النمط المجاور للبروتوسبيسر

📅 آخر تحديث: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 1 صور
الموسوعة الحرة

النمط المجاور للبروتوسبيسر ( PAM ) هو تسلسل DNA يتكون من 2 إلى 6 أزواج قاعدية، ويقع مباشرةً بعد تسلسل DNA المستهدف بواسطة نوكلياز Cas9 في نظام المناعة التكيفية البكتيري CRISPR . [ 1 ] يُعد PAM مكونًا من مكونات الفيروس أو البلازميد الغازي، ولكنه غير موجود في جينوم البكتيريا المضيفة، وبالتالي فهو ليس مكونًا من مكونات موقع CRISPR البكتيري . لن يتمكن Cas9 من الارتباط بتسلسل DNA المستهدف أو قطعه بنجاح إذا لم يتبعه تسلسل PAM. [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] يُعد PAM مكونًا أساسيًا للاستهداف، فهو يميز DNA البكتيري الذاتي عن DNA غير الذاتي، مما يمنع استهداف موقع CRISPR وتدميره بواسطة النوكلياز المرتبط بـ CRISPR. [ 6 ]

الفواصل/الفواصل الأولية

في الجينوم البكتيري، تحتوي مواقع CRISPR على "فواصل" (حمض نووي فيروسي مُدرج في موقع CRISPR) والتي في أنظمة المناعة التكيفية من النوع الثاني تتكون من حمض نووي فيروسي أو بلازميدي غازي (يُسمى "بروتوسبيسر"). عند الغزو اللاحق، يرتبط نوكلياز مرتبط بـ CRISPR، مثل Cas9، بمركب tracrRNA – crRNA ، الذي يوجه Cas9 إلى تسلسل البروتوسبيسر الغازي. لكن Cas9 لن يقطع تسلسل البروتوسبيسر إلا إذا كان هناك تسلسل PAM مجاور. لن يحتوي الفاصل في مواقع CRISPR البكتيرية على تسلسل PAM، وبالتالي لن يقطعه النوكلياز، بينما سيحتوي البروتوسبيسر في الفيروس أو البلازميد الغازي على تسلسل PAM، وبالتالي سيقطعه نوكلياز Cas9. [ 4 ] في تطبيقات تحرير الجينوم ، يتم تصنيع حمض نووي ريبوزي أحادي السلسلة يُعرف باسم الحمض النووي الريبوزي الدليلي المفرد (sgRNA) ليؤدي وظيفة معقد tracrRNA–crRNA في التعرف على تسلسلات الجينات التي تحتوي على تسلسل PAM في الطرف 3' ، وبالتالي "توجيه" النيوكلياز إلى تسلسل محدد يكون النيوكلياز قادرًا على قطعه. [ 7 ] [ 8 ]

تسلسلات PAM

PAM وحجم مختلف نوكليازات الحمض النووي CRISPR

التسلسل PAM المتعارف عليه لـ Cas9 هو 5'-NGG-3'، حيث يمثل "N" أي قاعدة نووية متبوعة بقاعدتين نوويتين من الجوانين ("G"). [ 9 ] يمكن لـ sgRNAs نقل Cas9 إلى أي موقع في الجينوم لتعديل الجينات، ولكن لا يمكن إجراء أي تعديل في أي موقع آخر غير الموقع الذي يتعرف فيه Cas9 على PAM. يرتبط PAM المتعارف عليه بإنزيم Cas9 النيوكليازي لبكتيريا Streptococcus pyogenes (المسمى SpCas9)، بينما ترتبط PAMs مختلفة ببروتينات Cas9 لبكتيريا Neisseria meningitidis و Treponema denticola و Streptococcus thermophilus . [ 10 ] يمكن أن يكون 5'-NGA-3' تسلسل PAM غير متعارف عليه عالي الكفاءة للخلايا البشرية، ولكن تختلف كفاءته باختلاف موقع الجينوم. [ 11 ] بُذلت محاولات لهندسة بروتينات Cas9 للتعرف على تسلسلات PAM المختلفة بهدف تحسين قدرة تقنية CRISPR-Cas9 على تعديل الجينات في أي موقع مرغوب فيه على الجينوم. [ 12 ]

يتعرف إنزيم Cas9 الخاص ببكتيريا Francisella novicida على تسلسل PAM المتعارف عليه 5'-NGG-3'، ولكن تم تعديله هندسيًا ليتعرف على 5'-YG-3' (حيث يمثل "Y" بيريميدين [ 13 ] )، مما يوسع نطاق الأهداف المحتملة لإنزيم Cas9. [ 14 ] ويتعرف إنزيم Cpf1 النيوكليازي الخاص ببكتيريا Francisella novicida على تسلسل PAM 5'-TTTN-3' [ 15 ] أو 5'-YTN-3'. [ 16 ]

وبصرف النظر عن CRISPR-Cas9 و CRISPR-Cpf1، فمن المؤكد أن هناك العديد من النيوكليازات و PAMs التي لم يتم اكتشافها بعد. [ 17 ]

نظام CRISPR/Cas13a (المعروف سابقًا باسم C2c2 [ 18 ] )، المستخلص من بكتيريا Leptotrichia shahii، هو نظام CRISPR موجه بواسطة الحمض النووي الريبوزي (RNA)، يستهدف تسلسلات في الحمض النووي الريبوزي (RNA) بدلاً من الحمض النووي (DNA). لا يُعد تسلسل PAM ذا صلة بنظام CRISPR الذي يستهدف الحمض النووي الريبوزي (RNA)، على الرغم من أن وجود قاعدة غوانين مجاورة للهدف يؤثر سلبًا على فعاليته، وقد أُطلق عليه اسم "موقع مجاور للبروتوسبيسر" (PFS). [ 19 ]

GUIDE-Seq

تم ابتكار تقنية تُسمى GUIDE-Seq لتحليل الانقسامات غير المستهدفة الناتجة عن تعديل الجينات. [ 20 ] ويمكن استغلال شرط PAM لاستهداف الطفرات غير المتجانسة أحادية النوكليوتيد تحديدًا دون إحداث أي تأثيرات شاذة على الأليلات الطبيعية. [ 21 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ شاه، إس. أ.، إردمان، إس.، موجيكا، إف. ج.، غاريت، آر. أ. (2013). " أنماط التعرف على البروتوسبيسر: هويات مختلطة وتنوع وظيفي" . بيولوجيا الحمض النووي الريبي . 10 (5): 891-899 . doi : 10.4161/rna.23764 . PMC 3737346. PMID 23403393 .  
  2. ↑ موجيكا إف جيه، دييز-فيلاسينور سي، غارسيا-مارتينيز جيه، ألمندروس سي (2009). "تسلسلات الموتيف القصيرة تحدد أهداف نظام الدفاع CRISPR بدائيات النوى" . علم الأحياء الدقيقة . 155 (الجزء 3): 733-740 . doi : 10.1099/mic.0.023960-0 . PMID 19246744 . 
  3. ↑ شاه، س. أ.، إردمان، س.، موجيكا، ف. ج.، غاريت، ر. أ. (2013). " أنماط التعرف على البروتوسبيسر: هويات مختلطة وتنوع وظيفي" . بيولوجيا الحمض النووي الريبي . 10 (5): 891-899 . doi : 10.4161/rna.23764 . PMC 3737346. PMID 23403393. مؤرشف من الأصل في 2014-09-04.  
  4. 1 2 جينك م، تشيلينسكي ك، فونفارا إ، هاور م، دودنا ج.أ، شاربنتييه إ (2012). "إنزيم نووي داخلي قابل للبرمجة موجه بواسطة الحمض النووي الريبي المزدوج في المناعة البكتيرية التكيفية" . مجلة ساينس . 337 (6096): 816-821 . Bibcode : 2012Sci...337..816J . doi : 10.1126/science.1225829 . PMC 6286148. PMID 22745249 .  
  5. ↑ ستيرنبرغ إس إتش، ريدينغ إس، جينك إم، غرين إي سي، دودنا جيه إيه (2014). "استجواب الحمض النووي بواسطة إنزيم كاس9 الداخلي الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي بتقنية كريسبر" . مجلة نيتشر . 507 (7490): 62-67 . Bibcode : 2014Natur.507...62S . doi : 10.1038/nature13011 . PMC 4106473. PMID 24476820 .  
  6. ↑ مالي ب، إسفلت ك م، تشيرش ج م (2013). "كاس9 كأداة متعددة الاستخدامات لهندسة الأحياء" . نيتشر ميثودز . 10 (10): 957-963 . doi : 10.1038/ nmeth.2649 . PMC 4051438. PMID 24076990 .  
  7. ↑ مالي ب، يانغ ل، إسفلت ك م، آخ ج، غويل م، ديكارلو ج إ، نورفيل ج إ، تشيرش ج م (2013). "هندسة الجينوم البشري الموجهة بالحمض النووي الريبي عبر كاس9" . مجلة ساينس . 339 (6121): 823-826 . Bibcode : 2013Sci...339..823M . doi : 10.1126/science.1232033 . PMC 3712628. PMID 23287722 .  
  8. ↑ كونغ إل، ران إف إيه، كوكس دي، لين إس، باريتو آر، حبيب إن، هسو بي دي، وو إكس، جيانغ دبليو، مارافيني إل إيه، تشانغ إف (2013). "الهندسة الجينية المتعددة باستخدام أنظمة كريسبر/كاس" . مجلة ساينس . 339 (6121): 819-823 . Bibcode : 2013Sci...339..819C . doi : 10.1126 /science.1231143 . PMC 3795411. PMID 23287718 .  
  9. ↑ أندرس سي، نيوهونر أو، دورست أ، جينك إم (2014). "الأساس البنيوي للتعرف على الحمض النووي المستهدف بواسطة إنزيم Cas9 الداخلي المعتمد على PAM" . نيتشر . 513 ( 7519): 569-573 . Bibcode : 2014Natur.513..569A . doi : 10.1038/nature13579 . PMC 4176945. PMID 25079318 .  
  10. ↑ إسفلت كيه إم، مالي بي، براف جيه إل، موسبرنر إم، يونغ إس جيه، تشيرش جي إم (2013). " بروتينات Cas9 المتعامدة لتنظيم وتحرير الجينات الموجهة بالحمض النووي الريبي" . نيتشر ميثودز . 10 (11): 1116-1123 . doi : 10.1038/nmeth.2681 . PMC 3844869. PMID 24076762 .  
  11. ↑ Zhang Y, Ge X, Yang F, Zhang L, Zheng J, Tan X, Jin ZB, Qu J, Gu F (2014). "مقارنة بين تسلسلات PAM غير التقليدية لقطع الحمض النووي بواسطة CRISPR/Cas9 في الخلايا البشرية" . التقارير العلمية . 4 : 5405. Bibcode : 2014NatSR...4E5405Z . doi : 10.1038/srep05405 . PMC 4066725. PMID 24956376 .  
  12. ↑ كلاينستايفر بي بي، بريو إم إس، تساي إس كيو، توبكار في في، نغوين إن تي، تشنغ زد، غونزاليس إيه بي، لي زد، بيترسون آر تي، ييه جيه آر، أري إم جيه، جونغ جيه كيه (2015). " إنزيمات نوكلياز CRISPR-Cas9 المُهندسة ذات خصائص PAM مُعدلة" . مجلة نيتشر . 523 (7561): 481-485 . Bibcode : 2015Natur.523..481K . doi : 10.1038/nature14592 . PMC 4540238. PMID 26098369 .  
  13. ↑ "الرموز النيوكليوتيدية، ورموز الأحماض الأمينية، والرموز الوراثية" . KEGG: موسوعة كيوتو للجينات والمجينات. 15 يوليو 2014. تاريخ الاسترجاع : 6 أبريل 2016 .
  14. ^ هيرانو إتش، جوتنبرج جي إس، هوري تي، أبودييه أو، كيمورا إم، هسو بي دي، ناكان تي، إيشيتاني آر، هاتادا الأول، تشانغ إف، نيشيماسو إتش، نوريكي أو (2016). "هيكل وهندسة فرانسيسيلا نوفيسيدا Cas9" . خلية . 164 (5): 950-961 . دوى : 10.1016/j.cell.2016.01.039 . بمك 4899972 . بميد 26875867 .  
  15. ↑ زيتشه ب، غوتنبرغ جيه إس، أبو دية أو أو، سلايميكر آي إم، ماكاروفا كيه إس، إسليتزبيشلر ب، فولز إس إي، يونغ جيه، فان دير أوست جيه، ريغيف أ، كونين إي في، تشانغ إف (2015). "Cpf1 هو إنزيم نووي داخلي موجه بواسطة الحمض النووي الريبي من النوع الثاني لنظام CRISPR-Cas" . مجلة Cell . 163 (3): 759-771 . doi : 10.1016/j.cell.2015.09.038 . PMC 4638220. PMID 26422227 .  
  16. ↑ فونفارا، آي.، ريختر، إتش.، براتوفيتش، إم.، لو رون، إيه.، شاربنتييه، إي. (2016). "إنزيم Cpf1، وهو إنزيم قاطع للحمض النووي مرتبط بتقنية كريسبر، يعالج أيضًا الحمض النووي الريبوزي الأولي لتقنية كريسبر". مجلة نيتشر . 532 (7600): 517-521 . Bibcode : 2016Natur.532..517F . doi : 10.1038/nature17945 . PMID: 27096362. S2CID : 2271552 .  
  17. ↑ "حتى تقنية كريسبر" . مجلة الإيكونوميست . الرقم الدولي الموحد للدوريات 0013-0613 . تاريخ الاسترجاع: 27-05-2016 . 
  18. ↑ شماكوف إس، وآخرون (2017). " تنوع وتطور أنظمة CRISPR-Cas من الفئة 2" . مجلة نات. ريف. ميكروبيول. 15 (3): 169-182 . doi : 10.1038/nrmicro.2016.184 . PMC 5851899. PMID 28111461 .   
  19. ↑ أبو دية، أو. أو.، غوتنبرغ، ج. س.، كونرمان، س.، يونغ، ج.، سلايميكر، إ. م.، كوكس، د. ب.، شماكوف، س.، ماكاروفا، ك. س.، سيمينوفا، إ.، ميناخين، ل.، سيفيرينوف، ك.، ريغيف، أ.، لاندر، إ. س.، كونين، إ. ف.، تشانغ، ف. (2016). "C2c2 هو مُؤثِّر CRISPR أحادي المكون قابل للبرمجة ومُوجَّه بواسطة الحمض النووي الريبي، يستهدف الحمض النووي الريبي" . مجلة ساينس . 353 (6299) aaf5573. doi : 10.1126 /science.aaf5573 . PMC 5127784. PMID 27256883 .  
  20. ↑ تساي إس كيو، تشنغ زد، نغوين إن تي، ليبرز إم، توبكار في في، ثابار في، ويفيكنز إن، خايتر سي، إيافرات إيه جيه، لي إل بي، أري إم جيه، جونغ جيه كيه (2015). "تقنية GUIDE-seq تُمكّن من تحديد خصائص الجينوم الكامل للانقسام غير المستهدف بواسطة نواة CRISPR-Cas" . مجلة Nature Biotechnology . 33 (2): 187-197 . doi : 10.1038/nbt.3117 . PMC 4320685. PMID 25513782 .  
  21. ↑ لي واي، منديراتا إس، إيرهاردت كيه، كاشياب إن، وايت إم إيه، بليريس إل (2016). "استغلال قيد PAM في تقنية CRISPR/Cas9 لتدخلات حل النوكليوتيدات المفردة" . PLoS One . 11 (1) e0144970. Bibcode : 2016PLoSO..1144970L . doi : 10.1371/journal.pone.0144970 . PMC 4720446. PMID 26788852 .