الترسيب المناعي

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 2 صور
الموسوعة الحرة

الترسيب المناعي ( IP ) هو تقنية لترسيب مستضد بروتيني من المحلول باستخدام جسم مضاد يرتبط تحديدًا بهذا البروتين. يمكن استخدام هذه العملية لعزل وتركيز بروتين معين من عينة تحتوي على آلاف البروتينات المختلفة. يتطلب الترسيب المناعي ربط الجسم المضاد بركيزة صلبة في مرحلة ما من العملية.

الأنواع

الترسيب المناعي للبروتين الفردي (IP)

تتضمن هذه التقنية استخدام جسم مضاد متخصص لبروتين معروف لعزل هذا البروتين تحديدًا من محلول يحتوي على العديد من البروتينات المختلفة. غالبًا ما تكون هذه المحاليل على شكل مستخلص خام من نسيج نباتي أو حيواني. قد تشمل أنواع العينات الأخرى سوائل الجسم أو عينات أخرى ذات أصل بيولوجي.

الترسيب المناعي لمركب البروتين (Co-IP)

يُعرف الترسيب المناعي للمركبات البروتينية الكاملة (أي المستضد مع أي بروتينات أو روابط مرتبطة به) باسم الترسيب المناعي المشترك (Co-IP). يعمل هذا الأسلوب عن طريق اختيار جسم مضاد يستهدف بروتينًا معروفًا يُعتقد أنه جزء من مركب بروتيني أكبر. باستهداف هذا البروتين المعروف بجسم مضاد، يُمكن استخلاص المركب البروتيني بأكمله من المحلول، وبالتالي تحديد البروتينات غير المعروفة في هذا المركب.

تنجح هذه الطريقة عندما ترتبط البروتينات المكونة للمركب ببعضها البعض بقوة، مما يُتيح سحب عدة بروتينات من المحلول عن طريق الارتباط بأحدها باستخدام جسم مضاد. يُشار إلى هذه الطريقة لسحب المركبات البروتينية من المحلول أحيانًا باسم "السحب". يُعدّ الترسيب المناعي المشترك (Co-IP) تقنية فعّالة يستخدمها علماء الأحياء الجزيئية بانتظام لتحليل التفاعلات بين البروتينات .

  • غالباً ما ينتقي جسم مضاد معين مجموعة فرعية من البروتين المستهدف الذي يكون فيه الجزء المستضدي مكشوفاً، وبالتالي يفشل في تحديد أي بروتينات في مركبات تحجب هذا الجزء. ويتضح ذلك من ندرة إمكانية ترسيب حتى نصف بروتين معين من عينة باستخدام جسم مضاد واحد، حتى عند استخدام كمية كبيرة منه.
  • مع استمرار جولات الاستهداف والترسيب المناعي، قد يستمر عدد البروتينات المُحددة في الازدياد. وقد لا تتواجد هذه البروتينات في مُركب واحد في أي وقت، بل قد تُمثل شبكة من البروتينات تتفاعل مع بعضها البعض في أوقات مختلفة ولأغراض مُختلفة.
  • تتيح إعادة التجربة باستهداف أعضاء مختلفين من المركب البروتيني للباحث التحقق من النتائج. ينبغي أن تُسفر كل جولة من عمليات الترسيب المناعي عن استعادة كل من البروتين الأصلي المعروف، بالإضافة إلى أعضاء آخرين سبق تحديدهم من المركب (وحتى أعضاء إضافية جديدة). من خلال تكرار الترسيب المناعي بهذه الطريقة، يتحقق الباحث من صحة كل عضو تم تحديده من المركب البروتيني. إذا لم يُمكن استعادة بروتين معين إلا باستهداف أحد الأعضاء المعروفة دون غيرها، فقد يُثار التساؤل حول انتماء هذا البروتين إلى المركب.

الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

سير عمل تسلسل ChIP

يُعدّ ترسيب الكروماتين المناعي (ChIP) طريقةً تُستخدم لتحديد مواقع ارتباط الحمض النووي (DNA) على الجينوم لبروتين مُحدد . تُتيح هذه التقنية فهمًا لتفاعلات البروتين مع الحمض النووي التي تحدث داخل نواة الخلايا أو الأنسجة الحية. وتُعدّ طبيعة هذه الطريقة داخل الجسم الحي مُغايرةً للطرق الأخرى المُستخدمة تقليديًا للإجابة عن نفس الأسئلة.

يقوم مبدأ هذا التحليل على إمكانية ربط البروتينات الرابطة للحمض النووي (بما في ذلك عوامل النسخ والهستونات ) في الخلايا الحية بالحمض النووي الذي ترتبط به. وباستخدام جسم مضاد متخصص ببروتين رابط للحمض النووي، يمكن ترسيب معقد البروتين-الحمض النووي من مستخلصات الخلايا. غالبًا ما يتم الربط بتطبيق الفورمالديهايد على الخلايا (أو الأنسجة)، مع أنه يُفضل أحيانًا استخدام رابط أكثر تحديدًا وثباتًا مثل ثنائي ميثيل 3،3′-ثنائي ثيو ثنائي بروبيونيميدات-2 هيدروكلوريد (DTBP). [ 1 ] بعد الربط، تُحلل الخلايا ويُكسر الحمض النووي إلى قطع يتراوح طولها بين 0.2 و1.0 كيلوبايت باستخدام الموجات فوق الصوتية . عند هذه المرحلة، يُجرى الترسيب المناعي، مما يؤدي إلى تنقية معقدات البروتين-الحمض النووي. تُسخّن معقدات البروتين-DNA المنقاة لعكس عملية الربط المتبادل بالفورمالديهايد بين البروتين وDNA، مما يسمح بفصل DNA عن البروتينات. بعد ذلك، يُمكن تحديد هوية وكمية شظايا DNA المعزولة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتمثل قيد إجراء تفاعل PCR على الشظايا المعزولة في ضرورة معرفة المنطقة الجينومية المستهدفة لتوليد بادئات PCR الصحيحة. أحيانًا، يُتجاوز هذا القيد ببساطة عن طريق استنساخ DNA الجينومي المعزول في ناقل بلازميدي ، ثم استخدام بادئات خاصة بمنطقة الاستنساخ في ذلك الناقل. بدلاً من ذلك، عند الرغبة في تحديد مواقع ارتباط البروتين على نطاق الجينوم، يُستخدم تسلسل ChIP، الذي برز مؤخرًا كتقنية قياسية لتحديد مواقع ارتباط البروتين بكفاءة عالية وتكلفة منخفضة، مما يسمح أيضًا بتوصيف السيستروم . في السابق، استُخدمت أيضًا مصفوفة DNA الدقيقة ( ChIP-on-chip أو ChIP-chip ).

الترسيب المناعي للبروتين النووي الريبوزي (RIP و CLIP)

تُستخدم تقنيتا RIP وCLIP لتنقية بروتين مُحدد يرتبط بالحمض النووي الريبوزي (RNA) بهدف تحديد جزيئات الحمض النووي الريبوزي المرتبطة به، وبالتالي دراسة البروتينات النووية الريبوزية (RNPs). [ 2 ] [ 3 ] في تقنية RIP ، تُستخلص جزيئات الحمض النووي الريبوزي المُنقاة معًا، وتُقارن نسبة تركيزها مع عينة ضابطة، والتي كانت تُجرى في الأصل باستخدام تقنية المصفوفات الدقيقة أو تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) . أما في تقنية CLIP ، فتُربط الخلايا بالأشعة فوق البنفسجية قبل تحللها، ثم تُجرى عليها خطوات تنقية إضافية تتجاوز الترسيب المناعي القياسي، وتشمل تجزئة جزئية للحمض النووي الريبوزي، وغسلًا بمحلول ملحي عالي التركيز، وفصلًا باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي SDS-PAGE، ونقلًا عبر الغشاء، وتحديد مواقع ارتباط الحمض النووي الريبوزي المباشرة عن طريق تسلسل الحمض النووي المكمل (cDNA) .

البروتينات الموسومة

اختبار سحب البروتين باستخدام البروتينات الموسومة

إحدى العقبات التقنية الرئيسية في الترسيب المناعي هي صعوبة إنتاج جسم مضاد يستهدف بروتينًا واحدًا معروفًا على وجه التحديد. وللتغلب على هذه العقبة، تقوم العديد من المجموعات البحثية بهندسة علامات على الطرف الكربوكسيلي أو الأميني للبروتين المستهدف. وتكمن الميزة هنا في إمكانية استخدام العلامة نفسها مرارًا وتكرارًا على العديد من البروتينات المختلفة، كما يمكن للباحث استخدام الجسم المضاد نفسه في كل مرة. إن مزايا استخدام البروتينات الموسومة كبيرة لدرجة أن هذه التقنية أصبحت شائعة في جميع أنواع الترسيب المناعي، بما في ذلك جميع أنواع الترسيب المناعي المذكورة أعلاه. ومن أمثلة العلامات المستخدمة: علامة البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، وعلامة ناقلة الغلوتاثيون-S (GST)، وعلامة FLAG . ورغم أن استخدام العلامة لتمكين عملية الترسيب المناعي يُعدّ مريحًا، إلا أنه يثير بعض المخاوف بشأن الأهمية البيولوجية، لأن العلامة نفسها قد تحجب التفاعلات الطبيعية أو تُدخل تفاعلات جديدة وغير طبيعية.

طُرق

الطريقتان العامتان للترسيب المناعي هما طريقة الالتقاط المباشر وطريقة الالتقاط غير المباشر.

مباشر

تُثبّت الأجسام المضادة المتخصصة ببروتين معين (أو مجموعة بروتينات) على ركيزة صلبة، مثل حبيبات مغناطيسية فائقة أو حبيبات أجاروز مجهرية (غير مغناطيسية). ثم تُضاف الحبيبات المرتبطة بالأجسام المضادة إلى مزيج البروتينات، فتُلتقط البروتينات المستهدفة بواسطة الأجسام المضادة على الحبيبات؛ أي أنها تُرسّب مناعيًا.

غير مباشر

تُضاف الأجسام المضادة المُخصصة لبروتين مُعين، أو مجموعة من البروتينات، مباشرةً إلى مزيج البروتين. لم تُثبّت الأجسام المضادة بعد على دعامة صلبة. تكون الأجسام المضادة حرة الحركة في مزيج البروتين وترتبط بأهدافها. مع مرور الوقت، تُضاف حبيبات مُغطاة ببروتين A/G إلى مزيج الأجسام المضادة والبروتين. عند هذه المرحلة، تلتصق الأجسام المضادة، المرتبطة الآن بأهدافها، بالحبيبات.

من هذه النقطة فصاعدًا، تتقارب البروتوكولات المباشرة وغير المباشرة لأن العينات تحتوي الآن على نفس المكونات. وتعطي كلتا الطريقتين نفس النتيجة النهائية، حيث يرتبط البروتين أو معقدات البروتين بالأجسام المضادة التي بدورها مثبتة على الخرز.

اختيار

يُفضّل أحيانًا استخدام الطريقة غير المباشرة عندما يكون تركيز البروتين المستهدف منخفضًا أو عندما تكون ألفة الجسم المضاد للبروتين ضعيفة. كما تُستخدم هذه الطريقة عندما تكون حركية ارتباط الجسم المضاد بالبروتين بطيئة لأسباب مختلفة. في معظم الحالات، تُعدّ الطريقة المباشرة هي الخيار الافتراضي والمفضّل.

التقدم التكنولوجي

الأغاروز

تاريخيًا، كان الدعم الصلب المستخدم في الترسيب المناعي من قبل غالبية العلماء عبارة عن حبيبات أجاروز عالية المسامية (تُعرف أيضًا باسم راتنجات أو معلقات الأجاروز). وتكمن ميزة هذه التقنية في قدرتها العالية جدًا على الارتباط، حيث أن البنية الإسفنجية لجزيء الأجاروز (  بحجم يتراوح بين 50 و150 ميكرومتر) متاحة بالكامل تقريبًا لارتباط الأجسام المضادة (التي بدورها سترتبط بالبروتينات المستهدفة)، بالإضافة إلى إمكانية استخدام معدات المختبر القياسية لجميع جوانب بروتوكول الترسيب المناعي دون الحاجة إلى أي معدات متخصصة. ويجب الموازنة بعناية بين ميزة القدرة العالية جدًا على الارتباط وكمية الأجسام المضادة التي سيستخدمها الباحث لتغطية حبيبات الأجاروز. نظرًا لأن الأجسام المضادة قد تُشكل عاملًا مُحددًا للتكلفة، فمن الأفضل حساب الكمية المطلوبة عكسيًا، بدءًا من كمية البروتين المراد استخلاصها (بحسب التحليل المُزمع إجراؤه لاحقًا)، وصولًا إلى كمية الأجسام المضادة اللازمة لربط تلك الكمية من البروتين (مع إضافة كمية زائدة بسيطة لتعويض أي قصور في النظام)، ثم حساب الكمية المطلوبة من الأغاروز لربط تلك الكمية من الأجسام المضادة. في الحالات التي لا تتطلب تشبعًا بالأجسام المضادة، تُعد هذه التقنية فريدة من نوعها في قدرتها على استخلاص كميات هائلة من البروتينات المستهدفة. لكن تجدر الإشارة إلى أن "ميزة السعة العالية" قد تتحول إلى "عيب في السعة العالية" يظهر عندما لا تُشبع خرزات السيفاروز /الأغاروز ذات السعة الهائلة للارتباط بالأجسام المضادة بشكل كامل. في كثير من الأحيان، تكون كمية الأجسام المضادة المتاحة للباحث في تجربة الترسيب المناعي أقل من كافية لتشبع خرزات الأغاروز المستخدمة في الترسيب المناعي. في هذه الحالات، قد يحصل الباحث على جزيئات أجاروز مغلفة جزئيًا فقط بالأجسام المضادة، وبالتالي يصبح الجزء غير المغلف من قدرة ارتباط خرزات الأجاروز بالأجسام المضادة حرًا في الارتباط بأي شيء آخر، مما يؤدي إلى ارتفاع إشارة الخلفية نتيجة الارتباط غير النوعي لمكونات المستخلص بالخرزات، الأمر الذي قد يُصعّب تفسير البيانات. بينما قد يجادل البعض بأنه من الحكمة، لهذه الأسباب، مطابقة كمية الأجاروز (من حيث قدرة الارتباط) مع كمية الأجسام المضادة المراد ربطها بعملية الترسيب المناعي، إلا أن إحدى الطرق البسيطة لتقليل مشكلة الارتباط غير النوعي بخرزات الأجاروز وزيادة النوعية هي تنقية المستخلص مسبقًا، وهو أمر يُوصى به بشدة في أي عملية ترسيب مناعي. [ 4 ] [ 5 ]

التخليص المسبق

تُعدّ المستخلصات الخلوية مزيجًا معقدًا من البروتينات والدهون والكربوهيدرات والأحماض النووية، ومن المتوقع حدوث قدر من الارتباط غير النوعي مع الأجسام المضادة المستخدمة في الترسيب المناعي، أو البروتين A/G، أو الدعامة الخرزية، مما قد يؤثر سلبًا على كشف الهدف (الأهداف) المُرسب مناعيًا. في معظم الحالات، يُعدّ تنقية المستخلص الخلوي مسبقًا في بداية كل تجربة ترسيب مناعي (انظر الخطوة 2 في قسم "البروتوكول" أدناه) [ 6 ] وسيلةً لإزالة المكونات التي قد تتفاعل مع المستخلص الخلوي قبل الترسيب المناعي، وذلك لمنع ارتباط هذه المكونات غير النوعي بالخرز أو الأجسام المضادة المستخدمة في الترسيب المناعي. يرد أدناه وصفٌ لإجراء التنقية المسبقة الأساسي، حيث يُحضن المستخلص مع الخرز فقط، ثم يُزال ويُتخلص منه قبل الترسيب المناعي. [ 6 ] مع ذلك، لا يأخذ هذا النهج في الحسبان الارتباط غير النوعي مع الأجسام المضادة المستخدمة في الترسيب المناعي، والذي قد يكون كبيرًا. لذا، تتمثل إحدى الطرق البديلة للتنقية المسبقة في حضانة مزيج البروتين مع نفس المكونات المستخدمة في الترسيب المناعي، باستثناء استخدام جسم مضاد غير مستهدف وغير ذي صلة من نفس الفئة الفرعية للجسم المضاد المستخدم في الترسيب المناعي، بدلاً من الجسم المضاد المستخدم في الترسيب المناعي نفسه. [ 5 ] تحاول هذه الطريقة استخدام ظروف ومكونات مشابهة قدر الإمكان لتلك المستخدمة في الترسيب المناعي الفعلي، وذلك لإزالة أي مكون خلوي غير محدد دون التقاط البروتين المستهدف (إلا إذا ارتبط البروتين المستهدف بشكل غير محدد بمكون آخر من مكونات الترسيب المناعي، وهو ما يجب التحقق منه بدقة من خلال تحليل الخرزات المستخدمة في التنقية المسبقة للمستخلص). بعد ذلك، يمكن ترسيب البروتين المستهدف مناعيًا مع تقليل خطر تداخل الارتباط غير المحدد مع تفسير البيانات.

خرز فائق المغناطيسية

على الرغم من أن الغالبية العظمى من عمليات الترسيب المناعي تُجرى باستخدام خرزات الأغاروز، إلا أن استخدام الخرزات فائقة المغناطيسية يُعدّ نهجًا حديثًا يكتسب شعبية متزايدة كبديل لخرزات الأغاروز في تطبيقات الترسيب المناعي. وعلى عكس الأغاروز، فإن الخرزات المغناطيسية صلبة وقد تكون كروية الشكل، وذلك بحسب نوع الخرزة، ويقتصر ارتباط الأجسام المضادة على سطح كل خرزة. وبينما تفتقر هذه الخرزات إلى ميزة المركز المسامي الذي يزيد من قدرة الارتباط، إلا أن الخرزات المغناطيسية أصغر حجمًا بكثير من خرزات الأغاروز (من 1 إلى 4  ميكرومتر)، كما أن العدد الأكبر من الخرزات المغناطيسية لكل وحدة حجم مقارنةً بخرزات الأغاروز مجتمعةً، يمنح الخرزات المغناطيسية نسبة فعّالة بين مساحة السطح والحجم، مما يُحقق ارتباطًا مثاليًا للأجسام المضادة.

يمكن تصنيف الخرز المغناطيسي المتوفر تجاريًا، بناءً على تجانس حجمه، إلى خرز أحادي التشتت وخرز متعدد التشتت . يتميز الخرز أحادي التشتت، والذي يُسمى أيضًا بالخرز الميكروبي، بتجانس تام، ولذلك تتشابه جميع الخرزات في خصائصها الفيزيائية، بما في ذلك قدرة الارتباط ومستوى انجذابها للمغناطيس. أما الخرز متعدد التشتت، فرغم تشابهه في الحجم مع الخرز أحادي التشتت، إلا أنه يُظهر تباينًا واسعًا في الحجم (من 1 إلى 4  ميكرومتر) مما قد يؤثر على قدرة ارتباطه والتقاطه المغناطيسي. على الرغم من توفر كلا النوعين من الخرز تجاريًا لتطبيقات الترسيب المناعي، إلا أن الخرز فائق المغناطيسية أحادي التشتت عالي الجودة يُعدّ مثاليًا للبروتوكولات الآلية نظرًا لثبات حجمه وشكله وأدائه. تُقدم العديد من الشركات، بما في ذلك Invitrogen و Thermo Scientific و Millipore ، الخرز فائق المغناطيسية أحادي التشتت ومتعدد التشتت .

الأجاروز مقابل الخرز المغناطيسي

يدّعي مؤيدو استخدام الخرز المغناطيسي أن هذه الخرزات تُظهر معدل ارتباط أسرع بالبروتين [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] مقارنةً بخرز الأغاروز في تطبيقات الترسيب المناعي، على الرغم من أن عمليات الترسيب المناعي القياسية القائمة على خرز الأغاروز قد أُجريت في غضون ساعة واحدة. [ 5 ] كما يُزعم أن الخرز المغناطيسي أفضل لترسيب معقدات البروتين الكبيرة جدًا نظرًا لعدم وجود حد أقصى لحجم هذه المعقدات، [ 7 ] [ 8 ] [ 10 ] مع أنه لا يوجد دليل موضوعي يدعم هذا الادعاء. تُقلل تقنية الخرز المغناطيسي من التعامل مع العينات [ 8 ] نظرًا لانخفاض الإجهاد الفيزيائي الواقع على العينات أثناء الفصل المغناطيسي مقارنةً بالطرد المركزي المتكرر عند استخدام الأغاروز، مما قد يُسهم بشكل كبير في زيادة إنتاج معقدات البروتين غير المستقرة (الهشة). [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] ومع ذلك، ينبغي مراعاة عوامل إضافية، مثل قدرة الربط، وتكلفة الكاشف، ومتطلبات المعدات الإضافية، والقدرة على أتمتة عمليات الترسيب المناعي، عند اختيار دعامة الترسيب المناعي.

القدرة على الإلزام

يمكن لمؤيدي كل من حبيبات الأغاروز والحبيبات المغناطيسية مناقشة ما إذا كان الاختلاف الكبير في قدرات الارتباط بين النوعين يرجح كفة أحدهما. عند المقارنة المباشرة، تتميز حبيبات الأغاروز بمساحة سطح أكبر بكثير، وبالتالي قدرة ارتباط أعلى من الحبيبات المغناطيسية، وذلك بفضل حجمها الكبير وبنيتها الإسفنجية. إلا أن تباين حجم مسام الأغاروز قد يفرض حدًا أقصى محتملًا للحجم، مما قد يؤثر على ارتباط البروتينات أو المركبات البروتينية الكبيرة جدًا بمواقع الارتباط الداخلية. ولذلك، قد تكون الحبيبات المغناطيسية أنسب من حبيبات الأغاروز لترسيب البروتينات أو المركبات البروتينية الكبيرة مناعيًا، على الرغم من عدم وجود أدلة مقارنة مستقلة تثبت أيًا من الحالتين.

يرى البعض أن قدرة الارتباط الأكبر بكثير لخرزات الأغاروز قد تكون عيبًا نظرًا لزيادة احتمالية الارتباط غير النوعي. بينما يفضل آخرون استخدام الخرزات المغناطيسية نظرًا للكمية الأكبر من الأجسام المضادة اللازمة لتشبع قدرة الارتباط الكلية لخرزات الأغاروز، وهو ما يُعدّ عيبًا اقتصاديًا واضحًا لاستخدام الأغاروز. ورغم صحة هذه الحجج خارج سياق استخدامها العملي، إلا أن هذه المغالطات تتجاهل جانبين أساسيين من مبدأ الترسيب المناعي، مما يُثبت أن اختيار استخدام خرزات الأغاروز أو الخرزات المغناطيسية لا يعتمد فقط على قدرة الارتباط.

أولًا، لا يقتصر الارتباط غير النوعي على مواقع ارتباط الأجسام المضادة على الدعامة المثبتة؛ إذ يمكن لأي سطح من أسطح الجسم المضاد أو أي مكون من مكونات تفاعل الترسيب المناعي أن يرتبط بمكونات المحلول غير النوعية، وبالتالي سيستمر الارتباط غير النوعي حتى عند استخدام خرزات مشبعة تمامًا. لهذا السبب، من المهم تنقية العينة مسبقًا قبل إجراء الترسيب المناعي.

ثانيًا، تعتمد القدرة على التقاط البروتين المستهدف بشكل مباشر على كمية الأجسام المضادة المثبتة المستخدمة، وبالتالي، عند المقارنة المباشرة بين الترسيب المناعي باستخدام الأغاروز والخرز المغناطيسي، فإن أقصى كمية من البروتين التي يمكن لأي من الدعامات التقاطها محدودة بكمية الأجسام المضادة المضافة. لذا، فإن قرار تشبيع أي نوع من الدعامات يعتمد على كمية البروتين المطلوبة، كما هو موضح أعلاه في قسم الأغاروز من هذه الصفحة.

يكلف

يُعدّ سعر استخدام أيٍّ من نوعي الدعم عاملاً حاسماً في اختيار الأغاروز أو الخرز المغناطيسي لتطبيقات الترسيب المناعي. قد يُوحي حسابٌ سريعٌ لتكلفة الخرز المغناطيسي مقارنةً بخرز السيفاروز بأنّ خرز السيفاروز أقلّ تكلفةً. ولكن قد يكون سعر الخرز المغناطيسي منافساً لسعر الأغاروز في عمليات الترسيب المناعي على نطاقٍ تحليليّ، وذلك بحسب طريقة الترسيب المناعي المستخدمة وحجم الخرز المطلوب لكل تفاعل.

باستخدام طريقة الترسيب المناعي التقليدية الموضحة أدناه، حيث تُضاف جميع المكونات إلى أنبوب أثناء تفاعل الترسيب المناعي، تتطلب خصائص التعامل الفيزيائي مع حبيبات الأغاروز حدًا أدنى من الحبيبات لكل تجربة ترسيب مناعي (عادةً ما يتراوح حجمها بين 25 و50  ميكرولتر لكل تجربة). ويعود ذلك إلى ضرورة تركيز حبيبات السيفاروز في قاع الأنبوب عن طريق الطرد المركزي، وإزالة السائل الطافي بعد كل عملية حضانة أو غسل، وما إلى ذلك. وهذا يفرض قيودًا فيزيائية صارمة على العملية، إذ  يصعب، إن لم يستحيل، تحديد رواسب حبيبات الأغاروز التي يقل حجمها عن 25 إلى 50 ميكرولتر بصريًا في قاع الأنبوب. أما مع الحبيبات المغناطيسية، فلا يوجد حد أدنى من الحبيبات المطلوبة نظرًا لإمكانية التعامل معها مغناطيسيًا، وبالتالي، اعتمادًا على المستضد المستهدف والأجسام المضادة المستخدمة في الترسيب المناعي، يُمكن استخدام كمية أقل بكثير من الحبيبات المغناطيسية.

في المقابل، يمكن استخدام أعمدة الطرد المركزي بدلاً من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة العادية لتقليل كمية خرز الأغاروز المطلوبة لكل تفاعل بشكل ملحوظ. تحتوي أعمدة الطرد المركزي على مرشح يسمح بمرور جميع مكونات الترسيب المناعي باستثناء الخرز باستخدام عملية طرد مركزي قصيرة، وبالتالي توفر طريقة لاستخدام كمية أقل بكثير من خرز الأغاروز مع الحد الأدنى من الفاقد.

معدات

كما ذُكر سابقًا، لا يتطلب استخدام خرز الأغاروز في تطبيقات الترسيب المناعي سوى معدات المختبرات القياسية، بينما تتطلب تفاعلات الترسيب المناعي القائمة على الخرز المغناطيسي مغناطيسات عالية الطاقة. ورغم أن تكلفة معدات الالتقاط المغناطيسي قد تكون باهظة، إلا أن إنجاز عمليات الترسيب المناعي بسرعة باستخدام الخرز المغناطيسي قد يكون خيارًا مجديًا من الناحية المالية عند التقدم بطلبات للحصول على المنح، إذ أن بروتوكولًا مدته 30 دقيقة باستخدام الخرز المغناطيسي، مقارنةً بالحضانة الليلية عند 4  درجات مئوية باستخدام خرز الأغاروز، قد يُسفر عن الحصول على بيانات أكثر في وقت أقصر. [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]

الأتمتة

من المزايا الإضافية لاستخدام الخرز المغناطيسي توفر أجهزة الترسيب المناعي الآلية على نطاق أوسع. لا تقتصر فوائد هذه الأجهزة على تقليل الجهد والوقت اللازمين لإجراء الترسيب المناعي فحسب، بل يمكن استخدامها أيضًا في التطبيقات ذات الإنتاجية العالية .

ملخص

على الرغم من أن من بين الفوائد الواضحة لاستخدام الخرز المغناطيسي زيادة سرعة التفاعل، ومعالجة العينات بلطف، وإمكانية التشغيل الآلي، إلا أن اختيار استخدام الأغاروز أو الخرز المغناطيسي بناءً على قدرة ارتباط الوسط الداعم وتكلفة المنتج قد يعتمد على البروتين المراد دراسته وطريقة الترسيب المناعي المستخدمة. وكما هو الحال مع جميع التحليلات، فإن الاختبارات التجريبية ضرورية لتحديد الطريقة الأمثل لتطبيق معين.

بروتوكول

خلفية

بعد اختيار تقنية الخرز ذي الركيزة الصلبة، تُربط الأجسام المضادة بالخرز، ثم يُضاف الخرز المغطى بالأجسام المضادة إلى عينة البروتين غير المتجانسة (مثل الأنسجة المتجانسة). عند هذه المرحلة، ترتبط الأجسام المضادة المثبتة على الخرز بالبروتينات التي تتعرف عليها تحديدًا. بمجرد حدوث ذلك، يكون جزء الترسيب المناعي من البروتوكول قد اكتمل، حيث ترتبط البروتينات المستهدفة بالأجسام المضادة المثبتة بدورها على الخرز. يُعد فصل المعقدات المناعية عن المستخلص سلسلة من الخطوات بالغة الأهمية، إذ يجب أن تبقى البروتينات مرتبطة ببعضها (في حالة الترسيب المناعي المشترك) ومرتبطة بالأجسام المضادة أثناء خطوات الغسل لإزالة البروتينات غير المرتبطة وتقليل التشويش.

عند العمل مع خرز الأغاروز، يجب فصل الخرز عن العينة عن طريق تدويره لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي بقوة تتراوح بين 600 و3000 ضعف قوة الجاذبية الأرضية. يمكن إجراء هذه الخطوة في أنبوب طرد مركزي صغير قياسي، ولكن لتحقيق فصل أسرع، وتجانس أكبر، واستخلاص أعلى، تُجرى العملية غالبًا في أعمدة طرد مركزي صغيرة ذات مسام تسمح بمرور السائل دون خرز الأغاروز. بعد الطرد المركزي، يتجمع خرز الأغاروز على شكل راسب هشّ في قاع الأنبوب. يُزال السائل الطافي المحتوي على الشوائب بعناية دون التأثير على الخرز. ثم يُضاف محلول الغسل إلى الخرز، وبعد الخلط، يُفصل الخرز مرة أخرى بالطرد المركزي.

باستخدام الخرز فائق المغناطيسية، توضع العينة في مجال مغناطيسي لتتجمع الخرزات على جدار الأنبوب. تستغرق هذه العملية عادةً حوالي 30 ثانية، ثم يُسحب السائل المتبقي (غير المرغوب فيه) باستخدام ماصة. تتم عملية الغسل بإعادة تعليق الخرزات (بعيدًا عن المغناطيس) في محلول الغسل، ثم تركيز الخرزات مرة أخرى على جدار الأنبوب (بإعادة الأنبوب إلى المغناطيس). تُكرر عملية الغسل عادةً عدة مرات لضمان إزالة الملوثات بشكل كامل. إذا كانت الخرزات فائقة المغناطيسية متجانسة الحجم، وكان المغناطيس مصممًا بشكل صحيح، فسوف تتركز الخرزات بشكل موحد على جدار الأنبوب، ويمكن إزالة محلول الغسل بسهولة وبشكل كامل.

بعد الغسل، يتم استخلاص البروتين (أو البروتينات) المترسبة وتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي ، أو مطياف الكتلة ، أو التلطيخ الغربي ، أو أي عدد من الطرق الأخرى لتحديد مكونات المركب. تختلف أوقات بروتوكول الترسيب المناعي اختلافًا كبيرًا نظرًا لعوامل متعددة، حيث تزداد هذه الأوقات مع ازدياد عدد مرات الغسل اللازمة أو مع بطء حركية التفاعل في حبيبات الأغاروز المسامية.

خطوات

  1. قم بتحليل الخلايا وتحضير العينة للترسيب المناعي.
  2. قم بتنظيف العينة مسبقًا عن طريق تمرير العينة فوق الخرز وحده أو المرتبط بجسم مضاد غير ذي صلة لامتصاص أي بروتينات ترتبط بشكل غير محدد بمكونات IP.
  3. حضّن المحلول مع الأجسام المضادة للبروتين المطلوب. يمكن ربط الأجسام المضادة بدعامة صلبة قبل هذه الخطوة (الطريقة المباشرة) أو بعدها (الطريقة غير المباشرة). استمر في التحضين للسماح بتكوين معقدات الجسم المضاد والمستضد.
  4. قم بترسيب المركب المطلوب، وإزالته من المحلول الرئيسي.
  5. اغسل المركب المترسب عدة مرات. قم بتدوير الأنبوب بين كل غسلة عند استخدام خرز الأغاروز، أو ضع الأنبوب على مغناطيس عند استخدام الخرز فائق المغناطيسية، ثم أزل السائل الطافي. بعد الغسلة الأخيرة، أزل أكبر قدر ممكن من السائل الطافي.
  6. قم بفصل البروتينات عن الدعامة الصلبة باستخدام محلول تحميل العينات ذي الرقم الهيدروجيني المنخفض أو محلول SDS.
  7. تحليل المركبات أو المستضدات ذات الأهمية. ويمكن القيام بذلك بعدة طرق:
    1. SDS-PAGE ( الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد كبريتات دوديسيل الصوديوم ) متبوعًا بتلوين الهلام.
    2. SDS-PAGE متبوعًا بما يلي: تلوين الجل، وقطع نطاقات البروتين الملونة الفردية، وتسلسل البروتينات في النطاقات بواسطة مطياف الكتلة MALDI .
    3. يتم إجراء عملية النقل والتلطيخ الغربي باستخدام جسم مضاد آخر للبروتينات التي تتفاعل مع المستضد، متبوعًا بالكشف باستخدام جسم مضاد ثانوي كيميائي مضيء أو فلوري .

مراجع

  1. ↑ رشيد، ك. أ.، هيفي، س.، تشين، ي.، لو كاهيريك، ف.، وتشاك، س. ل. (2002). نهج بروتيومي يحدد البروتينات في خلايا الكبد التي ترتبط بالبروتين الشحمي ب حديث التكوين. مجلة الكيمياء البيولوجية، 277(24)، 22010-22017. https://doi.org/10.1074/jbc.M112448200
  2. ↑ كين، جيه دي، كوميسارو، جيه إم، فريدرسدورف، إم بي (2006). "RIP-Chip: عزل وتحديد الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، والحمض النووي الريبوزي الميكروي (microRNA)، والمكونات البروتينية لمركبات البروتين النووي الريبوزي من مستخلصات الخلايا" ( ملف PDF) . Nat Protoc . 1 (1): 302–7 . doi : 10.1038/nprot.2006.47 . PMID 17406249. S2CID 25925403 .  
  3. ↑ أولي، جيرني؛ جنسن، كيرك ب.؛ روجيو، ماتيو؛ ميلي، ألدو؛ أولي، ألياز؛ دارنيل، روبرت ب. (14 نوفمبر 2003). "تقنية CLIP تحدد شبكات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنظمة بواسطة نوفا في الدماغ". مجلة ساينس . 302 (5648): 1212-1215 . رمز Bibcode : 2003Sci...302.1212U . doi : 10.1126 / science.1090095 . ISSN 1095-9203 . PMID 14615540. S2CID 23420615 .   
  4. ↑ بونيفاسينو، جيه إس، ديل أنجيليكا، إي سي، وسبرينغر، تي إيه 2001. الترسيب المناعي. البروتوكولات الحالية في البيولوجيا الجزيئية. 10.16.1–10.16.29.
  5. 1 2 3 روزنبرغ، إيان (2005). تحليل البروتين وتنقيته: تقنيات المختبر . سبرينغر. ص 520. ISBN  978-0-8176-4340-9.
  6. 1 2 كرويل، ر. إي.، دو كلوس، ت. و.، مونتويا، ج.، هيفي، إي.، مولد، س. (نوفمبر 1991). "مستقبلات البروتين التفاعلي C على خط الخلايا الوحيدة البشرية U-937. دليل على ارتباط إضافي بـ Fc gamma RI" . مجلة علم المناعة . 147 (10): 3445-51 . doi : 10.4049/jimmunol.147.10.3445 . PMID 1834740. S2CID 3256313 .  
  7. 1 2 3 ألبر ف، دوكودوفسكايا س، فينوف ل م، وآخرون (نوفمبر 2007). "البنية الجزيئية لمركب المسام النووي". نيتشر . 450 ( 7170): 695-701 . Bibcode : 2007Natur.450..695A . doi : 10.1038/nature06405 . PMID 18046406. S2CID 4431057 .   
  8. 1 2 3 4 5 ألبر ف، دوكودوفسكايا س، فينوف ل م، وآخرون (نوفمبر 2007). "تحديد بنى التجمعات الجزيئية الكبيرة". نيتشر . 450 ( 7170): 683-94 . Bibcode : 2007Natur.450..683A . doi : 10.1038/nature06404 . PMID 18046405. S2CID 2171750 .   
  9. كريستيا ، آي إم، ويليامز ، آر، تشايت، بي تي، روت، إم بي (ديسمبر 2005). "البروتينات الفلورية كأدوات بروتيومية" . علم البروتينات الجزيئي والخلوي . 4 ( 12): 1933-1941 . doi : 10.1074/mcp.M500227-MCP200 . PMID 16155292 . 
  10. 1 2 نيبل إم، سترامبيو دي كاستيليا سي، فاسولو جيه، شايت بي تي، روت إم بي (يوليو 2005). " يرتبط البروتين Mlp2p، المرتبط بمركب المسام النووية، بجسم قطب المغزل في الخميرة ويعزز تجميعه بكفاءة" . مجلة بيولوجيا الخلية . 170 (2): 225-35 . doi : 10.1083/jcb.200504140 . PMC 2171418. PMID 16027220 .  

تقنية الترسيب المناعي المشترك (Co-IP)