تسلسل سانجر

الموسوعة الحرة

يُعدّ تسلسل سانجر طريقةً لتسلسل الحمض النووي تعتمد على الفصل الكهربائي ، وتستند إلى دمج عشوائي لثنائي ديوكسي نيوكليوتيدات إنهاء السلسلة بواسطة بوليميراز الحمض النووي أثناء تضاعف الحمض النووي في المختبر . بعد أن طوّرها فريدريك سانجر وزملاؤه لأول مرة عام 1977، أصبحت الطريقة الأكثر استخدامًا لتسلسل الحمض النووي لمدة أربعين عامًا تقريبًا. وقد طرحت شركة Applied Biosystems جهازًا آليًا يستخدم الفصل الكهربائي على هلام مسطح وعلامات فلورية في الأسواق لأول مرة في مارس 1987. [ 1 ] لاحقًا، استُبدلت الهلامات المسطحة الآلية بالفصل الكهربائي الشعيري الآلي. [ 2 ]

في الآونة الأخيرة، حلت تقنيات التسلسل من الجيل التالي محل تقنية سانجر ذات الحجم الكبير، لا سيما في تحليلات الجينوم الآلية واسعة النطاق . ومع ذلك، لا تزال تقنية سانجر مستخدمة على نطاق واسع في المشاريع الصغيرة وللتحقق من صحة نتائج التسلسل العميق. ولا تزال تتفوق على تقنيات التسلسل ذات القراءات القصيرة (مثل Illumina) في قدرتها على إنتاج قراءات تسلسل الحمض النووي لأكثر من 500 نيوكليوتيد ، مع الحفاظ على معدل خطأ منخفض للغاية ودقة تصل إلى 99.99%. [ 3 ] ولا يزال تسلسل سانجر يُستخدم بنشاط في جهود مبادرات الصحة العامة، مثل تسلسل البروتين الشوكي لفيروس SARS-CoV-2 [ 4 ] ، وكذلك في مراقبة تفشي فيروس نوروفيروس من خلال شبكة المراقبة CaliciNet التابعة لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها في الولايات المتحدة (CDC) . [ 5 ]

طريقة سانجر (إنهاء السلسلة) لتسلسل الحمض النووي

طريقة

جزيئات ddNTP الفلورية

تتطلب طريقة إنهاء السلسلة التقليدية قالبًا من الحمض النووي أحادي السلسلة، وبادئًا للحمض النووي ، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي ، ونيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات منزوعة الأكسجين ( dNTPs ) عادية، ونيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات ثنائية منزوعة الأكسجين معدلة ( ddNTPs )، حيث تعمل الأخيرة على إنهاء استطالة سلسلة الحمض النووي. تفتقر هذه النيوكليوتيدات المُنهية للسلسلة إلى مجموعة 3'- OH اللازمة لتكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين نيوكليوتيدين، مما يؤدي إلى توقف إنزيم بوليميراز الحمض النووي عن استطالة الحمض النووي عند دمج ddNTP معدل. يمكن وسم ddNTPs إشعاعيًا أو فلوريًا للكشف عنها في أجهزة التسلسل الآلية.

تُضاعف عينة الحمض النووي في أربعة تفاعلات تسلسل منفصلة، ​​تحتوي كل منها على جميع النيوكليوتيدات القياسية الأربعة (dATP، dGTP، dCTP، وdTTP) بالإضافة إلى بوليميراز الحمض النووي. يُضاف إلى كل تفاعل نيوكليوتيد ثنائي واحد فقط من النيوكليوتيدات الأربعة (ddATP، ddGTP، ddCTP، أو ddTTP)، بينما تكون النيوكليوتيدات الأخرى المضافة عادية. يجب أن يكون تركيز النيوكليوتيد منزوع الأكسجين أعلى بحوالي 100 ضعف من تركيز النيوكليوتيد الثنائي المقابل (على سبيل المثال، 0.5 ملي مولار dTTP  : 0.005 ملي مولار ddTTP) للسماح بإنتاج عدد كافٍ من القطع مع الاستمرار في نسخ التسلسل الكامل (لكن تركيز ddNTP يعتمد أيضًا على طول التسلسل المطلوب). [ 6 ] بعبارة أخرى، يلزم إجراء أربعة تفاعلات منفصلة في هذه العملية لاختبار جميع النيوكليوتيدات الثنائية الأربعة. بعد جولات من استطالة الحمض النووي القالب من البادئ المرتبط، تُسخّن شظايا الحمض النووي الناتجة وتُفصل حسب الحجم باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي . في المنشور الأصلي عام ١٩٧٧، [ ٦ ] كان تكوين حلقات مزدوجة القواعد في الحمض النووي أحادي السلسلة سببًا لصعوبة بالغة في فصل الحزم في بعض المواقع. يُجرى هذا غالبًا باستخدام هلام بولي أكريلاميد -يوريا مُسخّن، حيث يُجرى كل تفاعل من التفاعلات الأربعة في أحد المسارات الأربعة المنفصلة (المسارات A، T، G، C). يمكن بعد ذلك تصوير حزم الحمض النووي بالتصوير الإشعاعي الذاتي أو الأشعة فوق البنفسجية، ويمكن قراءة تسلسل الحمض النووي مباشرةً من فيلم الأشعة السينية أو صورة الهلام.

جزء من هلام تسلسل موسوم إشعاعيًا

في الصورة على اليمين، عُرِّضَ فيلم الأشعة السينية للهلام، وتُشير الأشرطة الداكنة إلى شظايا الحمض النووي ذات الأطوال المختلفة. يُشير الشريط الداكن في كل مسار إلى شظية حمض نووي ناتجة عن إنهاء السلسلة بعد دمج ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد (ddATP، أو ddGTP، أو ddCTP، أو ddTTP). تُستخدم المواضع النسبية للأشرطة المختلفة بين المسارات الأربعة، من الأسفل إلى الأعلى، لقراءة تسلسل الحمض النووي.

يتم وسم شظايا الحمض النووي بعلامة مشعة أو فلورية على البادئ (1)، في سلسلة الحمض النووي الجديدة باستخدام dNTP موسوم، أو باستخدام ddNTP موسوم.

تشمل الاختلافات التقنية لتسلسل إنهاء السلسلة استخدام النيوكليوتيدات المحتوية على الفوسفور المشع للوسم الإشعاعي ، أو استخدام بادئ موسوم عند الطرف 5' بصبغة فلورية . يُسهّل تسلسل البادئ المصبوغ القراءة في نظام بصري لتحليل أبطأ وأكثر تعقيدًا، بالإضافة إلى الأتمتة. وقد مهّد التطوير اللاحق الذي قام به ليروي هود وزملاؤه [ 7 ] [ 8 ] للنيوكليوتيدات ثنائية الفوسفات (ddNTPs) والبادئات الموسومة فلوريًا الطريق لتسلسل الحمض النووي المؤتمت عالي الإنتاجية.

مقارنة تسلسل السلم باستخدام التسلسل الإشعاعي مع قمم الفلورة

لقد سهّلت طرق إنهاء السلسلة عملية تسلسل الحمض النووي بشكل كبير. فعلى سبيل المثال، تتوفر تجارياً مجموعات تعتمد على إنهاء السلسلة، تحتوي على الكواشف اللازمة للتسلسل، مُقسّمة مسبقاً وجاهزة للاستخدام. وتشمل القيود ارتباط البادئ غير النوعي بالحمض النووي، مما يؤثر على دقة قراءة تسلسل الحمض النووي، بالإضافة إلى تأثير البنى الثانوية للحمض النووي على دقة التسلسل.

تسلسل إنهاء الصبغة

الفصل الكهربائي الشعيري

تعتمد تقنية تسلسل إنهاء السلسلة باستخدام الصبغة على وسم نيوكليوتيدات الديوكسي نيوكليوتيدات (ddNTPs) المستخدمة في إنهاء السلسلة، مما يسمح بإجراء التسلسل في تفاعل واحد بدلاً من أربعة تفاعلات كما في طريقة البادئ الموسوم. في هذه التقنية، يتم وسم كل من نيوكليوتيدات الديوكسي نيوكليوتيدات الأربعة المستخدمة في إنهاء السلسلة بصبغات فلورية، كل منها ينبعث منه ضوء بأطوال موجية مختلفة .

نظراً لسرعتها وكفاءتها العالية، أصبحت تقنية تسلسل الحمض النووي باستخدام الصبغة المُنهية هي التقنية الأساسية في التسلسل الآلي. وتشمل عيوبها تأثيرات الصبغة الناتجة عن اختلافات في دمج مُنهيات السلسلة الموسومة بالصبغة في قطعة الحمض النووي، مما يؤدي إلى تفاوت في ارتفاعات وأشكال القمم في مخطط الفصل الكهربائي لتسلسل الحمض النووي الإلكتروني (وهو نوع من مخططات الكروماتوجرام ) بعد الفصل الكهربائي الشعيري (انظر الشكل على اليسار).

تمت معالجة هذه المشكلة باستخدام أنظمة إنزيم بوليميراز الحمض النووي المعدلة وأصباغ تقلل من تباين الإدماج، بالإضافة إلى طرق لإزالة "بقع الصبغة". وقد استُخدمت طريقة تسلسل إنهاء الصبغة، إلى جانب أجهزة تحليل تسلسل الحمض النووي الآلية عالية الإنتاجية، في الغالبية العظمى من مشاريع التسلسل حتى ظهور تقنية التسلسل من الجيل التالي .

الأتمتة وإعداد العينات

عرض لبداية قراءة مثال لصبغة إنهاء

تستطيع أجهزة تسلسل الحمض النووي الآلية ( أجهزة تسلسل الحمض النووي ) تسلسل ما يصل إلى 384 عينة من الحمض النووي في دفعة واحدة. وقد تُجرى عمليات التسلسل حتى 24 مرة يوميًا. تفصل أجهزة تسلسل الحمض النووي الخيوط حسب الحجم (أو الطول) باستخدام الفصل الكهربائي الشعيري ، وتكشف عن تألق الصبغة وتسجله، وتُخرج البيانات على شكل مخططات كروماتوغرافية لتتبع قمم التألق . تُجرى تفاعلات التسلسل ( التدوير الحراري والوسم)، وتنظيف العينات وإعادة تعليقها في محلول منظم بشكل منفصل قبل تحميلها على جهاز التسلسل. يمكن لعدد من حزم البرامج التجارية وغير التجارية تقليم آثار الحمض النووي منخفضة الجودة تلقائيًا. تُقيّم هذه البرامج جودة كل قمة وتزيل قمم القواعد منخفضة الجودة (التي تقع عادةً في نهايات التسلسل). [ 9 ] دقة هذه الخوارزميات أقل من الفحص البصري بواسطة مُشغل بشري، ولكنها كافية للمعالجة الآلية لمجموعات بيانات التسلسل الكبيرة.

تطبيقات التسلسل المُنهي بالصبغة

يؤدي مجال الصحة العامة أدوارًا متعددة لدعم تشخيص المرضى، فضلًا عن المراقبة البيئية للمواد السامة المحتملة ومسببات الأمراض البيولوجية المنتشرة. وقد اضطلعت مختبرات الصحة العامة، وغيرها من المختبرات حول العالم، بدور محوري في توفير بيانات التسلسل السريع لمراقبة فيروس SARS-CoV-2 ، المسبب لمرض كوفيد-19، خلال الجائحة التي أُعلنت حالة طوارئ صحية عامة في 30 يناير 2020. [ 10 ] وكُلِّفت المختبرات بالتنفيذ السريع لأساليب التسلسل، وطُلب منها توفير بيانات دقيقة للمساعدة في نماذج صنع القرار لتطوير سياسات للحد من انتشار الفيروس. وقد لجأت العديد من المختبرات إلى منهجيات التسلسل من الجيل التالي، بينما دعمت مختبرات أخرى الجهود باستخدام تسلسل سانجر. تتعدد جهود تحديد التسلسل الجيني لفيروس SARS-CoV-2، فبينما طبّقت معظم المختبرات تسلسل الجينوم الكامل للفيروس، اختارت مختبرات أخرى تسلسل جينات محددة للغاية، مثل جين S الذي يحمل المعلومات اللازمة لإنتاج البروتين الشوكي. يؤدي معدل الطفرات المرتفع لفيروس SARS-CoV-2 إلى اختلافات جينية داخل جين S، وقد لعبت هذه الاختلافات دورًا في قدرة الفيروس على العدوى. [ 11 ] يوفر تسلسل سانجر لجين S طريقة سريعة ودقيقة وأقل تكلفة لاستخلاص الشفرة الجينية . قد لا تمتلك المختبرات في البلدان ذات الدخل المنخفض الإمكانيات اللازمة لتطبيق تقنيات مكلفة مثل تقنيات التسلسل من الجيل التالي، لذا قد تسود طرق سانجر في دعم توليد بيانات التسلسل لمراقبة المتحورات.

يُعدّ تسلسل سانجر المعيار الذهبي لأساليب ترصد فيروس نوروفيروس في شبكة كاليسي نت التابعة لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC). وكاليسي نت هي شبكة ترصد تفشي الأمراض، أُنشئت في مارس 2009. تهدف الشبكة إلى جمع بيانات التسلسل الجيني لفيروسات نوروفيروس المنتشرة في الولايات المتحدة، واتخاذ الإجراءات اللازمة لتحديد مصدر العدوى والحدّ من انتشار الفيروس. وقد صنّفت شبكة كاليسي نت العديد من حالات العدوى على أنها أمراض منقولة بالغذاء. [ 5 ] ويمكن نشر هذه البيانات واستخدامها لوضع توصيات بشأن الإجراءات المستقبلية لمنع تلوث الأغذية. وتشمل طرق الكشف عن فيروس نوروفيروس التضخيم الموجّه لمناطق محددة من الجينوم. ثم تُسلسل النواتج المُضخّمة باستخدام تسلسل سانجر المُنهي بالصبغة، وتُحلّل المخططات اللونية والتسلسلات الناتجة باستخدام برنامج طُوّر في شركة بيونيميركس . ويتم تتبع التسلسلات ودراسة صلة السلالات لاستنتاج أهميتها الوبائية.

التحديات

تشمل التحديات الشائعة لتسلسل الحمض النووي باستخدام طريقة سانجر انخفاض جودة التسلسل في أول 15-40 قاعدة نتيجة ارتباط البادئات، وتدهور جودة التسلسل بعد 700-900 قاعدة. عادةً ما توفر برامج تحليل القواعد، مثل Phred، تقديرًا للجودة للمساعدة في حذف المناطق ذات الجودة المنخفضة من التسلسلات. [ 12 ] [ 13 ]

في الحالات التي تُستنسخ فيها أجزاء من الحمض النووي قبل التسلسل، قد يحتوي التسلسل الناتج على أجزاء من ناقل الاستنساخ . في المقابل، غالبًا ما تتجنب تقنيات الاستنساخ القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتقنيات التسلسل من الجيل التالي القائمة على التسلسل الناري استخدام نواقل الاستنساخ. ومؤخرًا، طُوّرت طرق تسلسل سانجر أحادية الخطوة (التضخيم والتسلسل المدمجان) مثل Ampliseq وSeqSharp، والتي تسمح بالتسلسل السريع للجينات المستهدفة دون الحاجة إلى الاستنساخ أو التضخيم المسبق. [ 14 ] [ 15 ]

لا تستطيع الطرق الحالية تحديد تسلسل سوى أجزاء الحمض النووي القصيرة نسبيًا (يتراوح طولها بين 300 و1000 نيوكليوتيد ) في تفاعل واحد. ويتمثل العائق الرئيسي أمام تحديد تسلسل أجزاء الحمض النووي التي تتجاوز هذا الحد في عدم كفاية قدرة الفصل لفصل أجزاء الحمض النووي الكبيرة التي لا يختلف طولها إلا بنيوكليوتيد واحد.

تسلسل سانجر الميكروفلويدي

يُعدّ تسلسل سانجر الميكروفلويدي تطبيقًا متطورًا لتسلسل الحمض النووي، حيث تُدمج خطوات تسلسل سانجر (التسخين، وتنقية العينة، والرحلان الكهربائي الشعيري) على شريحة بحجم رقاقة السيليكون باستخدام أحجام عينات نانولترية. تُنتج هذه التقنية قراءات تسلسل طويلة ودقيقة، مع تجنّب العديد من أوجه القصور الهامة في طريقة سانجر التقليدية (مثل الاستهلاك العالي للكواشف باهظة الثمن، والاعتماد على معدات باهظة الثمن، والعمليات التي تتطلب عددًا كبيرًا من الأفراد، إلخ) من خلال دمج خطوات تسلسل سانجر وأتمتتها.

في بداياتها الحديثة، تتضمن تقنية تسلسل الجينوم عالي الإنتاجية تجزئة الجينوم إلى أجزاء صغيرة أحادية السلسلة، يليها تضخيم هذه الأجزاء باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وباتباع طريقة سانجر، يتم إنهاء كل جزء من الحمض النووي بشكل نهائي بإضافة نيوكليوتيد ثنائي ديوكسي موسوم بصبغة فلورية، مما ينتج عنه "سلم" من الحمض النووي، حيث يختلف طول كل جزء عن الآخر بقاعدة واحدة، ويحمل كل جزء علامة فلورية خاصة بالقاعدة عند نهايته. ثم تُفصل سلالم القواعد المُضخمة بواسطة الرحلان الكهربائي الشعيري (CAE) مع الكشف الآلي الموضعي عن أجزاء الحمض النووي أحادية السلسلة الموسومة بالفلورة، مما يوفر تسلسلًا مُرتبًا لهذه الأجزاء. بعد ذلك، تُجمع قراءات هذا التسلسل حاسوبيًا في تسلسلات متداخلة أو متجاورة (تُسمى "القطع المتجاورة")، والتي تُشبه التسلسل الجينومي الكامل بعد اكتمال تجميعها. [ 16 ]

تُحقق طرق سانجر أقصى طول قراءة يبلغ حوالي 800 زوج قاعدي (عادةً ما بين 500 و600 زوج قاعدي مع الحمض النووي غير المُخصب). تُظهر أطوال القراءة الأطول في طرق سانجر مزايا كبيرة مقارنةً بطرق التسلسل الأخرى، لا سيما فيما يتعلق بتسلسل المناطق المتكررة من الجينوم. يُعدّ تسلسل البيانات ذات القراءة القصيرة تحديًا، خاصةً عند تسلسل الجينومات الجديدة (de novo) وعند تسلسل أجزاء الجينوم المُعاد ترتيبها بشكل كبير، كما هو الحال في جينومات السرطان أو في مناطق الكروموسومات التي تُظهر تنوعًا بنيويًا . [ 17 ]

تطبيقات تقنيات التسلسل الميكروفلويدي

تشمل التطبيقات المفيدة الأخرى لتسلسل الحمض النووي (DNA) الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP)، وتحليل تعدد أشكال التوافق أحادي السلسلة (SSCP) ، وتحليل التكرارات الترادفية القصيرة (STR). ويُعدّ فصل أجزاء الحمض النووي وفقًا للاختلافات في الحجم و/أو التوافق الخطوة الأكثر أهمية في دراسة هذه الخصائص للجينوم. [ 16 ]

تصميم الجهاز

تتكون شريحة التسلسل من أربع طبقات، تتألف من ثلاث رقائق زجاجية قطر كل منها 100 مم (تُصنع عليها عناصر الجهاز بتقنية التصنيع الدقيق) وغشاء من متعدد ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS). تُحفر حجرات التفاعل وقنوات الفصل الكهربائي الشعري بين الرقائق الزجاجية العلوية، والتي تُربط حراريًا. وتُشكل وصلات القنوات ثلاثية الأبعاد والصمامات الدقيقة بواسطة غشاء PDMS والرقاقة الزجاجية السفلية متعددة القنوات.

يتكون الجهاز من ثلاث وحدات وظيفية، كل منها تُقابل خطوات تسلسل سانجر. وحدة التدوير الحراري (TC) عبارة عن حجرة تفاعل سعتها 250 نانولتر مزودة بكاشف حراري مقاوم مدمج، وصمامات دقيقة، وسخان سطحي. ينتقل الكاشف بين الطبقة الزجاجية العلوية والطبقة الزجاجية-PDMS السفلية عبر ثقوب قطرها 500 ميكرومتر. بعد التدوير الحراري، يخضع خليط التفاعل للتنقية في حجرة الالتقاط/التنقية، ثم يُحقن في حجرة الفصل الكهربائي الشعيري (CE). تتكون وحدة الفصل الكهربائي الشعيري من أنبوب شعري طوله 30 سم مطوي على شكل متعرج مضغوط عبر انحناءات عرضها 65 ميكرومتر.

كيمياء التسلسل

دورات حرارية
في حجرة تفاعل TC، يتم تحميل كاشف تسلسل إنهاء الصبغة، والحمض النووي القالب، والبادئات في حجرة TC ويتم تدويرها حرارياً لمدة 35 دورة (عند 95  درجة مئوية لمدة 12 ثانية وعند 60  درجة مئوية لمدة 55 ثانية).
طهارة
يُمرر مزيج التفاعل المشحون (الذي يحتوي على قطع التمديد، وحمض نووي قالب، وفائض من كاشف التسلسل) عبر حجرة التقاط/تنقية عند درجة حرارة 30 درجة مئوية، وذلك بتطبيق مجال كهربائي شدته  33 فولت/سم بين منفذي الالتقاط. يتكون هلام الالتقاط، الذي يمر عبره العينة، من 40 ميكرومول من قليل النوكليوتيدات (المكمل للبادئات) المرتبط تساهميًا بمصفوفة بولي أكريلاميد. تُثبّت قطع التمديد بواسطة مصفوفة الهلام، بينما يُغسل فائض البادئات، والقالب، والنوكليوتيدات الحرة، والأملاح عبر منفذ نفايات الالتقاط. يُسخّن هلام الالتقاط إلى درجة حرارة تتراوح بين 67 و75 درجة مئوية لتحرير قطع التمديد. 
الفصل الكهربائي الشعيري
يتم حقن أجزاء التمديد في حجرة الفصل الكهربائي حيث يتم فصلها كهربائياً من خلال مجال كهربائي 125-167 فولت/سم.

المنصات

تُدمج منصة Apollo 100 (شركة Microchip Biotechnologies Inc.، دبلن، كاليفورنيا) [ 18 ] أول خطوتين من خطوات تسلسل سانجر (التسخين والتنقية) في نظام آلي بالكامل. وتدّعي الشركة المصنّعة أن العينات تكون جاهزة للفصل الكهربائي الشعيري في غضون ثلاث ساعات من تحميل العينة والكواشف في النظام. وتتطلب منصة Apollo 100 كميات ضئيلة جدًا من الكواشف، تصل إلى أقل من ميكرولتر.

مقارنة بتقنيات التسلسل الأخرى

قيم الأداء لتقنيات تسلسل الجينوم بما في ذلك طرق سانجر وطرق الجيل التالي [ 17 ] [ 19 ] [ 20 ]
تكنولوجياعدد المساراتحجم الحقن (نانولتر)وقت التحليلمتوسط ​​طول القراءةالإنتاجية (بما في ذلك التحليل؛ ميغابايت/ ساعة )صب الجلتتبع المسار
جل لوحي96500–10006-8 ساعات700 نقطة أساس0.0672نعمنعم
الفصل الكهربائي الشعيري961-5من ساعة إلى ثلاث ساعات700 نقطة أساس0.166لالا
رقاقة دقيقة960.1–0.56-30 دقيقة430 نقطة أساس0.660لالا
454/Roche FLX (2008)< 0.0014 ساعات200-300 زوج قاعدي20-30
Illumina/Solexa (2008)2-3 أيام30-100 زوج قاعدي20
ABI/SOLiD (2008)8 أيام35 نقطة أساسية5–15
Illumina MiSeq (2019)من يوم إلى ثلاثة أيام2x75–2x300 bp170–250
Illumina NovaSeq (2019)يوم إلى يومين2x50–2x150 bp22000–67000
Ion Torrent Ion 530 (2019)2.5–4 ساعات200-600 زوج قاعدي110–920
BGI MGISEQ-T7 (2019)يوم واحد2x150 bp250,000
مراجعة العلوم البيولوجية في المحيط الهادئ (2023)12-30 ساعة15-25 كيلوبايت [ 21 ]15000
أوكسفورد نانوبور مين أيون (2019)3 أيام13-20 كيلوبايت [ 22 ]700

يتمثل الهدف النهائي لتقنية التسلسل عالي الإنتاجية في تطوير أنظمة منخفضة التكلفة وذات كفاءة عالية للغاية في الحصول على قراءات طويلة. يؤدي طول القراءة الأطول لكل فصل كهربائي منفرد إلى تقليل تكلفة تسلسل الحمض النووي من الصفر وعدد القوالب اللازمة لتسلسل قطع الحمض النووي عند مستوى معين من التكرار. قد تُتيح تقنية الموائع الدقيقة تجميع التسلسل بشكل أسرع وأرخص وأسهل . [ 16 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ تشايت، إدوارد؛ بيج، جاي؛ هانكابيلر، مايكل (1988). "معركة أجهزة تسلسل الحمض النووي". مجلة نيتشر . 333 (6172): 477-478 . رمز Bibcode : 1988Natur.333..477C . doi : 10.1038/333477a0 . ISSN 0028-0836 . 
  2. ↑ تشانغ، ج. (15 ديسمبر 1999). "نظام الفصل الكهربائي الشعيري المتعدد لتسلسل وتحليل الحمض النووي على نطاق صغير" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 27 (24): 36e–36. doi : 10.1093 / nar/27.24.e36 . PMC 148759. PMID 10572188 .  
  3. ↑ شندور ج، جي هـ (أكتوبر 2008). "تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي". مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 26 (10): 1135-1145 . doi : 10.1038/nbt1486 . ​​PMID 18846087. S2CID 6384349 .  
  4. ↑ دانيلز آر إس، هارفي آر، إرميتال بي، شيانغ زد، غاليانو إم، آدامز إل، مكولي جيه دبليو (نوفمبر 2021). " بروتوكول تسلسل سانجر لجين S لفيروس SARS-CoV-2" . الإنفلونزا والفيروسات التنفسية الأخرى . 15 (6): 707-710 . doi : 10.1111/irv.12892 . PMC 8447197. PMID 34346163 .  
  5. 1 2 فيغا إي، باركلي إل، غريغوريكوس إن، ويليامز كيه، لي دي، فينجي جيه (أغسطس 2011). "شبكة مراقبة جديدة لتفشي التهاب المعدة والأمعاء الناتج عن فيروس نوروفيروس، الولايات المتحدة" . الأمراض المعدية الناشئة . 17 (8): 1389-1395 . doi : 10.3201/eid1708.101837 . PMC 3381557. PMID 21801614 .  
  6. 1 2 سانجر ف، نيكلين س، كولسون أ.ر. (ديسمبر 1977). "تسلسل الحمض النووي باستخدام مثبطات إنهاء السلسلة" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 74 (12): 5463-5467 . Bibcode : 1977PNAS...74.5463S . doi : 10.1073/pnas.74.12.5463 . PMC 431765. PMID 271968 .  
  7. ↑ سميث إل إم، ساندرز جيه زد، كايزر آر جيه، هيوز بي، دود سي، كونيل سي آر، وآخرون (1986). " الكشف عن الفلورة في التحليل الآلي لتسلسل الحمض النووي". مجلة نيتشر . 321 (6071): 674-679 . Bibcode : 1986Natur.321..674S . doi : 10.1038/321674a0 . PMID 3713851. S2CID 27800972. لقد طورنا طريقةً للأتمتة الجزئية لتحليل تسلسل الحمض النووي. يتم الكشف عن فلورة شظايا الحمض النووي باستخدام فلوروفور مرتبط تساهميًا ببادئ الأوليغونوكليوتيد المستخدم في التحليل الإنزيمي لتسلسل الحمض النووي. يتم استخدام فلوروفور بلون مختلف لكل تفاعل من التفاعلات الخاصة بالقواعد A و C و G و T. يتم دمج مخاليط التفاعل وفصلها كهربائياً عبر أنبوب هلام بولي أكريلاميد واحد، ويتم الكشف عن الحزم الفلورية المنفصلة للحمض النووي بالقرب من قاع الأنبوب، ويتم الحصول على معلومات التسلسل مباشرة بواسطة الكمبيوتر.   
  8. ↑ سميث إل إم، فونغ إس، هونكابيلر إم دبليو، هونكابيلر تي جيه، هود إل إي (أبريل 1985). "تخليق قليل النوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعة أمينية أليفاتية في الطرف 5': تخليق بادئات الحمض النووي الفلورية لاستخدامها في تحليل تسلسل الحمض النووي" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 13 (7): 2399-2412 . doi : 10.1093/nar/13.7.2399 . PMC 341163. PMID 4000959 .  
  9. ↑ كروسلي، بيات م.؛ باي، جيانفا؛ جلاسر، إيمي؛ مايس، روجر؛ بورتر، إليزابيث؛ كيليان، ماري ليا؛ كليمنت، ترافيس؛ توهي-كورث، كاثي (نوفمبر 2020). "إرشادات لتسلسل سانجر ومراقبة المقايسات الجزيئية" . مجلة التحقيقات التشخيصية البيطرية . 32 (6): 767-775 . doi : 10.1177/1040638720905833 . ISSN 1040-6387 . PMC 7649556. PMID 32070230 .   
  10. ↑ تايلور، د.ب. (17 مارس 2021). "جدول زمني لجائحة فيروس كورونا" . صحيفة نيويورك تايمز . الرقم الدولي الموحد للدوريات 0362-4331 . تاريخ الاسترجاع: 5 ديسمبر 2021 . 
  11. ↑ سانشيز، بي آر، تشارلي سيلفا، آي، براز، إتش إل، بيطار، سي، فريتاس كالمون، إم، رحال، بي، سيلي، إي إم (سبتمبر 2021). "التطورات الحديثة في بروتين سبايك وطفرات RBD لفيروس SARS-CoV-2: مقارنة بين المتغيرات الجديدة ألفا (B.1.1.7، المملكة المتحدة)، وبيتا (B.1.351، جنوب أفريقيا)، وجاما (P.1، البرازيل)، ودلتا (B.1.617.2، الهند)" . مجلة استئصال الفيروسات . 7 (3) 100054. doi : 10.1016/j.jve.2021.100054 . PMC 8443533. PMID 34548928 .  
  12. ↑ "Phred – Quality Base Calling" . تم الاطلاع عليه بتاريخ 24-02-2011 .
  13. ↑ ليدرجيربر سي، ديسيموز سي (سبتمبر 2011). "استدعاء القواعد لمنصات التسلسل من الجيل التالي" . موجزات في المعلوماتية الحيوية . 12 (5): 489-497 . doi : 10.1093/bib/bbq077 . PMC 3178052. PMID 21245079 .  
  14. ↑ مورفي كيه إم، بيرغ كيه دي، إيشلمان جيه آر (يناير 2005). "تسلسل الحمض النووي الجينومي بواسطة تفاعل التضخيم والتسلسل الدوري المدمج" . الكيمياء السريرية . 51 (1): 35-39 . doi : 10.1373/clinchem.2004.039164 . PMID 15514094 . 
  15. ↑ سينغوبتا دي جيه، كوكسون بي تي (مايو 2010). "SeqSharp: منهج عام لتحسين تسلسل الدورة، يُسهّل طريقة تضخيم وتسلسل قوية بخطوة واحدة مُدمجة" . مجلة التشخيص الجزيئي . 12 (3): 272-277 . doi : 10.2353/jmoldx.2010.090134 . PMC 2860461. PMID 20203000 .  
  16. 1 2 3 كان سي دبليو، فريدليك سي بي، دوهرتي إي إيه، بارون إيه إي (نوفمبر 2004). "تسلسل الحمض النووي وتحديد النمط الجيني في أنظمة الفصل الكهربائي المصغرة". الفصل الكهربائي . 25 ( 21-22 ): 3564-3588 . doi : 10.1002/elps.200406161 . PMID 15565709. S2CID 4851728 .  
  17. 1 2 موروزوفا، أو.، ومارا، م. أ. (نوفمبر 2008). "تطبيقات تقنيات التسلسل من الجيل التالي في علم الجينوم الوظيفي". علم الجينوم . 92 (5): 255-264 . doi : 10.1016/j.ygeno.2008.07.001 . PMID 18703132 . 
  18. ^ شركة ميكروشيب بيولوجيز أبولو 100
  19. ↑ سينفيل ر، سوبر س أ (يوليو 2007). "فصل الحمض النووي عالي الدقة باستخدام الرحلان الكهربائي الدقيق". مجلة علوم الفصل . 30 (11): 1714-1728 . doi : 10.1002/jssc.200700150 . PMID 17623451 . 
  20. ↑ كومار كيه آر، كولي إم جيه، ديفيس آر إل (أكتوبر 2019). "التسلسل الجيني من الجيل التالي والتقنيات الناشئة" . ندوات في التخثر والإرقاء . 45 (7): 661-673 . doi : 10.1055/s-0039-1688446 . PMID 31096307 . 
  21. ↑ ماستروروزا إف كيه، ميلر دي إي، إيخلر إي إي (يونيو 2023). " تطبيقات تسلسل القراءة الطويلة على علم الوراثة المندلية" . طب الجينوم . 15 (1): 42. doi : 10.1186/s13073-023-01194-3 . PMC 10266321. PMID 37316925 .  
  22. ↑ تايسون جيه آر، أونيل إن جيه، جاين إم، أولسن إتش إي، هايتر بي، سنوتش تي بي (فبراير 2018). "التسلسل والتجميع طويل القراءة باستخدام جهاز MinION يُوسّع نطاق الجينوم المرجعي لـ Caenorhabditis elegans" . أبحاث الجينوم . 28 ( 2): 266-274 . doi : 10.1101/gr.221184.117 . PMC 5793790. PMID 29273626 .  

للمزيد من القراءة