الوسم النظائري

يُعد تحليل التدفق الأيضي (MFA) باستخدام الوسم بالنظائر المستقرة أداةً مهمةً لشرح تدفق عناصر معينة عبر المسارات والتفاعلات الأيضية داخل الخلية . تُغذى الخلية بنظير موسوم، ثم تُترك لتنمو مستخدمةً هذا النظير. ولتحليل التدفق الأيضي الثابت، يجب أن تصل الخلية إلى حالة استقرار (حيث تبقى النظائر الداخلة والخارجة من الخلية ثابتة مع مرور الوقت) أو حالة شبه استقرار (حيث يتم الوصول إلى حالة الاستقرار لفترة زمنية محددة). ^{[ 7 ]} يُحدد نمط النظائر للناتج الأيضي . يوفر نمط النظائر الناتج معلومات قيّمة، يمكن استخدامها لتحديد مقدار التدفق ، أي معدل تحويل المواد المتفاعلة إلى نواتج ، خلال كل تفاعل. ^{[ 8 ]}

يوضح الشكل إمكانية استخدام علامات مختلفة لتحديد التدفق خلال تفاعل معين. لنفترض أن المستقلب الأصلي، وهو مركب ثلاثي الكربون، لديه القدرة على الانقسام إلى مستقلبين ثنائي الكربون وأحادي الكربون في تفاعل واحد ثم إعادة الاتحاد، أو البقاء مستقلبًا ثلاثي الكربون. إذا تم تزويد التفاعل بنظيرين من المستقلب بنسبة متساوية، أحدهما موسوم بالكامل (الدوائر الزرقاء)، والمعروف باسم المستقلب الموسوم بشكل موحد، والآخر غير موسوم تمامًا (الدوائر البيضاء). لا يُظهر المسار على الجانب الأيسر من الرسم التخطيطي أي تغيير في المستقلبات، بينما يُظهر الجانب الأيمن الانقسام وإعادة الاتحاد. كما هو موضح، إذا سلك المستقلب المسار على الجانب الأيسر فقط، فإنه يبقى بنسبة 50-50 بين المستقلب الموسوم بشكل موحد والمستقلب غير الموسوم. إذا سلك المستقلب المسار على الجانب الأيمن فقط، فقد تظهر أنماط وسم جديدة، جميعها بنسب متساوية. يمكن أن تحدث نسب أخرى اعتمادًا على كمية المستقلب الأصلي التي تسلك الجانب الأيسر من المسار مقابل الجانب الأيمن منه. تُعرض هنا النسب لحالةٍ يتواجد فيها نصف المستقلبات على الجانب الأيسر والنصف الآخر على الجانب الأيمن، ولكن قد تحدث نسب أخرى. ^{[ 9 ]} تمثل هذه الأنماط من الذرات الموسومة وغير الموسومة في مركب واحد نظائر متماثلة . ومن خلال قياس توزيع النظائر المتماثلة للمستقلبات الموسومة بشكل مختلف، يمكن تحديد التدفق عبر كل تفاعل. ^{[ 10 ]}

تجمع تقنية تحليل التدفقات المتعددة (MFA) البيانات المُستقاة من وسم النظائر مع قياس العناصر لكل تفاعل، والقيود ، وإجراءات التحسين، لرسم خريطة التدفق. توفر التفاعلات العكوسة القيود الديناميكية الحرارية اللازمة لحساب التدفقات. يتم إنشاء مصفوفة تحتوي على قياس العناصر للتفاعلات. تُقدّر التدفقات داخل الخلايا باستخدام طريقة تكرارية تُدخل فيها التدفقات المُحاكاة في النموذج القياسي. تُعرض التدفقات المُحاكاة في خريطة تدفق تُظهر معدل تحويل المواد المتفاعلة إلى نواتج لكل تفاعل. ^{[ 8 ]} في معظم خرائط التدفق، كلما كان السهم أكثر سمكًا، زادت قيمة تدفق التفاعل. ^{[ 11 ]}

يمكن استخدام أي تقنية لقياس الفرق بين النظائر . وقد طُوّرت الطريقتان الرئيسيتان، الرنين المغناطيسي النووي (NMR) وقياس الطيف الكتلي (MS)، لقياس النظائر الكتلية في وسم النظائر المستقرة.

كان الرنين النووي المغناطيسي للبروتون أول تقنية استُخدمت في تجارب الوسم بالكربون ^-13 . باستخدام هذه الطريقة، يُمكن رصد كل موقع كربون مُبرتَن داخل مجموعة مُستقلبات مُحددة بشكل مُنفصل عن المواقع الأخرى. ^{[ 12 ]} وهذا يُتيح معرفة النسبة المئوية للنظائر الموسومة في ذلك الموقع المُحدد. يكمن قيد الرنين النووي المغناطيسي للبروتون في أنه إذا كان هناك n ذرة كربون في مُستقلب، فلا يُمكن أن يكون هناك أكثر من n قيمة إثراء موضعي مُختلفة، وهو ما يُمثل جزءًا صغيرًا فقط من إجمالي معلومات النظائر. على الرغم من أن استخدام وسم الرنين النووي المغناطيسي للبروتون محدود، إلا أن تجارب الرنين النووي المغناطيسي للبروتون النقي أسهل بكثير في التقييم من التجارب التي تحتوي على معلومات نظائرية أكثر.

بالإضافة إلى تقنية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون ، فإن استخدام تقنيات الرنين النووي المغناطيسي للكربون ^-13 يتيح رؤية أكثر تفصيلًا لتوزيع النظائر. تُنتج ذرة الكربون الموسومة إشارات انقسام فائقة الدقة مختلفة تبعًا لحالة وسم ذرات الكربون المجاورة لها مباشرةً في الجزيء. ^{[ 12 ]} تظهر قمة مفردة إذا لم تكن ذرات الكربون المجاورة موسومة. وتظهر قمة مزدوجة إذا كانت ذرة كربون مجاورة واحدة فقط موسومة. يعتمد حجم انقسام القمة المزدوجة على المجموعة الوظيفية لذرة الكربون المجاورة. إذا كانت ذرتا كربون متجاورتان موسومتين، فقد يتحول انقسام القمة المزدوجة إلى قمة ثلاثية إذا كانت قيم انقسام القمم المزدوجة متساوية.

تكمن عيوب استخدام تقنيات الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لتحليل التدفقات الأيضية في اختلافها عن تطبيقات الرنين المغناطيسي النووي الأخرى، نظرًا لتخصصها الدقيق. فقد لا يتوفر مطياف الرنين المغناطيسي النووي لجميع فرق البحث. ويتطلب تحسين معايير قياس الرنين المغناطيسي النووي والتحليل الدقيق لبنية القمم وجود متخصص ماهر في هذا المجال. كما قد تتطلب بعض المستقلبات إجراءات قياس متخصصة للحصول على بيانات إضافية عن النظائر. إضافةً إلى ذلك، يلزم استخدام برامج متخصصة لتحديد المساحة الدقيقة للقمم، فضلًا عن تحديد تفكك القمم المتداخلة (المفردة، والثنائية، والثلاثية).

على عكس الرنين المغناطيسي النووي، يُعدّ قياس الطيف الكتلي (MS) طريقة أخرى أكثر ملاءمة وحساسية لتجارب تحليل التدفق الأيضي. تتوفر أجهزة قياس الطيف الكتلي بأنواع مختلفة. وبخلاف الرنين المغناطيسي النووي ثنائي الأبعاد ( 2D-NMR )، تعمل أجهزة قياس الطيف الكتلي مباشرةً مع المُحلَّل المائي . ^{[ 12 ]}

في تقنية كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة ( GC-MS )، يُربط مطياف الكتلة بجهاز كروماتوغرافيا الغاز لفصل مركبات المُحلَّل المائي. ثم تُؤيَّن المركبات الخارجة من عمود كروماتوغرافيا الغاز وتُجزَّأ في الوقت نفسه. وتكمن فائدة استخدام GC-MS في أنها لا تقيس فقط النظائر الكتلية للأيون الجزيئي، بل تقيس أيضًا طيف النظائر الكتلية للعديد من الشظايا، مما يزيد بشكل ملحوظ من المعلومات المقاسة.

في تقنية كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة ( LC-MS )، يُستبدل جهاز كروماتوغرافيا الغاز (GC) بجهاز كروماتوغرافيا السائل. ^{[ 13 ]} ويكمن الاختلاف الرئيسي في عدم الحاجة إلى الاشتقاق الكيميائي. مع ذلك، فإن تطبيقات LC-MS في تحليل تدفق المواد (MFA) نادرة.

في كل حالة، تقسم أجهزة مطياف الكتلة توزيع النظائر المحدد حسب وزنه الجزيئي. تُجمع جميع نظائر مستقلب معين التي تحتوي على نفس عدد ذرات الكربون الموسومة في إشارة قمة واحدة. ولأن كل نظير يُساهم في قمة واحدة فقط في طيف مطياف الكتلة، يُمكن حساب النسبة المئوية لكل قمة، مما يُعطي نسبة كتلة النظائر. ^{[ 12 ]} بالنسبة لمستقلب يحتوي على n ذرة كربون، يتم إنتاج n+1 قياسًا. بعد المعايرة، يتبقى n كمية من نظائر الكتلة ذات دلالة إحصائية. ^{[ 12 ]}

من عيوب استخدام تقنيات مطياف الكتلة أنه في كروماتوغرافيا الغاز، يجب تحضير العينة عن طريق الاشتقاق الكيميائي للحصول على جزيئات مشحونة. توجد مركبات عديدة تُستخدم لاشتقاق العينات، منها ثنائي ميثيل أسيتال ثنائي ميثيل فورماميد (DMFDMA) ^{[ 14 ]} و N- ( ثالثي بوتيل ثنائي ميثيل سيليل)- N- ميثيل ثلاثي فلورو أسيتاميد ( MTBSTFA) ^{[ 15 ]} ، وهما مثالان على مركبات استُخدمت لاشتقاق الأحماض الأمينية.

بالإضافة إلى ذلك، تؤثر التأثيرات النظائرية القوية الملحوظة على زمن الاحتفاظ بالنظائر الموسومة بشكل مختلف في عمود كروماتوغرافيا الغاز. كما يجب منع التحميل الزائد لعمود كروماتوغرافيا الغاز. ^{[ 15 ]}

أخيرًا، يؤدي التواجد الطبيعي لذرات أخرى غير الكربون إلى اضطراب في طيف النظائر الكتلية. على سبيل المثال، قد توجد كل ذرة أكسجين في الجزيء على شكل نظير الأكسجين ^-17 ونظير الأكسجين ^-18 . ومن التأثيرات الأكثر أهمية للتواجد الطبيعي للنظائر تأثير السيليكون، الذي يتميز بوفرة طبيعية لنظيري السيليكون ^-29 والسيليكون ^-30 . يُستخدم السيليكون في عوامل الاشتقاق لتقنيات مطياف الكتلة. ^{[ 12 ]}

استُخدمت النظائر المستقرة لأول مرة في ستينيات القرن الماضي لدراسة التغذية المعدنية واستقلاب المعادن لدى الإنسان. ^{[ 17 ]} ورغم استخدام النظائر المشعة في أبحاث التغذية البشرية لعقودٍ عديدة قبل ذلك، إلا أن النظائر المستقرة تُعدّ خيارًا أكثر أمانًا، لا سيما في الحالات التي يُثار حولها قلقٌ كبيرٌ بشأن التعرّض للإشعاع، كالحوامل والمرضعات والأطفال. ومن المزايا الأخرى للنظائر المستقرة القدرة على دراسة العناصر التي لا تملك نظائر مشعة مناسبة، ودراسة سلوك النظائر المستقرة على المدى الطويل. ^{[ 18 ] [ 19 ]} وهكذا، أصبح استخدام النظائر المستقرة شائعًا مع تزايد توافر المواد المُخصّبة بالنظائر وأجهزة قياس الطيف الكتلي غير العضوية. إلا أن استخدام النظائر المستقرة بدلًا من النظائر المشعة له عدة عيوب: فهو يتطلب كميات أكبر من النظائر المستقرة، مما قد يُؤثر على المعادن الموجودة طبيعيًا؛ كما أن تحضير العينات التحليلية أكثر تعقيدًا، وأجهزة قياس الطيف الكتلي أكثر تكلفة؛ ولا يُمكن قياس وجود النظائر المستقرة في الجسم ككل أو في أنسجة مُحددة خارجيًا. ^{[ 20 ]} ومع ذلك، فقد سادت المزايا مما جعل النظائر المستقرة هي المعيار في الدراسات البشرية.

معظم المعادن الأساسية لصحة الإنسان، والتي تحظى باهتمام خاص من باحثي التغذية ، لها نظائر مستقرة، بعضها مناسب تمامًا كمتتبعات بيولوجية نظرًا لندرتها في الطبيعة. ^{[ 18 ] [ 20 ]} ومن بين المعادن الأساسية التي لها نظائر مستقرة ، والتي طُبقت عليها طرق التتبع النظائري، الحديد والزنك والكالسيوم والنحاس والمغنيسيوم والسيلينيوم والموليبدينوم . وقد خضع الحديد والزنك والكالسيوم على وجه الخصوص لدراسات مستفيضة .

تشمل جوانب التغذية المعدنية/استقلاب المعادن التي تُدرس الامتصاص (من الجهاز الهضمي إلى الجسم)، والتوزيع، والتخزين، والإخراج، وحركية هذه العمليات. تُعطى المواد المشعة للمشاركين عن طريق الفم (مع الطعام أو بدونه، أو مع مكملات معدنية) و/أو عن طريق الوريد. ثم يُقاس إثراء النظائر في بلازما الدم، وكريات الدم الحمراء، والبول، و/أو البراز. ^{[ 21 ] [ 22 ]} كما قُيس الإثراء في حليب الثدي ^{[ 23 ]} ومحتويات الأمعاء. يختلف تصميم تجربة التتبع أحيانًا بين المعادن نظرًا لاختلاف استقلابها. على سبيل المثال، يُحدد امتصاص الحديد عادةً من خلال دمج المادة المشعة في كريات الدم الحمراء، بينما يُقاس امتصاص الزنك أو الكالسيوم من خلال ظهور المادة المشعة في البلازما، أو البول، أو البراز. ^{[ 24 ] [ 25 ]} إن إعطاء العديد من المتتبعات النظائرية في دراسة واحدة أمر شائع، مما يسمح باستخدام طرق قياس أكثر موثوقية وإجراء تحقيقات متزامنة في جوانب متعددة من عملية التمثيل الغذائي.

يُعد قياس امتصاص المعادن من النظام الغذائي، والذي يُعرف غالبًا بالتوافر الحيوي ، التطبيق الأكثر شيوعًا لأساليب التتبع النظائري في أبحاث التغذية. ومن بين أهداف هذه الدراسات، دراسة كيفية تأثر الامتصاص بنوع الغذاء (مثل المصادر النباتية مقابل الحيوانية، وحليب الأم مقابل الحليب الصناعي)، ومكونات النظام الغذائي الأخرى (مثل الفيتات )، والأمراض والاضطرابات الأيضية (مثل خلل وظائف الأمعاء الناتج عن عوامل بيئية )، والدورة التناسلية، وكمية المعادن في النظام الغذائي، ونقص المعادن المزمن ، وعمر الشخص، وآليات التوازن الداخلي. وعندما تتوفر نتائج هذه الدراسات لمعدن معين، فإنها تُشكل أساسًا لتقدير الاحتياجات الفسيولوجية والغذائية للإنسان من هذا المعدن. ^{[ 26 ] [ 27 ]}

عند إضافة مادة مشعة إلى الطعام بهدف مراقبة امتصاص المعادن واستقلابها، قد تكون هذه المادة على شكل علامة داخلية أو خارجية. ^{[ 28 ] [ 29 ]} العلامة الداخلية هي نظير يُضاف إلى الطعام أثناء إنتاجه، مما يُثري محتواه المعدني الطبيعي، بينما تشير العلامة الخارجية إلى إضافة نظير مشع إلى الطعام أثناء الدراسة. ونظرًا لأنها طريقة مكلفة وتستغرق وقتًا طويلًا، فإن العلامة الداخلية لا تُستخدم بشكل روتيني. وقد أظهرت الدراسات التي قارنت قياسات الامتصاص باستخدام العلامة الداخلية والخارجية لأطعمة مختلفة توافقًا جيدًا بين الطريقتين، مما يدعم فرضية أن المعادن الخارجية والطبيعية تُعالج بطريقة مماثلة في الجهاز الهضمي البشري.

يُقاس الإثراء من خلال قياس نسب النظائر ، أي نسبة النظير المُتتبَّع إلى نظير مرجعي، باستخدام مطياف الكتلة. وقد اعتمد باحثون مختلفون تعريفات وحسابات متعددة للإثراء. ^{[ 30 ]} وتزداد حسابات الإثراء تعقيدًا عند استخدام عدة نظائر مُتتبَّعة في آنٍ واحد. ولأن مستحضرات النظائر المُثرية لا تكون نقية نظائريًا أبدًا، أي أنها تحتوي على جميع نظائر العنصر بوفرة غير طبيعية، فإن حسابات إثراء النظائر المُتتبَّعة المتعددة يجب أن تأخذ في الحسبان تأثير وجود النظائر المُتتبَّعة الأخرى على كل نسبة نظائر. ^{[ 30 ]}

نظراً لانتشار نقص المعادن وتأثيره البالغ على صحة الإنسان ورفاهيته في البلدان الفقيرة بالموارد، نشرت الوكالة الدولية للطاقة الذرية مؤخراً وصفاً تفصيلياً وشاملاً لأساليب النظائر المستقرة لتسهيل نشر هذه المعرفة بين الباحثين خارج المراكز الأكاديمية الغربية. ^{[ 24 ] [ 31 ]}

في علم البروتينات ، وهو دراسة المجموعة الكاملة من البروتينات التي يُنتجها الجينوم ، يُمكن أن يشمل تحديد المؤشرات الحيوية للأمراض استخدام تقنية الوسم النظائري المستقر للأحماض الأمينية في مزارع الخلايا (SILAC)، والتي تُوفر أشكالًا موسومة نظائريًا من الأحماض الأمينية تُستخدم لتقدير مستويات البروتين. ^{[ 32 ]} في البروتينات المُعاد تركيبها، تُنتج البروتينات المُعدلة بكميات كبيرة، ويُعد الوسم النظائري أداةً لاختبار البروتينات ذات الصلة. كانت الطريقة المُستخدمة سابقًا تعتمد على إثراء النوى بشكل انتقائي بالكربون ^-13 أو النيتروجين ^-15 أو استنفاد الهيدروجين ^-1 منها. يُنتج البروتين المُعاد تركيبه في بكتيريا الإشريكية القولونية في وسط يحتوي على كلوريد الأمونيوم المُوسوم بالنيتروجين ^-15 كمصدر للنيتروجين. ^{[ 33 ] بعد ذلك، تُنقى البروتينات المُوسومة بالنيتروجين -15} الناتجة عن طريق تقارب المعادن المُثبتة، ويتم تقدير نسبتها المئوية. لزيادة إنتاج البروتينات الموسومة وتقليل تكلفة الأوساط الموسومة بالنظائر، يُستخدم إجراء بديل يعتمد أساسًا على زيادة كتلة الخلايا باستخدام أوساط غير موسومة قبل إضافتها إلى كمية ضئيلة من الأوساط الموسومة. ^{[ 34 ]} ومن التطبيقات الأخرى للوسم بالنظائر قياس تخليق الحمض النووي، أي تكاثر الخلايا في المختبر . ويُستخدم وسم الثيميدين-H3 _{لمقارنة} نمط التخليق (أو التسلسل) في الخلايا. ^{[ 35 ]}

تُستخدم المؤشرات النظائرية لدراسة العمليات في الأنظمة الطبيعية، وخاصة البيئات الأرضية والمائية. في علم التربة، تُستخدم مؤشرات النيتروجين ^{-15 على نطاق واسع لدراسة دورة النيتروجين، بينما يُستخدم الكربون -13} والكربون ^-14 ، وهما نظائر مستقرة ومشعة للكربون على التوالي، لدراسة تحول المركبات العضوية وتثبيت _ثاني أكسيد الكربون بواسطة الكائنات ذاتية التغذية . على سبيل المثال، استخدم مارش وآخرون (2005) اليوريا الموسومة بنظيرين (النيتروجين ^-15 والكربون ^-14 ) لإثبات استخدام مؤكسدات الأمونيا لهذا المركب كمصدر للطاقة (أكسدة الأمونيا) ومصدر للكربون (تثبيت الكربون الكيميائي ذاتي التغذية). ^{[ 36 ]} كما يُستخدم الماء المُدَوتَر لتتبع مصير الماء وأعماره في الأشجار ^{[ 37 ]} أو في النظام البيئي. ^{[ 38 ]}

تُستخدم المواد المتتبعة على نطاق واسع في علم المحيطات لدراسة مجموعة واسعة من العمليات. وتكون النظائر المستخدمة عادةً نظائر طبيعية ذات مصادر معروفة ومعدلات تكوين وتحلل محددة. ومع ذلك، يمكن أيضًا استخدام النظائر المصنعة بنجاح كبير. يقيس الباحثون نسب النظائر في مواقع وأوقات مختلفة لاستنتاج معلومات حول العمليات الفيزيائية للمحيط.