التسلسل

الموسوعة الحرة

في علم الوراثة والكيمياء الحيوية ، يُقصد بالتسلسل تحديد البنية الأولية (والتي تُسمى أحيانًا خطأً بالتسلسل الأولي) لبوليمر حيوي غير متفرع . ينتج عن التسلسل تمثيل خطي رمزي يُعرف بالتسلسل، والذي يُلخص بإيجاز جزءًا كبيرًا من البنية الذرية للجزيء المُتسلسل.

تسلسل الحمض النووي

تسلسل الحمض النووي هو عملية تحديد ترتيب النيوكليوتيدات في قطعة معينة من الحمض النووي . حتى الآن، أُجريت معظم عمليات تسلسل الحمض النووي باستخدام طريقة إنهاء السلسلة التي طورها فريدريك سانجر . تعتمد هذه التقنية على إنهاء تفاعل تخليق الحمض النووي بشكل انتقائي باستخدام ركائز نيوكليوتيدية مُعدّلة. مع ذلك، تكتسب تقنيات التسلسل الجديدة، مثل التسلسل الناري، حصة متزايدة في سوق التسلسل. يُنتج التسلسل الناري الآن بيانات جينومية أكثر من تلك التي يُنتجها تسلسل سانجر. وقد مكّن التسلسل الناري من إجراء تسلسل سريع للجينوم. يمكن تسلسل الجينومات البكتيرية في دورة واحدة بتغطية عدة مرات باستخدام هذه التقنية. كما استُخدمت هذه التقنية مؤخرًا لتسلسل جينوم جيمس واتسون . [ 1 ]

يحمل تسلسل الحمض النووي (DNA) المعلومات الضرورية لبقاء الكائنات الحية وتكاثرها. لذا، يُعدّ تحديد هذا التسلسل مفيدًا في البحوث الأساسية التي تتناول أسباب وكيفية عيش الكائنات الحية، فضلًا عن تطبيقاته العملية. ونظرًا لأهمية الحمض النووي البالغة للكائنات الحية، فإن معرفة تسلسلاته تُفيد في جميع مجالات البحث البيولوجي تقريبًا. فعلى سبيل المثال، يُمكن استخدامه في الطب لتحديد الأمراض الوراثية وتشخيصها، وربما تطوير علاجات لها. وبالمثل، قد تُفضي البحوث في مسببات الأمراض إلى علاجات للأمراض المعدية. أما التقنية الحيوية، فهي مجالٌ نامٍ، يحمل في طياته إمكانات هائلة لإنتاج العديد من المنتجات والخدمات المفيدة.

منحنى كارلسون مصطلح صاغته مجلة الإيكونوميست [ 2 ] لوصف النظير البيوتكنولوجي لقانون مور ، وهو مُسمى نسبةً إلى مؤلفه روب كارلسون. [ 3 ] تنبأ كارلسون بدقة بأن زمن تضاعف تقنيات تسلسل الحمض النووي (مقاسًا بالتكلفة والأداء) سيكون على الأقل بنفس سرعة قانون مور. [ 4 ] توضح منحنيات كارلسون الانخفاض السريع (في بعض الحالات بشكل فائق الأسي) في التكلفة والزيادة في الأداء لمجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي، وتخليق الحمض النووي ، ومجموعة من الأدوات الفيزيائية والحسابية المستخدمة في التعبير عن البروتينات وتحديد بنيتها.

تسلسل سانجر

جزء من هلام تسلسل موسوم إشعاعيًا

في تسلسل إنهاء السلسلة (تسلسل سانجر)، يبدأ استطالة الحمض النووي عند موقع محدد على قالب الحمض النووي باستخدام بادئ أوليغونوكليوتيدي قصير مكمل للقالب في تلك المنطقة. يُطال هذا البادئ باستخدام بوليميراز الحمض النووي ، وهو إنزيم يضاعف الحمض النووي. يحتوي البادئ وبوليميراز الحمض النووي على قواعد الديوكسي نيوكليوتيدات الأربعة (وحدات بناء الحمض النووي)، بالإضافة إلى تركيز منخفض من نيوكليوتيد إنهاء السلسلة (عادةً ما يكون ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد). تفتقر الديوكسي نيوكليوتيدات إلى مجموعة الهيدروكسيل (OH) في كل من الموضعين 2' و3' لجزيء الريبوز، وبالتالي، بمجرد إدخالها في جزيء الحمض النووي، فإنها تمنع استطالته. في هذا الجهاز، تُستخدم أربعة أوعية مختلفة، يحتوي كل منها على واحد فقط من ثنائي ديوكسي ريبونوكليوتيدات الأربعة. يؤدي إدخال النيوكليوتيدات المُنهية للسلسلة بواسطة بوليميراز الحمض النووي في موضع عشوائي إلى سلسلة من شظايا الحمض النووي ذات الصلة، بأحجام مختلفة، تنتهي بثنائي ديوكسي إيريبونوكليوتيد معين. ثم تُفصل الشظايا حسب الحجم بواسطة الرحلان الكهربائي في هلام بولي أكريلاميد مسطح، أو بشكل أكثر شيوعًا الآن، في أنبوب زجاجي ضيق (شعيري) مملوء ببوليمر لزج.

عرض لبداية قراءة مثال لصبغة الإنهاء (انقر للتكبير)

يُعدّ وسم المُنهيات بديلاً لوسم البادئ، ويُعرف هذا الأسلوب باسم "تسلسل مُنهيات الصبغة". وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب في إمكانية إجراء التسلسل الكامل في تفاعل واحد، بدلاً من أربعة تفاعلات مطلوبة في أسلوب البادئ الموسوم. ويتحقق ذلك من خلال وسم كل مُنهي من مُنهيات سلسلة ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد بصبغة فلورية منفصلة، ​​تُصدر فلورة عند طول موجي مختلف . يُعدّ هذا الأسلوب أسهل وأسرع من أسلوب البادئ المُصبغ، ولكنه قد يُنتج قمم بيانات غير منتظمة (ارتفاعات مختلفة)، وذلك بسبب اختلاف دمج مُنهيات سلسلة الصبغة الكبيرة تبعًا للقالب. وقد تم تقليل هذه المشكلة بشكل كبير مع ظهور إنزيمات وأصباغ جديدة تُقلل من تباين الدمج. ويُستخدم هذا الأسلوب الآن في الغالبية العظمى من تفاعلات التسلسل نظرًا لبساطته وانخفاض تكلفته. السبب الرئيسي لذلك هو عدم الحاجة إلى وضع علامات منفصلة على البادئات (وهو ما قد يُمثل تكلفة كبيرة للبادئات المُخصصة ذات الاستخدام الواحد)، مع أن هذا الأمر أقل أهمية مع البادئات "العالمية" شائعة الاستخدام. لكن هذا الوضع يتغير بسرعة بفضل انخفاض تكلفة أنظمة الجيلين الثاني والثالث من شركات Illumina و454 وABI وHelicos وDover.

التسلسل الناري

تعتمد طريقة التسلسل الناري على رصد إطلاق البيروفوسفات عند دمج النيوكليوتيدات. قبل إجراء التسلسل الناري، يجب تضخيم شريط الحمض النووي المراد تسلسله باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم يُحدد ترتيب إضافة النيوكليوتيدات في جهاز التسلسل (مثل GATC). عند إضافة نيوكليوتيد معين، إذا قام بوليميراز الحمض النووي بدمجه في السلسلة النامية، يتم إطلاق البيروفوسفات وتحويله إلى ATP بواسطة إنزيم ATP سلفوريلاز. يُغذي ATP أكسدة إنزيم لوسيفيراز، وينتج عن هذا التفاعل إشارة ضوئية تُسجل كقمة في مخطط التسلسل الناري. وبهذه الطريقة، يرتبط دمج النيوكليوتيدات بإشارة ضوئية. تتناسب الإشارة الضوئية طرديًا مع كمية النيوكليوتيدات المدمجة أثناء تخليق شريط الحمض النووي (أي أن دمج نيوكليوتيدين يُقابله قمتان في مخطط التسلسل الناري). عندما لا تُدمج النيوكليوتيدات المضافة في جزيء الحمض النووي، لا تُسجل أي إشارة. يزيل إنزيم الأبيراز أي نيوكليوتيد غير مُدمج متبقٍ في التفاعل. لا تتطلب هذه الطريقة نيوكليوتيدات موسومة بصبغات فلورية ولا الفصل الكهربائي الهلامي. وقد طُوِّرت تقنية التسلسل الناري (Pyrosequencing) بواسطة بال نيرن ومصطفى رونغي، وسُوِّقت تجاريًا من قِبَل شركتي Biotage (للتسلسل منخفض الإنتاجية) و454 Life Sciences (للتسلسل عالي الإنتاجية). تُسلسل المنصة الأخيرة ما يقارب 100 ميغابايت [تصل الآن إلى 400 ميغابايت] في سبع ساعات باستخدام جهاز واحد. في الطريقة القائمة على المصفوفات (التي تُسوِّقها شركة 454 Life Sciences)، يُربط الحمض النووي أحادي السلسلة بخرزات ويُضخَّم عبر تفاعل البلمرة المتسلسل المُحسَّن (EmPCR ). ثم توضع هذه الخرزات المرتبطة بالحمض النووي في آبار على شريحة ألياف بصرية مع إنزيمات تُنتج الضوء في وجود الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP ). عند تمرير النيوكليوتيدات الحرة فوق هذه الشريحة، ينبعث الضوء نتيجةً لتكوّن جزيئات ATP عند ارتباط النيوكليوتيدات بأزواجها القاعدية المكملة . وتؤدي إضافة نيوكليوتيد واحد (أو أكثر) إلى تفاعل يُولّد إشارة ضوئية تُسجّلها كاميرا CCD في الجهاز. وتتناسب قوة الإشارة طرديًا مع عدد النيوكليوتيدات، على سبيل المثال، سلاسل البوليمر المتجانسة، المُدمجة في تدفق نيوكليوتيد واحد.

التسلسل الحقيقي لجزيء واحد

التسلسل واسع النطاق

بينما تصف الطرق المذكورة أعلاه طرق التسلسل المختلفة، تُستخدم مصطلحات منفصلة ذات صلة عند تسلسل جزء كبير من الجينوم. وقد طُوّرت العديد من المنصات لإجراء تسلسل الإكسوم (مجموعة فرعية من الحمض النووي عبر جميع الكروموسومات التي تشفر الجينات) أو تسلسل الجينوم الكامل (تسلسل الحمض النووي النووي الكامل للإنسان).

تسلسل الحمض النووي الريبوزي

يُعدّ الحمض النووي الريبوزي (RNA) أقل استقرارًا داخل الخلية، وأكثر عرضةً لهجوم النيوكلياز في التجارب. وبما أن الحمض النووي الريبوزي يُنتَج عن طريق النسخ من الحمض النووي (DNA)، فإن المعلومات موجودة بالفعل في الحمض النووي للخلية. مع ذلك، يُفضَّل أحيانًا تحديد تسلسل جزيئات الحمض النووي الريبوزي . فبينما يُعطي تحديد تسلسل الحمض النووي صورةً وراثيةً للكائن الحي، فإن تحديد تسلسل الحمض النووي الريبوزي يعكس فقط التسلسلات التي تُعبَّر عنها بنشاط في الخلايا. ولتحديد تسلسل الحمض النووي الريبوزي، تتمثل الطريقة المعتادة أولًا في النسخ العكسي للحمض النووي الريبوزي المُستخلص من العينة لإنتاج أجزاء من الحمض النووي التكميلي (cDNA). ويمكن بعد ذلك تحديد تسلسل هذه الأجزاء كما هو موضح أعلاه. يُشكِّل الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي أو الحمض النووي الريبوزي الصغير الجزء الأكبر من الحمض النووي الريبوزي المُعبَّر عنه في الخلايا ، وهو ضارٌّ بالترجمة الخلوية، ولكنه غالبًا لا يكون محور الدراسة. ومع ذلك، يمكن إزالة هذا الجزء في المختبر لإثراء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، الذي يُعدّ عادةً محل اهتمام. تُشتق هذه الجزيئات من الإكسونات ، وتُترجم لاحقًا إلى بروتينات تدعم وظائف خلوية مُحدَّدة. لذا، يُشير نمط التعبير الجيني إلى النشاط الخلوي، وهو أمرٌ بالغ الأهمية في دراسات الأمراض، وسلوك الخلايا، واستجاباتها للمواد الكيميائية أو المحفزات. لا تتطابق جزيئات الحمض النووي الريبوزي ( RNA) في حقيقيات النوى بالضرورة مع قالب الحمض النووي (DNA) الخاص بها، نظرًا لاستئصال الإنترونات . يُضفي هذا الأمر تعقيدًا على عملية ربط تسلسلات القراءة بالجينوم، وبالتالي تحديد مصدرها. لمزيد من المعلومات حول إمكانيات تقنيات التسلسل من الجيل التالي المُطبقة على النسخ الجينية الكاملة، يُرجى الاطلاع على: تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) وتسلسل الحمض النووي الريبوزي الميكروي (MicroRNA Sequencing ).

تسلسل البروتين

تشمل طرق إجراء تسلسل البروتين ما يلي:

إذا كان الجين المسؤول عن ترميز البروتين معروفًا، فمن الأسهل حاليًا تحديد تسلسل الحمض النووي واستنتاج تسلسل البروتين. وقد يكون تحديد جزء من تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين (غالبًا أحد طرفيه) بإحدى الطرق المذكورة أعلاه كافيًا لتحديد نسخة مستنسخة تحمل هذا الجين.

تسلسل عديد السكاريد

على الرغم من أن عديدات السكاريد تُعدّ أيضًا بوليمرات حيوية، إلا أنه ليس من الشائع الحديث عن "تسلسل" عديد السكاريد، وذلك لعدة أسباب. فمع أن العديد من عديدات السكاريد خطية، إلا أن العديد منها متفرع. ويمكن استخدام وحدات مختلفة ( سكريات أحادية فردية) وربطها بطرق مختلفة. ومع ذلك، فإن السبب النظري الرئيسي هو أنه بينما تُنتَج البوليمرات الأخرى المذكورة هنا بشكل أساسي بطريقة "تعتمد على قالب" بواسطة إنزيم واحد، فإن كل رابطة فردية في عديد السكاريد قد تتشكل بواسطة إنزيم مختلف . وفي كثير من الحالات، لا يكون التجميع محددًا بشكل فريد؛ فبحسب الإنزيم الذي يعمل، قد تُدمج إحدى الوحدات المختلفة. وهذا قد يؤدي إلى تكوين عائلة من الجزيئات المتشابهة. وينطبق هذا بشكل خاص على عديدات السكاريد النباتية. وتشمل طرق تحديد بنية قليلات السكاريد وعديدات السكاريد مطيافية الرنين النووي المغناطيسي وتحليل المثيلة . [ 5 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ ويلر، ديفيد أ.؛ سرينيفاسان، مايثريان؛ إيغولم، مايكل؛ شين، يوفينغ؛ تشين، لي؛ ماكغواير، إيمي؛ هي، وين؛ تشين، يي-جو؛ ماخياني، فينود (17 أبريل 2008). "الجينوم الكامل لفرد باستخدام تسلسل الحمض النووي المتوازي عالي الإنتاجية" . مجلة نيتشر . 452 (7189): 872-876 . Bibcode : 2008Natur.452..872W . doi : 10.1038/nature06884 . ISSN 0028-0836 . PMID 18421352 .  
  2. ↑ الحياة 2.0. (31 أغسطس 2006). مجلة الإيكونوميست
  3. ↑ كارلسون، روبرت هـ. علم الأحياء هو التكنولوجيا: الوعد والمخاطر والأعمال التجارية الجديدة لهندسة الحياة. كامبريدج، ماساتشوستس: مطبعة جامعة هارفارد، 2010. مطبوع
  4. ↑ كارلسون، روبرت (2003). "وتيرة وانتشار التقنيات البيولوجية". الأمن البيولوجي والإرهاب البيولوجي: استراتيجية الدفاع البيولوجي، والممارسة، والعلوم . 1 (3): 203-214 . doi : 10.1089/153871303769201851 . PMID 15040198 . 
  5. ↑ "دليل عملي للتحليل الهيكلي للكربوهيدرات" .