تحليل التدفق الأيضي

تُعدّ تجارب الوسم النظائري الأمثل لجمع البيانات التجريبية اللازمة لتحليل تدفق الأيض. ولأنّ التدفقات تحدد أنماط الوسم النظائري للأيضات داخل الخلايا، فإنّ قياس هذه الأنماط يسمح باستنتاج التدفقات. ^{[ 10 ]} تتمثل الخطوة الأولى في سير عمل تجارب الوسم النظائري في زراعة الخلايا على ركائز موسومة. تُوسم ركيزة، مثل الجلوكوز، بنظير أو أكثر، وغالبًا ما يكون الكربون ^-13 ، وتُضاف إلى وسط الزرع. يحتوي الوسط عادةً على فيتامينات وأحماض أمينية أساسية لتسهيل نمو الخلايا. ^{[ 11 ]} ثمّ تستقلب الخلايا الركيزة الموسومة، مما يؤدي إلى دمج متتبع الكربون ^-13 في أيضات أخرى داخل الخلايا. بعد أن تصل الخلايا إلى حالة الاستقرار الفسيولوجي (أي تركيزات ثابتة للأيضات في المزرعة)، تُحلل الخلايا لاستخلاص الأيضات. بالنسبة لخلايا الثدييات، يتضمن الاستخلاص تثبيط الخلايا باستخدام الميثانول لإيقاف استقلابها الخلوي، ثم استخلاص الأيضات باستخدام الميثانول والاستخلاص المائي. ^{[ 12 ]} تُقاس تركيزات المستقلبات والنظائر الموسومة في مستقلبات المستخلصات باستخدام أجهزة مثل كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة أو الرنين المغناطيسي النووي، والتي توفر أيضًا معلومات حول موقع وعدد الذرات الموسومة على المستقلبات. ^{[ 11 ]} تُعد هذه البيانات ضرورية لفهم ديناميكيات الأيض داخل الخلايا ومعدلات دوران المستقلبات لاستنتاج التدفق الأيضي.

تُعدّ طريقة تحليل التدفق الأيضي الثابتة نظائريًا (MFA) من الطرق الشائعة لتحليل التدفق الأيضي. وتُطبّق هذه التقنية لتحديد كمية التدفق في حالتي الاستقرار الأيضي والنظائري، ^{[ 13 ]} وهما حالتان تفترضان عدم تغيّر تركيزات المستقلبات وتوزيعات النظائر بمرور الوقت، على التوالي. ويتطلب تحقيق التوازن في التدفقات (v) حول نموذج الشبكة الأيضية المفترض معرفة المصفوفة القياسية (S) التي تشمل استهلاك وإنتاج المستقلبات ضمن التفاعلات الكيميائية الحيوية. ^{[ 13 ]} وبافتراض حالة الاستقرار الأيضي، يُمكن تحديد كمية التدفقات الأيضية بحلّ معكوس معادلة الجبر الخطي البسيطة التالية :

${\displaystyle S\times v=0}$

لتقليل نطاق الحلول الممكنة لتوزيعات التدفق، يتطلب تحليل التدفق الأيضي المستقر نظائريًا قيودًا قياسية إضافية، مثل معدلات النمو، وإفراز الركيزة وامتصاصها، ومعدلات تراكم المنتج، بالإضافة إلى حدود عليا ودنيا للتدفقات. ^{[ 14 ]} على الرغم من أن تحليل التدفق الأيضي المستقر نظائريًا يسمح باستنتاج دقيق للتدفقات الأيضية من خلال النمذجة الرياضية، إلا أن التحليل يقتصر على المزارع الدفعية خلال المرحلة الأسية. ^{[ 15 ]} علاوة على ذلك، بعد إضافة ركيزة موسومة، قد يصعب تحديد النقطة الزمنية التي يمكن عندها افتراض حالة الاستقرار الأيضي والنظائري بدقة. ^{[ 13 ]}

عندما يكون الوسم النظائري عابرًا ولم يصل بعد إلى حالة التوازن، يُعد تحليل التدفقات الأيضية غير المستقر نظائريًا (INST-MFA) مفيدًا في استنتاج التدفقات، لا سيما للأنظمة ذات ديناميكيات الوسم البطيئة. على غرار تحليل التدفقات الأيضية المستقر نظائريًا، تتطلب هذه الطريقة موازنات الكتلة والنظائر لتحديد القياس الكمي وانتقالات الذرات في الشبكة الأيضية. ولكن على عكس طرق تحليل التدفقات الأيضية التقليدية، يتطلب تحليل التدفقات الأيضية غير المستقر نظائريًا تطبيق المعادلات التفاضلية العادية لدراسة كيفية تغير أنماط الوسم النظائري للمستقلبات بمرور الوقت؛ ويمكن إنجاز هذه الدراسة عن طريق قياس تغير أنماط الوسم النظائري عبر نقاط زمنية مختلفة لإدخالها في تحليل التدفقات الأيضية غير المستقر نظائريًا. ^{[ 16 ]} وبالتالي، يُعد تحليل التدفقات الأيضية غير المستقر نظائريًا طريقة فعالة لتوضيح تدفقات الأنظمة ذات الاختناقات في المسارات الأيضية والكشف عن الأنماط الظاهرية الأيضية للكائنات ذاتية التغذية . ^{[ 16 ]} على الرغم من أن متطلبات الحوسبة المكثفة لـ INST-MFA كانت تعيق استخدامها على نطاق واسع في السابق، إلا أن أدوات البرمجيات المطورة حديثًا قد حسّنت من كفاءة INST-MFA لتقليل وقت الحوسبة والمتطلبات. ^{[ 17 ]}

يُعد تحليل التدفق الأيضي القائم على الديناميكا الحرارية (TMFA) ^{[ 18 ]} نوعًا متخصصًا من تحليل التدفق الأيضي، يستخدم قيودًا ديناميكية حرارية خطية بالإضافة إلى قيود توازن الكتلة لتوليد تدفقات وملامح نشاط الأيضات الممكنة ديناميكيًا حراريًا. يأخذ TMFA في الاعتبار فقط المسارات والتدفقات الممكنة باستخدام تغير طاقة جيبس ​​الحرة للتفاعلات ونشاط الأيضات التي تُشكل جزءًا من النموذج. ومن خلال حساب طاقات جيبس ​​الحرة للتفاعلات الأيضية، وبالتالي ملاءمتها الديناميكية الحرارية، يُسهّل TMFA تحديد تفاعلات الاختناق المحددة للمسار، والتي قد تكون مرشحة مثالية لتنظيم المسار.

استُخدم تحليل التدفق الأيضي لتوجيه جهود التوسع في تخمير الوقود الحيوي. ^{[ 23 ]} من خلال القياس المباشر لمعدلات التفاعلات الإنزيمية، يُمكن لتحليل التدفق الأيضي رصد ديناميكيات سلوك الخلايا والأنماط الأيضية في المفاعلات الحيوية أثناء عمليات التخمير واسعة النطاق. ^{[ 23 ]} على سبيل المثال، استُخدمت نماذج تحليل التدفق الأيضي لتحسين تحويل الزيلوز إلى إيثانول في خميرة تخمير الزيلوز، وذلك باستخدام توزيعات التدفق المحسوبة لتحديد القدرات النظرية القصوى للخميرة المختارة لإنتاج الإيثانول. ^{[ 24 ]}

يُحدد تحديد الإنزيمات المُسببة للاختناق التفاعلات المُحددة لمعدل التفاعلات التي تحد من إنتاجية المسار الحيوي. علاوة على ذلك، يُمكن لتحليل التدفقات المتعددة (MFA) أن يُساعد في التنبؤ بالأنماط الظاهرية غير المتوقعة للسلالات المُعدلة وراثيًا من خلال بناء فهم أساسي لكيفية تنظيم التدفقات في الخلايا المُعدلة. ^{[ 25 ]} على سبيل المثال، من خلال حساب طاقات جيبس ​​الحرة للتفاعلات في استقلاب الإشريكية القولونية ، سهّل تحليل التدفقات المتعددة الديناميكية الحرارية (TMFA) تحديد تفاعل مُسبب للاختناق الديناميكي الحراري في نموذج على نطاق الجينوم للإشريكية القولونية. ^{[ 18 ]}