Cas12a

Cas12a ( البروتين المرتبط بـ CRISPR - 12a ، المعروف سابقًا باسم Cpf1 ) هو إنزيم نوكلياز داخلي - خارجي مرتبط بـ CRISPR من النوع الخامس من الفئة الثانية . ^{[ 1 ]} في البكتيريا مثل F. novicida ، ^{[ 2 ] [ 3 ]} في بيئتها الطبيعية، يستهدف Cas12a المادة الوراثية للفيروسات والعناصر الوراثية المتنقلة الغريبة الأخرى ويدمرها . في الكائن الحي المستهدف، يحتوي crRNA على منطقة ثابتة يتعرف عليها Cas12a ومنطقة "فاصلة" مكملة لجزء من الحمض النووي الغريب (مثل جزء من جينوم العاثية ) الذي سبق أن أصاب الخلية. ^{[ 4 ]}

يختلف إنزيم Cas12a عن Cas9 في عدة جوانب: فهو يُحدث قطعًا متداخلة في الحمض النووي المزدوج، على عكس النهايات غير المتداخلة؛ ^{[ 5 ]} ويعتمد على نمط بروتوسبيسر مجاور غني بالثايمين (PAM) (عادةً 5'-TTTV-3'، حيث V هو A أو C أو G)، مما يوفر مواقع بديلة مقارنةً بأنماط PAM الغنية بالجوانين (عادةً 5'-NGG-3') التي يُفضلها Cas9؛ ^{[ 6 ]} ولا يتطلب سوى حمض نووي ريبوزي CRISPR (crRNA) للاستهداف الفعال، بينما يتطلب Cas9 كلاً من crRNA وحمض نووي ريبوزي مُنشط (tracrRNA). ^{[ 7 ]}

إن قدرة Cas12a على استهداف الحمض النووي بشكل قابل للبرمجة تجعلها أداةً مفيدةً في تطبيقات التقنية الحيوية والبحوث البيولوجية. فمن خلال تعديل تسلسل الفاصل في crRNA، يستطيع الباحثون توجيه Cas12a إلى تسلسل محدد من الحمض النووي، مما يسمح بإجراء تعديلات دقيقة على الحمض النووي . ^{[ 8 ]} يتميز Cas12a عن بروتينات Cas الأخرى بموقعه النشط الوحيد RuvC ، وتفضيله للنمط المجاور للبروتوسبيسر 5' ، وتكوينه نهايات لاصقة بدلاً من النهايات غير اللاصقة عند موقع القطع؛ هذه الاختلافات وغيرها تجعله أكثر ملاءمةً لبعض التطبيقات . وبعيدًا عن البحوث الأساسية ، قد يكون لنظام CRISPR-Cas12a تطبيقات في الأمراض الوراثية وتقنية محركات الجينات . ^{[ 8 ]}

قد تُضفي خصائص Cas12a مزايا على Cas9 في مجال تعديل الجينات. فعلى سبيل المثال، يُناسب صغر حجم جزيئات crRNA الخاصة بـ Cas12a تعديل الجينوم المتعدد، مما يسمح بتعبئة عدد أكبر من جزيئات الحمض النووي الريبوزي الدليلية (sgRNAs) في ناقل واحد مقارنةً بجزيئات الحمض النووي الريبوزي الدليلية المفردة (sgRNAs) الخاصة بـ Cas9. ^{[ 9 ]} كما يُمكن استخدام النهايات اللاصقة 5′ التي يُنتجها Cas12a لتجميع الحمض النووي بدقة استهداف أعلى من الاستنساخ التقليدي باستخدام إنزيمات التقييد. علاوة على ذلك، يقوم Cas12a بقطع الحمض النووي على بُعد 18-23 زوجًا قاعديًا من موقع PAM. تضمن هذه الخاصية بقاء تسلسل التعرف سليمًا بعد الإصلاح، مما يُمكّن Cas12a من إجراء جولات متعددة من قطع الحمض النووي. على النقيض، يقوم إنزيم Cas9 بقطع ثلاثة أزواج قاعدية فقط قبل موقع PAM، مما يؤدي إلى طفرات إدخال/حذف من مسار الربط غير المتجانس للنهايات (NHEJ) التي قد تعطل تسلسل التعرف، وبالتالي تمنع جولات القطع اللاحقة. ومن السمات البارزة لإنزيم Cas12a، على عكس Cas9، قدرته على البقاء مرتبطًا بالحمض النووي المستهدف بعد القطع، ثم قطع جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة الأخرى دون تمييز. وقد استُغلت هذه الخاصية، التي تُسمى "القطع الجانبي" أو "القطع العابر"، في تطوير تقنيات تشخيصية متنوعة. ^{[ 10 ]}

على الرغم من تصنيف Cas12a ضمن فئة النيوكليازات المرتبطة بتقنية CRISPR من النوع الخامس، إلا أنه يفتقر إلى نطاق NHN الداخلي الموجود في Cas9، ويعتمد بدلاً من ذلك على نطاقه الشبيه بـ RuvC لقطع الحمض النووي بشكل متسلسل، مما ينتج عنه نهايات متداخلة. ^{[ 10 ]} وعلى عكس Cas9، يمتلك Cas12a نطاقًا فريدًا يشبه إصبع الزنك، والذي قد يُسهم في ارتباط الحمض النووي أو استقراره البنيوي. ومن أهم مزايا Cas12a على Cas9 نشاطه الريبونوكليازي المتأصل ضمن نطاق WED، مما يُتيح المعالجة الذاتية لـ crRNAs الأولية (pre-crRNAs) إلى crRNAs ناضجة. ^{[ 11 ]} وهذا يُلغي الحاجة إلى crRNA مُنشط (tracrRNA)، مما يُبسط تصميم الحمض النووي الريبوزي الدليلي ويُسهل التحرير المتعدد من خلال تغليف العديد من crRNAs في ناقل واحد.

يُعدّ تحرير الجينوم المتعدد تقنيةً فعّالةً تُتيح تحرير جيناتٍ متعددةٍ في آنٍ واحد. ويُعتبر Cas12a مفيدًا بشكلٍ خاص في هذا السياق نظرًا لخصائصه التي تُسهّل استخدامه مقارنةً بـ Cas9. ^{[ 12 ]} فعلى سبيل المثال، لا يتطلب Cas12a سوى جزيء قصير من الحمض النووي الريبوزي CRISPR (crRNA) لاستهداف الجينات وتحريرها. ^{[ 13 ]} ويمكن بسهولة تجميع جزيئات crRNA هذه في نظام توصيل واحد، مما يُتيح تحرير مواقع جينومية متعددة في آنٍ واحد. ^{[ 14 ]}

علاوة على ذلك، يختلف كل من Cas12a وCas9 في متطلباتهما من النمط المجاور للبروتوسبيسر (PAM). فبينما يبحث Cas9 عادةً عن تسلسلات غنية بالجوانين، يستهدف Cas12a التسلسلات الغنية بالثايمين. هذا الاختلاف يوسع نطاق المواقع الجينومية المستهدفة، مما يسمح لـ Cas12a بتعديل الجينات في مناطق قد لا يكون Cas9 فعالاً فيها، مثل المناطق الغنية بالأدينين والثايمين المنتشرة في جينومات النباتات، ^{[ 15 ]} مما يوفر مرونة أكبر للباحثين.

إن قدرة Cas12a على توصيل crRNA الخاص به (CRISPR RNA) دون الحاجة إلى مكونات إضافية مثل tracrRNA المطلوبة بواسطة Cas9 تبسط تصميم وتوصيل RNAs الدليلية للتحرير المتعدد.

يحتوي بروتين Cas12a على نطاق ألفا/بيتا مختلط، ونطاق نوكلياز داخلي شبيه بـ RuvC (مقسم إلى جزأين غير متجاورين، RuvC-I و RuvC-II) مشابه لنطاق RuvC في Cas9، ونطاق شبيه بإصبع الزنك . ^{[ 18 ]} على عكس Cas9، لا يحتوي Cas12a على نطاق نوكلياز داخلي HNH، كما أن المنطقة الطرفية N لـ Cas12a لا تحتوي على فص تعرف حلزوني ألفا كما هو الحال في Cas9. ^{[ 17 ]}

تُشفّر مواقع Cas12a بروتينات Cas1 و Cas2 و Cas4، وهي أقرب إلى النوعين الأول والثالث منها إلى النوع الثاني. وتشير عمليات البحث في قواعد البيانات إلى وفرة بروتينات عائلة Cas12a في العديد من أنواع البكتيريا. ^{[ 17 ]}

على عكس Cas9، لا يتطلب Cas12a وجود tracrRNA (الذي يجب أن يرتبط في أنظمة CRISPR الطبيعية بـ crRNA منفصل قبل الارتباط ببروتين Cas)، بل يرتبط بـ crRNA واحد فقط. يُعد كل من Cas12a و RNA الدليل الخاص به أصغر حجمًا من مكونات البروتين و RNA في نظام Cas9؛ إذ يبلغ طول crRNA الخاص بـ Cas12a نصف طول sgRNAs المستخدمة مع Cas9 تقريبًا. ^{[ 19 ]} هذا الحجم الصغير يجعل Cas12a أكثر ملاءمة لتطبيقات مثل التوصيل داخل الجسم الحي عبر الفيروسات الغدية المرتبطة (AAV)، والتي تتميز بقدرة محدودة على تغليف الحمض النووي نظرًا لصغر حجم غلافها البروتيني.

يقوم معقد Cas12a-crRNA بقطع الحمض النووي المستهدف (DNA أو RNA) عن طريق تحديد نمط البروتوسبيسر المجاور (PAM) 5'-YTN-3' ^{[ 20 ]} (حيث "Y" هو بيريميدين ^{[ 21 ]} و"N" هو أي قاعدة نووية )، على عكس نمط PAM الغني بالجوانين الذي يستهدفه Cas9. بعد تحديد نمط PAM، يُحدث Cas12a كسرًا مزدوجًا في الحمض النووي يشبه النهاية اللاصقة، مع بروز 4 أو 5 نيوكليوتيدات. ^{[ 18 ]}

يتكون نظام CRISPR-Cas12a من إنزيم Cas12a وRNA مرشد يحدد موقع المركب ويضعه في المكان الصحيح على اللولب المزدوج لقطع الحمض النووي المستهدف. يمر نشاط نظام CRISPR-Cas12a بثلاث مراحل: ^{[ 16 ]}

• التكيف: تعمل بروتينات Cas1 و Cas2 على تسهيل تكيف أجزاء صغيرة من الحمض النووي في مصفوفة CRISPR.
• تكوين crRNAs: معالجة pre-cr-RNAs لإنتاج crRNAs ناضجة لتوجيه بروتين Cas.
• التداخل: يرتبط بروتين Cas12a بجزيء crRNA لتكوين مُركّب ثنائي لتحديد تسلسل الحمض النووي المستهدف وقطعه. يبحث مُركّب crRNA-Cas12a في الحمض النووي المزدوج عن نمط مُجاور للبروتوسبيسر 5' (PAM) يتراوح طوله بين 3 و6 نيوكليوتيدات. بمجرد العثور على PAM، يقوم البروتين بفصل سلسلتي الحمض النووي المزدوج موضعيًا، ويبحث عن تكامل بين فاصل crRNA والبروتوسبيسر في الحمض النووي المفرد. يُحفّز التكامل الكافي نشاط RuvC، فيقوم الموقع النشط لـ RuvC بقطع السلسلة غير المستهدفة، ثم السلسلة المستهدفة، مُولّدًا في النهاية قطعًا مُتداخلًا في الحمض النووي المزدوج مع بروزات 5' في الحمض النووي المفرد (قطع cis). ^{[ 18 ] [ 22 ]}

Cas9 مقابل Cas12a

يتطلب Cas9 جزيئين من الحمض النووي الريبوزي (RNA) لقطع الحمض النووي (DNA)، بينما يحتاج Cas12a إلى جزيء واحد فقط. كما يقطع هذان البروتينان الحمض النووي في مواقع مختلفة، مما يتيح للباحثين خيارات أوسع عند اختيار موقع التعديل. يقطع Cas9 كلا سلسلتي الحمض النووي في الموضع نفسه، تاركًا نهايات غير لاصقة . أما Cas12a، فيترك إحدى السلسلتين أطول من الأخرى، مكونًا نهايات لاصقة . تتميز هذه النهايات اللاصقة بخصائص مختلفة عن النهايات غير اللاصقة أثناء عملية الربط غير المتجانس أو الإصلاح المتجانس للحمض النووي، مما يمنح Cas12a مزايا معينة عند محاولة إدخال الجينات، مقارنةً بـ Cas9. ^{[ 16 ]} على الرغم من أن نظام CRISPR-Cas9 قادر على تعطيل الجينات بكفاءة، إلا أن إدخال الجينات أو توليد جين مُدخل (knock-in) يمثل تحديًا. ^{[ 4 ]} يفتقر Cas12a إلى tracrRNA ، ويستخدم تسلسل PAM غني بالثايمين، ويقطع الحمض النووي عبر كسر مزدوج السلسلة متداخل. ^{[ 19 ]}

باختصار، تتمثل الاختلافات المهمة بين نظامي Cas12a و Cas9 في أن Cas12a: ^{[ 23 ]}

• يتعرف على أنواع مختلفة من PAMs، مما يتيح إمكانيات استهداف جديدة.
• ينتج نهايات لزجة بطول 4-5 نيوكليوتيدات، بدلاً من النهايات غير الحادة التي ينتجها Cas9، مما يعزز كفاءة الإدخالات الجينية والخصوصية أثناء NHEJ أو HDR.
• تستهدف القطع الحمض النووي بعيدًا عن PAM، بعيدًا عن موقع قطع Cas9، مما يتيح إمكانيات جديدة لقطع الحمض النووي.

ميزة	Cas9	Cas12a
بناء	يلزم وجود اثنين من الحمض النووي الريبي (أو نسخة اندماجية واحدة (crRNA+tracrRNA=sgRNA))	مطلوب واحد من ممرض التخدير المعتمد
آليات القطع	نهايات حادة	نهايات متداخلة
مواقع القطع	بالقرب من موقع التعرف	بعيد عن موقع التعرف
المواقع المستهدفة	PAM الغني بالجوانين	PAM الغني بالثايمين

من المرجح أن تكون إنزيمات Cas12 الداخلية قد تطورت في نهاية المطاف من إنزيم TnpB الداخلي الخاص بعناصر النقل IS200/IS605. إن إنزيم TnpB ، الذي لم يُدمج بعد في نظام المناعة CRISPR، قادرٌ على إجراء عملية قطع موجهة بواسطة الحمض النووي الريبي باستخدام نظام قالب OmegaRNA . ^{[ 24 ]}

تؤثر جوانب متعددة على كفاءة ودقة استهداف الحمض النووي الريبوزي الموجه (gRNA) عند استخدام تقنية كريسبر، بما في ذلك تصميم هذا الحمض. وقد طُوّرت العديد من نماذج التصميم وأدوات برمجية لتقنية كريسبر-كاس لتحقيق التصميم الأمثل لـ gRNA، ومنها: SgRNA designer وCRISPR MultiTargeter وSSFinder. ^{[ 25 ]} إضافةً إلى ذلك، تتوفر أجسام مضادة تجارية للكشف عن بروتين Cas12a. ^{[ 26 ]}