تسلسل البولوني

📅 آخر تحديث: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 1 صور
الموسوعة الحرة

تسلسل بولوني هو تقنية تسلسل متعددة غير مكلفة ولكنها عالية الدقة ، تُستخدم لقراءة ملايين تسلسلات الحمض النووي المثبتة بالتوازي. طُوّرت هذه التقنية لأول مرة من قِبل فريق الدكتور جورج تشيرش في كلية الطب بجامعة هارفارد . على عكس تقنيات التسلسل الأخرى، تُعد تقنية تسلسل بولوني منصة مفتوحة المصدر، حيث تتوفر برامج وبروتوكولات مفتوحة المصدر قابلة للتنزيل مجانًا. كما يُمكن إعداد أجهزة هذه التقنية بسهولة باستخدام مجهر التألق الضوئي ونظام خلية التدفق/الموائع المُتحكم به بواسطة الحاسوب. يُجرى تسلسل بولوني عادةً على مكتبة علامات مزدوجة النهاية ، حيث يبلغ طول كل جزيء من قالب الحمض النووي 135 زوجًا قاعديًا، مع وجود علامتين جينوميتين مزدوجتين بطول 17-18 زوجًا قاعديًا، تفصل بينهما تسلسلات مشتركة. يبلغ طول القراءة الحالي لهذه التقنية 26 قاعدة لكل مُضخّم و13 قاعدة لكل علامة، تاركًا فجوة من 4-5 قواعد في كل علامة.

سير العمل

إجراء مصور لتسلسل بولوني

يمكن تقسيم بروتوكول تسلسل بولوني إلى ثلاثة أجزاء رئيسية، وهي بناء مكتبة العلامات الطرفية المزدوجة، وتضخيم القالب، وتسلسل الحمض النووي .

بناء مكتبة علامات النهاية المزدوجة

تبدأ هذه الطريقة بتقطيع الحمض النووي الجينومي المختبر عشوائيًا إلى جزيئات متجانسة الحجم. ثم تُخضع جزيئات الحمض النووي المقطعة لمعالجة إصلاح الأطراف وإضافة ذيل الأدينين. تعمل معالجة إصلاح الأطراف على تحويل أي أطراف تالفة أو غير متوافقة إلى حمض نووي مُفسفر عند الطرف 5' وذو نهايات غير لاصقة، مما يُتيح ربط الأطراف اللاصقة مباشرةً، بينما تُضيف معالجة إضافة ذيل الأدينين قاعدة أدينين إلى الطرف 3' من الحمض النووي المقطع. يتم اختيار جزيئات الحمض النووي التي يبلغ طولها 1 كيلوبايت عن طريق تحميلها على هلام بولي أكريلاميد TBE بنسبة 6%. في الخطوة التالية، تُحوّل جزيئات الحمض النووي إلى جزيئات دائرية باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعي بطول 30 زوجًا قاعديًا وذيول ثايمين (T30)، والذي يحتوي على موقعي تعرف MmeI مواجهين للخارج، ثم يخضع الحمض النووي الدائري الناتج لعملية تضاعف الدائرة المتدحرجة . تُهضم جزيئات الحمض النووي الدائري المُضخّمة باستخدام إنزيم MmeI (إنزيم القطع من النوع IIs) الذي يقطع على مسافة من موقع التعرف الخاص به، مُحررًا قطعة T30 المُحاطة بعلامات بطول 17-18 زوجًا قاعديًا (طولها ≈70 زوجًا قاعديًا). يجب إصلاح نهايات جزيئات العلامات المزدوجة قبل ربط بادئات تفاعل البلمرة المتسلسل المستحلب (ePCR) (FDV2 وRDV2) بنهايتيها. تُختار جزيئات المكتبة الناتجة بطول 135 زوجًا قاعديًا حسب الحجم وتُترجم باستخدام تقنية الترجمة بالقطع . أخيرًا، تُضخّم جزيئات مكتبة العلامات المزدوجة بطول 135 زوجًا قاعديًا باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لزيادة كمية مادة المكتبة والتخلص من نواتج الربط الزائدة في خطوة واحدة. يتكون قالب الحمض النووي الناتج من تسلسل FDV بطول 44 زوجًا قاعديًا، وعلامة قريبة بطول 17-18 زوجًا قاعديًا، وتسلسل T30، وعلامة بعيدة بطول 17-18 زوجًا قاعديًا، وتسلسل RDV بطول 25 زوجًا قاعديًا.

تضخيم القالب

تفاعل البوليميراز المتسلسل المستحلب

تُحمّل حبيبات أحادية الحجم، مغناطيسية، ومغطاة بالستربتافيدين ، مسبقًا ببادئين أماميين من البيوتين. يتميز الستربتافيدين بألفة قوية جدًا للبيوتين ، مما يضمن ارتباط البادئ الأمامي بقوة بسطح الحبيبات. بعد ذلك، يُحضّر وسط مائي باستخدام الحبيبات المحملة مسبقًا، ومزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والبادئين الأمامي والعكسي، ومكتبة علامات النهاية المزدوجة. يُخلط هذا المزيج مع وسط زيتي ويُرجّ جيدًا لتكوين مستحلب. من الناحية المثالية، تحتوي كل قطرة ماء في المستحلب الزيتي على حبة واحدة وجزيء واحد من الحمض النووي القالب، مما يسمح بإجراء ملايين عمليات التضخيم غير المتفاعلة ضمن حجم ملليلتر واحد عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

كسر المستحلب

بعد التضخيم، تُفكك المستحلبات الناتجة عن الخطوة السابقة باستخدام الإيزوبروبانول ومحلول منظم منظف (10 ملي مولار تريس، درجة الحموضة 7.5، 1 ملي مولار إيدتا، درجة الحموضة 8.0، 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1% (حجم/حجم) تريتون X-100، 1% (وزن/حجم) كبريتات دوديسيل الصوديوم)، ثم تُجرى سلسلة من عمليات الخلط، والطرد المركزي، والفصل المغناطيسي. ينتج عن ذلك محلول معلق من حبيبات فارغة، وحبيبات مستنسخة، وحبيبات غير مستنسخة، تنشأ من قطرات مستحلب تحتوي في البداية على صفر، أو جزيء واحد، أو عدة جزيئات من قالب الحمض النووي، على التوالي. يمكن إثراء الحبيبات المُضخمة في الخطوة التالية.

خرز للإثراء

يتم إثراء الخرزات المُضخّمة عن طريق تهجينها مع خرزات بوليسترين غير مغناطيسية أكبر حجمًا وأقل كثافة، مُحمّلة مسبقًا بأوليغونوكليوتيدات التقاط مُؤشّرة بالبيوتين (تسلسل الحمض النووي المُكمّل لتسلسل مُضخّم ePCR). ثم يُفصل المزيج بالطرد المركزي لفصل مُركّب الخرزات المُضخّمة وخرزات الالتقاط عن الخرزات غير المُضخّمة. يتميز مُركّب الخرزات المُضخّمة وخرزات الالتقاط بكثافة أقل، لذا يبقى في السائل الطافي، بينما تُشكّل الخرزات غير المُضخّمة راسبًا. يُستخلص السائل الطافي ويُعالج بهيدروكسيد الصوديوم (NaOH) لتفكيك المُركّب. تُفصل الخرزات المُضخّمة البارامغناطيسية عن خرزات الالتقاط غير المغناطيسية باستخدام الفصل المغناطيسي. يُمكن لهذا البروتوكول إثراء الخرزات المُضخّمة خمس مرات.

تغطية الخرز

تتمثل وظيفة التغطية بالخرز في ربط نيوكليوتيد "تغطية" بالنهاية 3' لكل من بادئات ePCR الأمامية غير الممتدة وقطعة RDV من الحمض النووي القالب. وتتكون التغطية المستخدمة من مجموعة أمينية تمنع المجسات الفلورية من الارتباط بهذه النهايات، وفي الوقت نفسه، تُسهّل عملية ربط الحمض النووي القالب لاحقًا بغطاء خلية التدفق المُغطى بالأمينوسيلان.

ترتيب غطاء الشريحة

أولًا، تُغسل الشرائح الزجاجية وتُعالج بالأمينوسيلان، مما يُتيح ربط الحمض النووي القالب بها بروابط تساهمية ويزيل أي تلوث فلوري. تُخلط الخرزات المُضخّمة والمُخصبة مع الأكريلاميد وتُسكب في قالب ضحل مُشكّل من شريحة مجهرية مُغطاة بالتفلون . تُوضع الشريحة الزجاجية المُعالجة بالأمينوسيلان مباشرةً فوق هلام الأكريلاميد وتُترك لتتبلمر لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، تُقلب الشريحة/الغطاء الزجاجي وتُزال الشريحة المجهرية من الهلام. سترتبط الشرائح الزجاجية المُعالجة بالأمينوسيلان بالهلام بروابط تساهمية، بينما يُسهّل التفلون الموجود على سطح الشريحة المجهرية إزالتها من هلام الأكريلاميد. ثم تُربط الشرائح الزجاجية بجسم خلية التدفق وتُزال أي خرزات غير مُرتبطة.

تسلسل الحمض النووي

تعتمد الكيمياء الحيوية لتسلسل بولوني بشكل أساسي على القدرات التمييزية لليغازات والبوليميرازات. أولًا، تُمرر سلسلة من البادئات المرجعية عبر الخلايا وتتهجن مع تسلسلات النيوكليوتيدات الاصطناعية عند الطرف 3' أو 5' المباشر لعلامات الحمض النووي الجينومي القريبة أو البعيدة التي يتراوح طولها بين 17 و18 زوجًا قاعديًا. بعد ذلك، يُجرى تفاعل ربط إنزيمي للبادئ المرجعي مع مجموعة من النيوكليوتيدات التساعية المتغيرة الموسومة بأصباغ فلورية. النيوكليوتيدات التساعية الموسومة بشكل تفاضلي:

 5' Cy5‐NNNNNNNNT 5' Cy3‐NNNNNNNNA 5' TexasRed‐NNNNNNNNC 5' 6FAM‐NNNNNNNNG

تتحد النيوكليوتيدات التساعية الموسومة بالفلوروفور بنجاح متفاوت مع تسلسلات الوسم وفقًا لاستراتيجية مشابهة لتلك الخاصة بالبادئات المتغيرة ، ولكن بدلًا من خضوعها للبوليميراز، تُربط النيوكليوتيدات التساعية بشكل انتقائي بالحمض النووي المجاور - بادئ التثبيت. يوفر تثبيت جزيء الفلوروفور إشارة فلورية تُشير إلى وجود قاعدة A أو C أو G أو T في موضع الاستعلام على وسم الحمض النووي الجينومي. بعد التصوير رباعي الألوان، تُزال معقدات بادئ التثبيت/النيوكليوتيد التساعي، وتبدأ دورة جديدة باستبدال بادئ التثبيت. يُضاف مزيج جديد من النيوكليوتيدات التساعية الموسومة بالفلوروفور، حيث يُزاح موضع الاستعلام قاعدة واحدة إلى الأمام داخل وسم الحمض النووي الجينومي.

 5' Cy5‐NNNNNNNTN 5' Cy3‐NNNNNNNAN 5' TexasRed‐NNNNNNNCN 5' 6FAM‐NNNNNNNGN

بهذه الطريقة، يمكن الاستعلام عن سبع قواعد من اتجاه 5' إلى 3' وست قواعد من الطرف 3'. والنتيجة النهائية هي طول قراءة يبلغ 26 قاعدة لكل سلسلة (13 قاعدة من كل علامة من العلامات المزدوجة) مع وجود فجوة من 4 إلى 5 قواعد في منتصف كل علامة.

التحليل والبرمجيات

تُنتج عملية تسلسل البولوني ملايين القراءات (26 قراءة) في كل دورة، وتتطلب هذه المعلومات تطبيعًا وتحويلًا إلى تسلسل. يمكن القيام بذلك باستخدام البرنامج الذي طوره مختبر تشيرش. جميع البرامج مجانية ويمكن تحميلها من الموقع الإلكتروني. [ 1 ]

الآلات الموسيقية

يمكن إعداد جهاز التسلسل المستخدم في هذه التقنية باستخدام مجهر فلوري متوفر بكثرة ووحدة تحكم حاسوبية في التدفق. بلغت تكلفة الأجهزة المطلوبة حوالي 130,000 دولار أمريكي في عام 2005. وفي عام 2009، طُوِّر جهاز تسلسل بولوني مخصص، يُدعى بولوناتور ، وباعته شركة دوفر بسعر 170,000 دولار أمريكي . [ 2 ] [ 3 ] يتميز هذا الجهاز ببرمجيات ومواد وبروتوكولات مفتوحة المصدر، وكان مُصمماً للاستخدام في مشروع الجينوم الشخصي . [ 4 ]

نقاط القوة والضعف

تتيح تقنية تسلسل البولوني إنتاجية عالية ودقة توافقية عالية في تسلسل الحمض النووي باستخدام جهاز متوفر بكثرة ومنخفض التكلفة. كما أنها تقنية مرنة للغاية تُمكّن من تطبيقات متنوعة، تشمل إعادة تسلسل الكروموسوم الاصطناعي البكتيري ( BAC ) وإعادة تسلسل الجينوم البكتيري، بالإضافة إلى تسلسل علامات SAGE (التحليل التسلسلي للتعبير الجيني) وتسلسل الباركود. علاوة على ذلك، تُعتبر تقنية تسلسل البولوني نظامًا مفتوحًا يتيح مشاركة جميع مكوناته، بما في ذلك البرامج المطورة والبروتوكولات والكواشف.

مع ذلك، ورغم إمكانية الوصول إلى معدل نقل بيانات خام يصل إلى 786 جيجابت، إلا أن بتًا واحدًا فقط من المعلومات المُجمّعة من أصل 10000 بت يكون مفيدًا. ومن التحديات الأخرى لهذه التقنية عدم انتظام التضخيم النسبي للأهداف الفردية، إذ يُمكن أن يُقلل التضخيم غير المنتظم من كفاءة التسلسل، ويُعتبر العائق الأكبر في هذه التقنية.

تاريخ

يُعدّ تسلسل البولوني تطورًا لتقنية البولوني التي ظهرت في أواخر التسعينيات وأوائل الألفية الثانية. [ 5 ] طُوّرت طرق في عام 2003 لتسلسل البولوني في الموقع باستخدام امتداد القاعدة المفردة، مما أتاح قراءة 5-6 قواعد. [ 6 ] وبحلول عام 2005، جرى تطوير هذه المحاولات المبكرة لتطوير تقنية تسلسل البولوني الحالية. [ 7 ] وقد أسهمت مفاهيم التسلسل المتوازي عالي الكفاءة عن طريق الربط في تسلسل البولوني في إرساء الأساس لتقنيات التسلسل اللاحقة، مثل تسلسل ABI الصلب .

مراجع

  1. ↑ "تسلسل المصادر المفتوحة" . arep.med.harvard.edu . تم الاطلاع عليه بتاريخ 17-09-2017 .
  2. ↑ "بعد مرحلة الوصول المبكر، أصبح برنامج Polonator المُحدَّث جاهزًا للإطلاق بسعر 170 ألف دولار" . GenomeWeb . 2009-05-05 . تم الاطلاع عليه بتاريخ 2017-09-17 .
  3. ↑ "مسؤول يؤكد أن مشروع Polonator في دوفر لم يتأثر بإعادة هيكلة شركة Danaher" . GenomeWeb . 2009-09-08 . تاريخ الاسترجاع: 2017-09-17 .
  4. ↑ "المُستَشَبِّه" . 2015-04-03. مؤرشف من الأصل في 2015-04-03 . تم الاطلاع عليه في 2017-09-17 .
  5. ↑ أديسي، سي.؛ ماتون، جي.؛ أيالا، جي.؛ توركاتي، جي.؛ ميرمود، جيه جيه.؛ ماير، بي.؛ كاواشيما، إي. (15-10-2000). "تضخيم الحمض النووي في الطور الصلب: توصيف ارتباط البادئات وآليات التضخيم" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 28 (20): E87. doi : 10.1093 / nar/28.20.e87 . ISSN 1362-4962 . PMC 110803. PMID 11024189 .   
  6. ↑ شندور، جاي؛ بوريكا، غريغوري جيه؛ ريباس، نيكوس بي؛ لين، شياوشيا؛ مكوتشون، جون بي؛ روزنباوم، أبراهام إم؛ وانغ، مايكل دي؛ تشانغ، كون؛ ميترا، روبي دي. (9 سبتمبر 2005). "التسلسل المتعدد الدقيق لجينوم بكتيري متطور" . مجلة ساينس . 309 (5741): 1728-1732 . Bibcode : 2005Sci...309.1728S . doi : 10.1126/science.1117389 . ISSN 0036-8075 . PMID 16081699. S2CID 11405973 .   
  7. ↑ شندور، جاي؛ بوريكا، غريغوري جيه؛ ريباس، نيكوس بي؛ لين، شياوشيا؛ مكوتشون، جون بي؛ روزنباوم، أبراهام إم؛ وانغ، مايكل دي؛ تشانغ، كون؛ ميترا، روبي دي. (9 سبتمبر 2005). "التسلسل المتعدد الدقيق لجينوم بكتيري متطور" . مجلة ساينس . 309 (5741): 1728-1732 . Bibcode : 2005Sci...309.1728S . doi : 10.1126/science.1117389 . ISSN 0036-8075 . PMID 16081699. S2CID 11405973 .