أيضًا لتوفير تحليل موثوق لحالة مثيلة الحمض النووي. وهذا ذو أهمية بالغة، إذ تُعدّ التغيرات في حالة مثيلة جينات كابتة الأورام، وهي الجينات التي تنظم موت الخلايا المبرمج وإصلاح الحمض النووي ، من سمات السرطانات، ولها أيضًا آثار على الاستجابة للعلاج الكيميائي. على سبيل المثال، قد يكون مرضى السرطان أكثر حساسية للعلاج بعوامل ألكلة الحمض النووي إذا كان مُحفِّز جين إصلاح الحمض النووي MGMT لديهم مثيلًا. في دراسة اختبرت حالة مثيلة مُحفِّز MGMT على 19 عينة من سرطان القولون والمستقيم، وُجد أن 8 عينات منها مثيلة. ^{[ 8 ]} قارنت دراسة أخرى القدرة التنبؤية لمثيلة مُحفِّز MGMT في 83 مريضًا مصابًا بأورام دبقية عالية الدرجة، تم الحصول عليها إما عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل للبوليميراز (MSP) ، أو التسلسل الناري ، أو تحليل الذوبان عالي الدقة (HRM). وُجد أن طريقة تحليل الذوبان عالي الدقة (HRM) تُعادل على الأقل التسلسل الناري في تحديد مستوى المثيلة. ^{[ 9 ]}

يمكن معالجة الحمض النووي الميثيلي بتعديل ثنائي الكبريتيت، الذي يحول السيتوزينات غير الميثيلي إلى يوراسيل . لذلك، فإن نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الناتجة عن قالب غير ميثيلي في الأصل ستكون ذات درجة انصهار أقل من تلك المشتقة من قالب ميثيلي. كما يوفر تحليل الانصهار عالي الدقة (HRM) إمكانية تحديد نسبة الميثلة في عينة معينة، من خلال مقارنتها بمنحنى معياري يتم إنشاؤه عن طريق مزج نسب مختلفة من الحمض النووي الميثيلي وغير الميثيلي. وهذا بدوره يوفر معلومات حول درجة الميثلة التي قد يمتلكها الورم، وبالتالي يعطي مؤشرًا على طبيعة الورم ومدى انحرافه عن المعدل الطبيعي.

كما أن تقنية HRM مفيدة عمليًا للاستخدام في التشخيص، نظرًا لقدرتها على التكيف مع اختبارات الفحص عالية الإنتاجية، كما أنها تقلل من احتمالية انتشار الأمبليكون والتلوث داخل المختبر، نظرًا لشكل الأنبوب المغلق.

لمتابعة تحول الحمض النووي المزدوج (dsDNA) إلى الحمض النووي المفرد (ssDNA)، تُستخدم أصباغ متداخلة. تُظهر هذه الأصباغ انبعاثًا فلوريًا تفاضليًا يعتمد على ارتباطها بالحمض النووي المزدوج أو المفرد. يُعد SYBR Green I صبغة من الجيل الأول لتحليل منحنى الذوبان عالي الدقة (HRM). يتألق هذا الصبغ عند تداخله مع الحمض النووي المزدوج، وليس مع الحمض النووي المفرد. ولأنه قد يُثبط تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عند التركيزات العالية، يُستخدم بتركيزات أقل من تركيز التشبع. مؤخرًا، ثبط بعض الباحثين استخدام SYBR Green I في تحليل منحنى الذوبان عالي الدقة ^{[ 10 ]} ، مُشيرين إلى ضرورة إجراء تعديلات جوهرية على البروتوكول. يُعزى ذلك إلى أن عدم الدقة قد ينتج عن "قفز الصبغة"، حيث قد تُعاد دمج الصبغة من الحمض النووي المزدوج المذاب في مناطق من الحمض النووي المزدوج لم تذوب بعد. ^{[ 6 ] [ 10 ]} تتوفر في السوق أصباغ تشبع جديدة مثل LC Green وLC Green Plus وResoLight وEvaGreen وChromofy وSYTO 9، وقد استُخدمت بنجاح في تقنية قياس معدل ضربات القلب عالي الدقة (HRM). مع ذلك، استخدمت بعض المجموعات بنجاح صبغة SYBR Green I في تقنية HRM باستخدام أجهزة Corbett Rotorgene ^{[ 11 ]} ، وتوصي باستخدامها في تطبيقات HRM.