تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي

📅 آخر تحديث: ٣٠ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣٠ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 3 صور
الموسوعة الحرة
RT-PCR

تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي ( RT-PCR ) هو تقنية مخبرية تجمع بين النسخ العكسي للحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى الحمض النووي (DNA) (يُسمى في هذا السياق الحمض النووي التكميلي أو cDNA) وتضخيم أهداف محددة من الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). [ 1 ] يُستخدم هذا التفاعل بشكل أساسي لقياس كمية نوع معين من الحمض النووي الريبوزي. ويتحقق ذلك من خلال مراقبة تفاعل التضخيم باستخدام التألق، وهي تقنية تُسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). يُستخدم الجمع بين RT-PCR وqPCR بشكل روتيني لتحليل التعبير الجيني وتحديد كمية الحمض النووي الريبوزي الفيروسي في البحوث والدراسات السريرية.

أدى الترابط الوثيق بين تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) إلى استخدام مصطلح qPCR مجازيًا للإشارة إلى RT-PCR. قد يكون هذا الاستخدام مُربكًا، [ 2 ] إذ يُمكن استخدام RT-PCR دون qPCR، على سبيل المثال لتمكين الاستنساخ الجزيئي أو التسلسل أو الكشف البسيط عن الحمض النووي الريبي (RNA). في المقابل، يُمكن استخدام qPCR دون RT-PCR، على سبيل المثال، لتحديد عدد نسخ قطعة مُحددة من الحمض النووي (DNA).

التسمية

وُصفت تقنية RT-PCR وqPCR المدمجة بأنها RT-PCR الكمي [ 3 ] أو RT-PCR في الوقت الحقيقي [ 4 ] (وتُسمى أحيانًا RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي [ 5 ] )، وقد تم اختصارها بأشكال مختلفة مثل qRT-PCR [ 6 ] وRT-qPCR [ 7 ] وRRT-PCR [ 8 ] وrRT-PCR [ 9 ] . ولتجنب الالتباس، سيتم استخدام الاختصارات التالية بشكل متسق في جميع أنحاء هذه المقالة:

تقنيةاختصار
تفاعل البوليميراز المتسلسلتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسيRT-PCR
تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
تقنية RT-PCR / qPCR المدمجةqRT-PCR

لا يستخدم جميع المؤلفين، وخاصةً المؤلفين الأوائل، هذا الاصطلاح، لذا ينبغي على القارئ توخي الحذر عند تتبع الروابط. وقد استُخدم مصطلح RT-PCR للإشارة إلى كلٍ من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR).

تاريخ

منذ ظهورها عام 1977، استُخدمت تقنية التلطيخ الشمالي على نطاق واسع لتحديد كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) على الرغم من عيوبها: (أ) كونها تقنية تستغرق وقتًا طويلاً، (ب) حاجتها إلى كمية كبيرة من الحمض النووي الريبوزي للكشف عنه، و(ج) عدم دقتها الكمية في حالة انخفاض تركيز الحمض النووي الريبوزي. [ 10 ] [ 11 ] مع ذلك، منذ أن اخترع كاري موليس تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عام 1983، حلّ تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) محل تقنية التلطيخ الشمالي كطريقة مُفضلة للكشف عن الحمض النووي الريبوزي وتحديد كميته. [ 12 ]

أصبحت تقنية RT-PCR المعيار الذهبي للكشف عن مستويات الحمض النووي الريبي (RNA) ومقارنتها لعدة أسباب: (أ) لا تتطلب معالجة لاحقة بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، (ب) إمكانية قياس نطاق واسع (>10⁷ ضعف ) من وفرة الحمض النووي الريبي، (ج) توفر معلومات قيّمة حول البيانات النوعية والكمية. [ 5 ] ونظرًا لبساطتها ودقتها وحساسيتها، تُستخدم تقنية RT-PCR في تطبيقات متنوعة، بدءًا من تجارب بسيطة كقياس كمية خلايا الخميرة في النبيذ، وصولًا إلى استخدامات أكثر تعقيدًا كأدوات تشخيصية للكشف عن العوامل المعدية مثل فيروس إنفلونزا الطيور وفيروس SARS-CoV-2 . [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]

مبادئ

في تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، يُحوّل قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) أولًا إلى حمض نووي تكميلي (cDNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي (RT). ثم يُستخدم الحمض النووي التكميلي كقالب للتضخيم الأسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وقد أحدث استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي للكشف عن نسخ الحمض النووي الريبوزي ثورةً في دراسة التعبير الجيني بالطرق المهمة التالية:

  • جعل ذلك من الممكن نظرياً الكشف عن نسخ أي جين تقريباً [ 16 ]
  • وقد مكّن من تضخيم العينة وألغى الحاجة إلى كمية وفيرة من المواد الأولية المطلوبة عند استخدام تحليل النورثرن بلوت [ 17 ] [ 18 ]
  • تم توفير تحمل لتدهور الحمض النووي الريبي طالما أن الحمض النووي الريبي الذي يمتد عبر البادئ سليم [ 17 ]

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي أحادي الخطوة مقابل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي ثنائي الخطوة

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي أحادي الخطوة مقابل ثنائي الخطوة

يمكن قياس كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) إما بخطوة واحدة أو بخطوتين. يكمن الفرق بين الطريقتين في عدد الأنابيب المستخدمة. يتطلب التفاعل ذو الخطوتين إجراء تفاعل النسخ العكسي وتضخيم الحمض النووي الريبوزي الرسول في أنابيب منفصلة. من عيوب هذه الطريقة قابليتها للتلوث نتيجةً لكثرة التعامل مع العينات. [ 19 ] في المقابل، يتم التفاعل بأكمله، بدءًا من تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) وصولًا إلى تضخيم الحمض النووي الريبوزي الرسول، في أنبوب واحد في الطريقة ذات الخطوة الواحدة. يُعتقد أن هذه الطريقة تقلل من التباين التجريبي من خلال احتواء جميع التفاعلات الإنزيمية في بيئة واحدة. كما أنها تلغي خطوات سحب ناتج الحمض النووي التكميلي باستخدام الماصة، وهي عملية مُرهقة وعرضة للتلوث، إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل. بالإضافة إلى ذلك، يدعم استخدام بوليميرازات الحمض النووي المقاومة للمثبطات والمقاومة للحرارة ، ومُحسِّنات البوليميراز مع ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المُحسَّنة ذات الخطوة الواحدة، النسخ العكسي للحمض النووي الريبوزي من عينات غير مُنقَّاة أو خام، مثل الدم الكامل والمصل . [ 20 ] [ 21 ] مع ذلك، فإن قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأولية عرضة للتلف في طريقة الخطوة الواحدة، ولا يُنصح باستخدام هذه الطريقة عند الحاجة إلى إجراء تحليلات متكررة على نفس العينة. إضافةً إلى ذلك، تشير التقارير إلى أن طريقة الخطوة الواحدة أقل دقة مقارنةً بطريقة الخطوتين. كما أنها الطريقة المُفضلة للتحليل عند استخدام أصباغ ربط الحمض النووي (DNA) مثل SYBR Green، حيث يُمكن التخلص من ثنائيات البادئات من خلال تغيير بسيط في درجة حرارة الانصهار . ومع ذلك، تُعد طريقة الخطوة الواحدة حلاً مناسباً نسبياً للكشف السريع عن الحمض النووي الريبوزي المستهدف مباشرةً في الاستشعار الحيوي.

اختبار RT-PCR النهائي مقابل اختبار RT-PCR في الوقت الحقيقي

يمكن تقسيم قياس كمية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) إلى فئتين رئيسيتين: القياس النهائي والقياس الفوري. [ 22 ] يُفضل استخدام القياس النهائي لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي لقياس تغيرات التعبير الجيني في عدد قليل من العينات، بينما أصبح القياس الفوري لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المعيار الذهبي للتحقق من صحة النتائج الكمية المُستخلصة من تحليلات المصفوفات أو تغيرات التعبير الجيني على نطاق واسع. [ 23 ]

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي النهائي

تتطلب طرق قياس تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) في نهاية التجربة الكشف عن مستويات التعبير الجيني باستخدام أصباغ فلورية مثل بروميد الإيثيديوم ، [ 24 ] [ 25 ] أو وسم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالفوسفور-32 باستخدام جهاز التصوير الفسفوري ، [ 26 ] أو عن طريق العد الوميضي . [ 18 ] ويُجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في نهاية التجربة عادةً باستخدام ثلاث طرق مختلفة: النسبية، والتنافسية، والمقارنة. [ 27 ] [ 28 ]

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي النسبي
تتضمن القياسات الكمية النسبية لتقنية RT-PCR التضخيم المشترك لجين مرجعي داخلي بالتزامن مع الجين المستهدف. يُستخدم هذا الجين المرجعي لمعايرة العينات. بعد المعايرة، يُمكن إجراء مقارنة مباشرة لوفرة النسخ النسبية عبر عينات متعددة من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA). من المهم مراعاة اختيار الجين المرجعي الداخلي بحيث لا يتأثر بالمعالجة التجريبية. يجب أن يكون مستوى التعبير ثابتًا في جميع العينات ومع الحمض النووي الريبوزي الرسول المستهدف لضمان دقة النتائج ودلالتها. نظرًا لأن قياس النتائج يُحلل بمقارنة النطاق الخطي لتضخيم الجين المستهدف والجين المرجعي، فمن الضروري مراعاة تركيز جزيئات الجين المستهدف ومعدل تضخيمها قبل بدء التحليل. تُعبر نتائج التحليل عن نسب إشارة الجين إلى إشارة الجين المرجعي الداخلي، ويمكن استخدام هذه القيم للمقارنة بين العينات في تقدير التعبير النسبي للحمض النووي الريبوزي المستهدف. [ 25 ] [ 28 ] [ 29 ]
تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي التنافسي
تُستخدم تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي التنافسي (RT-PCR) للقياس الكمي المطلق. وتعتمد هذه التقنية على استخدام حمض نووي ريبوزي اصطناعي "منافس" يمكن تمييزه عن الحمض النووي الريبوزي المستهدف باختلاف طفيف في الحجم أو التسلسل. ومن المهم أن يكون تصميم الحمض النووي الريبوزي الاصطناعي مطابقًا في التسلسل للحمض النووي الريبوزي المستهدف، ولكنه أقصر منه قليلًا، للحصول على نتائج دقيقة. بعد تصميم الحمض النووي الريبوزي المنافس وتصنيعه، تُضاف كمية معلومة منه إلى العينات التجريبية، ويتم تضخيمها بالتزامن مع الحمض النووي الريبوزي المستهدف باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي. ثم يُرسم منحنى تركيز الحمض النووي الريبوزي المنافس، ويُستخدم هذا المنحنى لمقارنة إشارات تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الناتجة عن النسخ الجينية الداخلية لتحديد كمية الحمض النووي الريبوزي المستهدف الموجودة في العينة. [ 28 ] [ 30 ]
تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المقارن
يُشبه تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المقارن (RT-PCR) تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي التنافسي (Requestioned RT-PCR) في أن الحمض النووي الريبوزي المستهدف يتنافس على كواشف التضخيم ضمن تفاعل واحد مع معيار داخلي ذي تسلسل غير ذي صلة. بمجرد اكتمال التفاعل، تُقارن النتائج بمنحنى معياري خارجي لتحديد تركيز الحمض النووي الريبوزي المستهدف. بالمقارنة مع طرق التحديد الكمي النسبي والتنافسي، يُعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المقارن (RT-PCR) الطريقة الأسهل استخدامًا، إذ لا يتطلب من الباحث إجراء تجربة تمهيدية؛ ففي تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي النسبي، يجب تحديد نطاق التضخيم الأسي للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) مسبقًا، وفي تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي التنافسي، يجب تصنيع حمض نووي ريبوزي منافس اصطناعي. [ 28 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي

أتاح ظهور تقنيات جديدة لوسم الحمض النووي الفلوري في السنوات القليلة الماضية تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والكشف عنها في الوقت الحقيقي، مما أدى بالتالي إلى اعتماد واسع النطاق لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (RT-PCR) لتحليل التعبير الجيني. [ 35 ] لم تعد تقنية RT-PCR في الوقت الحقيقي هي الطريقة المُفضلة لتحديد كمية التعبير الجيني فحسب، بل أصبحت أيضًا الطريقة المُفضلة للحصول على نتائج من تحليلات المصفوفات والتعبير الجيني على نطاق عالمي. [ 36 ] يتوفر حاليًا أربعة أنواع مختلفة من مجسات الحمض النووي الفلورية للكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تقنية RT-PCR في الوقت الحقيقي: SYBR Green ، وTaqMan ، والمجسات الجزيئية ، ومجسات العقرب . تسمح جميع هذه المجسات بالكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال توليد إشارة فلورية. بينما يُصدر صبغ SYBR Green إشارته الفلورية بمجرد ارتباطه بالحمض النووي المزدوج في المحلول، فإن توليد الفلورة بواسطة مجسات TaqMan، والمنارات الجزيئية، والعقارب يعتمد على اقتران نقل طاقة رنين فورستر (FRET) لجزيء الصبغ وجزء مثبط مع ركائز الأوليغونوكليوتيد. [ 37 ]

أخضر SYBR
عندما يرتبط صبغ SYBR Green بالحمض النووي المزدوج لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، فإنه يُصدر ضوءًا عند إثارته. وتزداد شدة الفلورة مع تراكم منتجات PCR. هذه التقنية سهلة الاستخدام لعدم الحاجة إلى تصميم مجسات نظرًا لعدم خصوصية ارتباطه. مع ذلك، ولأن الصبغ لا يُميز بين الحمض النووي المزدوج لمنتجات PCR وثنائيات البادئات، فإن المبالغة في تقدير تركيز الهدف تُعد مشكلة شائعة. وعندما يكون التحديد الكمي الدقيق ضرورة مُلحة، يجب إجراء تحليل إضافي للتحقق من صحة النتائج. ومع ذلك، يُعد SYBR Green من بين طرق الكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (RT-PCR) الأكثر اقتصادية والأسهل استخدامًا. [ 22 ] [ 23 ]
تحقيقات تاكمان
مجسات تاكمان
مجسات TaqMan هي جزيئات قليلة النوكليوتيدات، يرتبط طرفها 5' بمجس فلوري، بينما يرتبط طرفها 3' بمثبط فلوري. أثناء تضخيم الحمض النووي بتقنية PCR، تتهجن هذه المجسات مع التسلسلات المستهدفة الموجودة في ناتج التضخيم ، وعندما يقوم إنزيم البوليميراز بنسخ القالب المرتبط بمجس TaqMan، فإنه يقوم أيضًا بقطع المجس الفلوري بفعل نشاط النيوكلياز 5' الخاص به. ولأن التقارب الشديد بين جزيء المثبط والمجس الفلوري يمنع عادةً الكشف عن الفلورة عبر تقنية نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)، فإن هذا الانفصال يؤدي إلى زيادة شدة الفلورة بما يتناسب مع عدد دورات قطع المجس. على الرغم من أن مجسات TaqMan المصممة جيدًا تُنتج نتائج دقيقة لتقنية RT-PCR في الوقت الحقيقي، إلا أن تصنيعها مكلف ويستغرق وقتًا طويلاً، خاصةً عند الحاجة إلى تصنيع مجسات منفصلة لكل جزيء mRNA مستهدف يتم تحليله. [ 22 ] [ 16 ] [ 38 ] بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه المجسات حساسة للضوء ويجب تجميدها بعناية على شكل أجزاء صغيرة لمنع التدهور.
مجسات المنارات الجزيئية
على غرار مجسات TaqMan، تستخدم المجسات الجزيئية أيضًا تقنية الكشف عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)، حيث ترتبط مجسات فلورية بالطرف 5' ومثبط فلوري بالطرف 3' لركيزة أوليغونوكليوتيدية. مع ذلك، بينما تُقطع مجسات TaqMan الفلورية أثناء التضخيم، تبقى مجسات المجسات الجزيئية سليمة وترتبط بهدف جديد في كل دورة تفاعل. عندما تكون حرة في المحلول، يمنع التقارب الشديد بين المجس الفلوري وجزيء المثبط الفلورة عبر تقنية FRET. ولكن، عند تهجين مجسات المجسات الجزيئية مع هدف، ينفصل الصبغ الفلوري عن المثبط، مما يؤدي إلى انبعاث الضوء عند الإثارة. وكما هو الحال مع مجسات TaqMan، فإن تصنيع المجسات الجزيئية مكلف ويتطلب مجسات منفصلة لكل هدف من الحمض النووي الريبي (RNA). [ 19 ]
مجسات العقرب
لن تكون مجسات العقرب، مثل المنارات الجزيئية، نشطة فلوريًا في الحالة غير المهجنة، وذلك لأن المجس الفلوري الموجود على الطرف 5' يُخمد بواسطة الجزء الموجود على الطرف 3' من قليل النوكليوتيد. مع ذلك، في حالة مجسات العقرب، يحتوي الطرف 3' أيضًا على تسلسل مكمل لناتج امتداد البادئ الموجود على الطرف 5'. عندما يرتبط امتداد العقرب بمكمله على الأمبليكون، ينفتح تركيب العقرب، مما يمنع نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)، ويُمكّن من قياس الإشارة الفلورية. [ 39 ]
مجسات متعددة الإرسال
تتيح مجسات TaqMan، والمجسات الجزيئية، وتقنية العقارب، قياس نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في أنبوب واحد. ويُعزى ذلك إلى إمكانية ربط كل صبغة فلورية مختلفة بطيف انبعاث محدد. ولا يقتصر الأمر على توفير الوقت والجهد باستخدام المجسات المتعددة دون المساس بجودة الاختبار، بل إن تطبيقها في مجالات بحثية واسعة، مثل تحليل حذف الجينات، وتحليل الطفرات والتعدد الشكلي، والتحليل الكمي، والكشف عن الحمض النووي الريبي (RNA)، يجعلها تقنية لا غنى عنها في مختبرات العديد من التخصصات. [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]

تُستخدم استراتيجيتان بشكل شائع لتحديد كمية النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي؛ طريقة المنحنى القياسي وطريقة العتبة المقارنة. [ 42 ]

طلب

يُتيح التضخيم الأسي عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي تقنيةً بالغة الحساسية، حيث يُمكن من خلالها الكشف عن عددٍ ضئيلٍ جدًا من جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA). ويُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي على نطاقٍ واسع في تشخيص الأمراض الوراثية، وبشكلٍ شبه كمي، في تحديد وفرة جزيئات الحمض النووي الريبوزي المختلفة داخل الخلية أو النسيج كمقياسٍ للتعبير الجيني .

أساليب البحث

يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي (RT-PCR) على نطاق واسع في أساليب البحث لقياس التعبير الجيني. فعلى سبيل المثال، استخدم لين وزملاؤه تقنية qRT-PCR لقياس التعبير عن جينات Gal في خلايا الخميرة. في البداية، قام لين وزملاؤه بهندسة طفرة في بروتين يُشتبه في مشاركته في تنظيم جينات Gal. وقد افترضوا أن هذه الطفرة ستؤدي إلى إلغاء التعبير عن جينات Gal بشكل انتقائي. ولتأكيد ذلك، تم تحليل مستويات التعبير الجيني في خلايا الخميرة الحاملة لهذه الطفرة باستخدام تقنية qRT-PCR. وقد تمكن الباحثون من تحديد أن طفرة هذا البروتين المنظم قد خفضت من التعبير عن جينات Gal بشكل قاطع. [ 43 ] ويُستخدم تحليل النقل الشمالي (Northern blot) لدراسة التعبير الجيني للحمض النووي الريبوزي (RNA) بشكل أعمق.

إدخال الجينات

يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) مفيدًا جدًا في إدخال جينات حقيقية النواة إلى بدائيات النوى . ولأن معظم جينات حقيقية النواة تحتوي على إنترونات ، وهي موجودة في الجينوم ولكنها غير موجودة في الحمض النووي الريبوزي الرسول الناضج (mRNA)، فإن الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتج عن تفاعل RT-PCR هو تسلسل الحمض النووي (DNA) الدقيق (بغض النظر عن طبيعة إنزيمات النسخ العكسي المعرضة للخطأ) الذي يُترجم مباشرةً إلى بروتين بعد عملية النسخ . وعندما تُعبَّر هذه الجينات في خلايا بدائيات النوى لإنتاج البروتين أو تنقيته، فإن الحمض النووي الريبوزي (RNA) الناتج مباشرةً من عملية النسخ لا يحتاج إلى عملية تضفير، لأن النسخة تحتوي فقط على إكسونات . (تفتقر بدائيات النوى، مثل الإشريكية القولونية، إلى آلية تضفير الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الموجودة في حقيقيات النوى).

تشخيص الأمراض الوراثية

يمكن استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) لتشخيص الأمراض الوراثية مثل متلازمة ليش-نيهان . ينجم هذا المرض الوراثي عن خلل في جين HPRT1 ، مما يؤدي سريريًا إلى تكوّن حصوات حمض اليوريك المميتة في المسالك البولية، وظهور أعراض مشابهة لداء النقرس . [6] يكشف تحليل مستويات التعبير الجيني لـ HPRT1 لدى الأم الحامل والجنين ما إذا كانت الأم حاملة للمرض، وما إذا كان الجنين مُعرّضًا للإصابة بمتلازمة ليش-نيهان. [ 44 ]

الكشف عن السرطان

يعمل العلماء على تطوير طرق لاستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) في الكشف عن السرطان لتحسين التنبؤات ومراقبة الاستجابة للعلاج. تنتج الخلايا السرطانية المنتشرة نسخًا فريدة من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) تبعًا لنوع السرطان. والهدف هو تحديد أي من نسخ mRNA تُعد أفضل المؤشرات الحيوية لنوع معين من الخلايا السرطانية، ثم تحليل مستويات التعبير عنها باستخدام تقنية RT-PCR. [ 45 ]

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) بشكل شائع في دراسة جينومات الفيروسات التي تتكون جينوماتها من الحمض النووي الريبي (RNA)، مثل فيروس الإنفلونزا A ، والفيروسات القهقرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وفيروس SARS-CoV-2 . [ 46 ]

الكشف عن مسببات الأمراض

يمكن استخدام اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف المبكر عن مسببات الأمراض التي تعتمد على الحمض النووي (DNA) من خلال تضخيم الحمض النووي للمُمْرِض، حتى قبل أن يبدأ الجسم المُضيف بإنتاج الأجسام المضادة . [ 47 ] يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) بتطبيق هذه العملية على فيروسات الحمض النووي الريبي (RNA) . [ 36 ] تشتهر اختبارات RT-PCR باستخدامها في اختبارات كوفيد-19 [ 48 ]، ولكنها استُخدمت أيضًا لتشخيص أمراض مثل الإيبولا ، وزيكا ، ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS) ، ومتلازمة الالتهاب الرئوي الحاد الوخيم (SARS )، والإنفلونزا . [ 36 ] [ 48 ]

التحديات

على الرغم من مزاياها الرئيسية، لا تخلو تقنية RT-PCR من العيوب. فالنمو الأسي للحمض النووي التكميلي (cDNA) المُستنسخ عكسيًا خلال دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتعددة يُنتج قياسًا غير دقيق لنقطة النهاية نظرًا لصعوبة الحفاظ على الخطية. [ 49 ] ولتوفير كشف وقياس دقيقين لمحتوى الحمض النووي الريبوزي (RNA) في العينة، طُوّرت تقنية qRT-PCR باستخدام تعديل قائم على التألق لمراقبة نواتج التضخيم خلال كل دورة من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويمكن أن تكون الحساسية المفرطة لهذه التقنية سلاحًا ذا حدين، إذ أن أدنى تلوث بالحمض النووي (DNA) قد يؤدي إلى نتائج غير مرغوب فيها. [ 50 ] وتتمثل إحدى الطرق البسيطة للتخلص من النتائج الإيجابية الكاذبة في إضافة علامات، أو ما يُعرف بعلامات التتبع ، إلى المنطقة 5' من بادئ خاص بجين معين. [ 51 ] بالإضافة إلى ذلك، قد يكون تخطيط وتصميم دراسات القياس الكمي أمرًا صعبًا من الناحية التقنية نظرًا لوجود مصادر عديدة للتغير، بما في ذلك تركيز القالب وكفاءة التضخيم. [ 31 ] يمكن استخدام إضافة كمية معروفة من الحمض النووي الريبي إلى العينة، وإضافة سلسلة من تخفيفات الحمض النووي الريبي لتوليد منحنى قياسي، وإضافة عينة بدون نسخة قالب (بدون cDNA) كعناصر تحكم.

بروتوكول

يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) باستخدام بروتوكول RT-PCR أحادي الخطوة أو بروتوكول RT-PCR ثنائي الخطوة.

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي بخطوة واحدة

تُخضع تقنية RT-PCR أحادية الخطوة جزيئات mRNA المستهدفة (حتى 6 كيلوبايت) لعملية النسخ العكسي، تليها عملية تضخيم PCR في أنبوب اختبار واحد. ويُفضّل استخدام RNA سليم وعالي الجودة، بالإضافة إلى بادئ مُحدد التسلسل، للحصول على أفضل النتائج.

بعد اختيار مجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي أحادي الخطوة (RT-PCR) التي تحتوي على مزيج من إنزيم النسخ العكسي، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq، وإنزيم بوليميراز مصحح، وتوفير جميع المواد والمعدات اللازمة، يتم تحضير مزيج التفاعل. يتضمن مزيج التفاعل النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)، والبادئات، وقالب الحمض النووي الريبوزي (RNA)، والإنزيمات اللازمة، ومحلول منظم . يُضاف مزيج التفاعل إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لكل تفاعل، ثم يُضاف قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA). توضع أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في جهاز التدوير الحراري لبدء دورات التفاعل. في الدورة الأولى، يتم تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA). أما الدورة الثانية فهي مرحلة التمسخ الأولي حيث يتم تعطيل إنزيم النسخ العكسي. أما الدورات المتبقية (40-50 دورة) فهي مرحلة التضخيم، والتي تشمل التمسخ، والتهجين، والاستطالة. عند اكتمال التضخيم، يمكن تحليل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي . [ 52 ] [ 53 ]

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي على مرحلتين

كما يوحي الاسم، تتم عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي ثنائي الخطوات (RT-PCR) على مرحلتين: أولاً النسخ العكسي، ثم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هذه الطريقة أكثر حساسية من طريقة الخطوة الواحدة. تتوفر مجموعات أدوات مفيدة أيضاً لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي ثنائي الخطوات. وكما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الخطوة، يُنصح باستخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) السليم وعالي الجودة فقط للحصول على أفضل النتائج. لا يشترط أن يكون البادئ المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل ثنائي الخطوات متخصصاً في تسلسل الحمض النووي الريبوزي.

الخطوة الأولى

أولًا، امزج قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA)، والبادئ، ومزيج النيوكليوتيدات (dNTP)، والماء الخالي من النيوكلياز في أنبوب تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). ثم أضف مثبط إنزيم الريبونوكلياز (RNase) وإنزيم النسخ العكسي إلى أنبوب تفاعل البلمرة المتسلسل. بعد ذلك، ضع أنبوب تفاعل البلمرة المتسلسل في جهاز التدوير الحراري لدورة واحدة، حيث تحدث عملية التلدين، والتمديد، وتعطيل إنزيم النسخ العكسي. أخيرًا، انتقل مباشرةً إلى الخطوة الثانية وهي تفاعل البلمرة المتسلسل، أو احفظ المنتج على الجليد لحين إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل.

الخطوة الثانية

أضف المزيج الرئيسي الذي يحتوي على محلول منظم، ومزيج dNTP، وMgCl₂ ، وإنزيم Taq polymerase، وماء خالٍ من النيوكلياز إلى كل أنبوب تفاعل PCR. ثم أضف البادئ اللازم إلى الأنابيب. بعد ذلك، ضع أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري لمدة 30 دورة من برنامج التضخيم. يشمل ذلك فصل السلاسل، والتهجين، والاستطالة. يمكن تحليل نواتج تفاعل RT-PCR باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي. [ 54 ]

إرشادات النشر

يُعتبر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) المعيار الذهبي لقياس عدد نسخ أهداف الحمض النووي التكميلي (cDNA) المحددة في العينة، إلا أنه يفتقر إلى التوحيد القياسي الكافي. [ 55 ] ونتيجةً لذلك، ورغم وجود العديد من المنشورات التي تستخدم هذه التقنية، فإن الكثير منها لا يُقدم تفاصيل تجريبية كافية، ويستخدم تحليلات بيانات غير مناسبة لاستخلاص استنتاجات خاطئة. ونظرًا للتفاوت المتأصل في جودة بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، لا يواجه المراجعون صعوبة في تقييم هذه المخطوطات فحسب، بل يصبح من المستحيل أيضًا تكرار الدراسات. [ 56 ] وإدراكًا لأهمية توحيد الإبلاغ عن الظروف التجريبية، نشر اتحاد دولي من العلماء الأكاديميين، بمن فيهم الأساتذة ستيفن بوستين ومايكل بفافل وميكائيل كوبيستا ، إرشادات الحد الأدنى من المعلومات اللازمة لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي ( MIQE ، تُنطق مايكي) . تصف إرشادات MIQE الحد الأدنى من المعلومات اللازمة لتقييم تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي والتي ينبغي اشتراطها للنشر لتشجيع ممارسات تجريبية أفضل وضمان ملاءمة ودقة وتفسير صحيح وقابلية تكرار بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. [ 57 ]

إلى جانب إرشادات الإبلاغ، تؤكد مبادرة MIQE على ضرورة توحيد المصطلحات المرتبطة بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتجنب الالتباس؛ فعلى سبيل المثال، ينبغي استخدام الاختصار qPCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي ، بينما يُستخدم RT-qPCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي، ويُشار إلى الجينات المستخدمة في التطبيع باسم الجينات المرجعية بدلاً من جينات التدبير المنزلي . كما تقترح المبادرة عدم استخدام المصطلحات التجارية مثل مجسات TaqMan ، واستخدام مصطلح مجسات التحلل المائي بدلاً منها . بالإضافة إلى ذلك، تقترح المبادرة استخدام دورة التحديد الكمي (Cq) لوصف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة في التحديد الكمي، بدلاً من دورة العتبة (Ct) ونقطة العبور (Cp) ونقطة الانطلاق (TOP)، والتي تشير إلى القيمة نفسها ولكنها صاغتها شركات مصنعة مختلفة لأجهزة الوقت الحقيقي . [ 55 ]

يتألف الدليل من العناصر التالية: 1) تصميم التجربة، 2) العينة، 3) استخلاص الحمض النووي ، 4) النسخ العكسي، 5) معلومات هدف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، 6) قليل النوكليوتيدات، 7) البروتوكول، 8) التحقق، و9) تحليل البيانات. تحمل العناصر المحددة ضمن كل عنصر تصنيفًا إما E (أساسي) أو D (مستحسن). تُعتبر العناصر المصنفة E بالغة الأهمية ولا غنى عنها، بينما تُعتبر العناصر المصنفة D ثانوية ولكنها مهمة لتحقيق أفضل الممارسات. [ 57 ]

يُنظّم البروفيسور مايكل بفافل من جامعة ميونخ التقنية، والبروفيسور ميكائيل كوبيستا من معهد التكنولوجيا الحيوية التابع للأكاديمية التشيكية للعلوم ، والبروفيسور فلاديمير بينيس من المختبر الأوروبي للبيولوجيا الجزيئية (EMBL) في هايدلبرغ، والبروفيسور ستيفن بوستين من جامعة أنجليا روسكين في لندن، بانتظام مؤتمرات ودورات تدريبية حول تقنية RT-qPCR واستخدام إرشادات MIQE. ويُقدّم هؤلاء الخبراء الدعم التدريبي في شركة Precision BioAnalytics في مدينة GoCo Health Innovation City في غوتنبرغ، السويد، بعد توقفهم عن تقديم الدورات في مركز TATAA Biocenter إثر استحواذ شركة Care Equity عليه.

بحث

في عام 2023، طوّر باحثون نموذجًا أوليًا عمليًا لنظام مختبري على رقاقة بتقنية RT-LAMP ، والذي وفّر نتائج اختبارات فيروس SARS-CoV-2 في غضون ثلاث دقائق. تدمج هذه التقنية قنوات ميكروفلويدية في لوحات الدوائر المطبوعة، مما قد يُتيح إنتاجًا ضخمًا بتكلفة منخفضة. [ 58 ] [ 59 ]

مراجع

  1. ↑ فريمان، دبليو إم، ووكر، إس جيه، وفرانا، كي إي (يناير 1999). "التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز العكسي: المخاطر والإمكانيات" . تقنيات حيوية . 26 (1): 112-122 ، 124-125 . doi : 10.2144/99261rv01 . PMID 9894600 . 
  2. ↑ ماكاي، إيان (2007). تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في علم الأحياء الدقيقة: من التشخيص إلى التوصيف . نورفولك، إنجلترا: دار كايستر الأكاديمية للنشر. ص 440. ISBN  978-1-904455-18-9.
  3. ↑ جويس سي (2002). "التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز العكسي: مراجعة للمنهجيات الحالية". بروتوكولات التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز العكسي . طرق البيولوجيا الجزيئية. المجلد 193. الصفحات 83-92 . doi : 10.1385/1-59259-283-X:083 . ISBN   978-1-59259-283-8PMID 12325527​​ 
  4. ↑ كانغ إكس بي، جيانغ تي، لي واي كيو، وآخرون (2010). "اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي المزدوج للكشف عن فيروس إنفلونزا الطيور H5N1 وفيروس إنفلونزا H1N1 الوبائي" . مجلة علم الفيروسات 7 113. doi : 10.1186/1743-422X-7-113 . PMC 2892456. PMID 20515509 .   
  5. 1 2 Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (يونيو 2005). "التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز العكسي في الوقت الحقيقي - منظور". مجلة علم الغدد الصماء الجزيئي . 34 (3): 597-601 . CiteSeerX 10.1.1.528.6638 . doi : 10.1677/jme.1.01755 . PMID 15956331. S2CID 1754364 .   
  6. ↑ فاركوني-غاسيك إي، هيلينز آر بي (2010). "qRT-PCR للحمض النووي الريبوزي الصغير". علم التخلق النباتي . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 631. الصفحات 109-122 . doi : 10.1007/978-1-60761-646-7_10 . ISBN   978-1-60761-645-0PMID 20204872​​ 
  7. ↑ تايلور إس، ويكيم إم، ديكمان جي، السراج إم، نغوين إم (أبريل 2010). "نهج عملي لتقنية RT-qPCR - نشر البيانات بما يتوافق مع إرشادات MIQE". طرق . 50 (4): S1–5. doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.005 . PMID 20215014 . 
  8. ↑ سباكمان إي، سين دي إيه، مايرز تي جيه، وآخرون (سبتمبر 2002). "تطوير اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي لفيروس الإنفلونزا من النوع أ والأنواع الفرعية من الهيماغلوتينين H5 وH7 للطيور" . مجلة علم الأحياء الدقيقة السريرية . 40 (9): 3256-3260 . doi : 10.1128/jcm.40.9.3256-3260.2002 . PMC 130722. PMID 12202562 .   
  9. ↑ "ملخص ترخيص الاستخدام الطارئ المعجل (EUA) لاختبار RT-PCR للكشف عن كوفيد-19 (شركة مختبرات أمريكا)" . إدارة الغذاء والدواء الأمريكية . مؤرشف من الأصل في 21 مارس 2020. تم الاطلاع عليه في 3 أبريل 2020 .
  10. ↑ ألوين، جيه سي، وكيمب، دي جيه، وستارك، جي آر (ديسمبر 1977). "طريقة للكشف عن أنواع محددة من الحمض النووي الريبي (RNA) في هلامات الأغاروز عن طريق النقل إلى ورق ديازوبنزيلوكسي ميثيل والتهجين مع مجسات الحمض النووي (DNA)" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 74 (12): 5350-5354 . رمز Bibcode : 1977PNAS...74.5350A . doi : 10.1073/pnas.74.12.5350 . PMC 431715. PMID 414220 .  
  11. ↑ ستريت إس، ميشالسكي سي دبليو، إركان إم، كليف جيه، فريس إتش (2009). "تحليل النقل الشمالي للكشف عن الحمض النووي الريبي وتحديد كميته في خلايا وأنسجة سرطان البنكرياس". نات بروتوكول . 4 (1): 37-43 . doi : 10.1038/nprot.2008.216 . PMID 19131955. S2CID 24980302 .  
  12. ↑ بوستين، إس. أ. (أكتوبر 2000). "القياس الكمي المطلق للرنا المرسال باستخدام فحوص تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي" . مجلة علم الغدد الصماء الجزيئي . 25 (2): 169-193 . doi : 10.1677/jme.0.0250169 . PMID 11013345 . 
  13. ↑ هيرو ن، إستيف-زارزوسو ب، غونزاليس أ، ماس أ، غيلامون ج م (نوفمبر 2006). "التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز في الوقت الحقيقي (QPCR) والتفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز العكسي للكشف عن الخمائر الكلية في النبيذ وعدّها" . مجلة علم الأحياء الدقيقة التطبيقية والبيئية . 72 (11 ) : 7148-55 . Bibcode : 2006ApEnM..72.7148H . doi : 10.1128/AEM.00388-06 . PMC 1636171. PMID 17088381 .  
  14. ↑ Slomka MJ, Pavlidis T, Coward VJ, et al. (يوليو 2009). "طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي المعتمدة لتشخيص وتحديد النمط المرضي لفيروسات إنفلونزا الطيور H7 الأوراسية" . الإنفلونزا وفيروسات الجهاز التنفسي الأخرى . 3 (4): 151-164 . doi : 10.1111/j.1750-2659.2009.00083.x . PMC 4634683. PMID 19627372 .   
  15. ↑ ملخص المهمة: زيارة ميدانية لمنظمة الصحة العالمية إلى ووهان، الصين، 20-21 يناير 2020: https://www.who.int/china/news/detail/22-01-2020-field-visit-wuhan-china-jan-2020
  16. 1 2 ديباك إس، كوتاپالي ك، راكوال ر، وآخرون . (يونيو 2007). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي: ثورة في الكشف عن الجينات وتحليل التعبير الجيني" . علم الجينوم الحالي . 8 (4): 234-251 . doi : 10.2174/138920207781386960 . PMC 2430684. PMID 18645596 .   
  17. 1 2 Bustin SA (أغسطس 2002). "تحديد كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (RT-PCR): الاتجاهات والمشاكل" . مجلة علم الغدد الصماء الجزيئي . 29 (1): 23-39 . doi : 10.1677/jme.0.0290023 . PMID 12200227 . 
  18. 1 2 سوازيه ف، نتودو-تومي أ، تران سي واي، روستين دبليو، فورجيز ب (أغسطس 1996). "التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز العكسي: الحدود والدقة" . تقنيات حيوية . 21 (2): 280-285 . doi : 10.2144/96212rr01 . PMID 8862813 . 
  19. 1 2 وونغ إم إل، ميدرانو جيه إف (يوليو 2005). "التفاعل التسلسلي للبوليميراز في الوقت الحقيقي لتحديد كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول" . تقنيات حيوية . 39 (1): 75-85 . doi : 10.2144/05391rv01 . PMID 16060372 . 
  20. ↑ لي، لانغ؛ هي، جيان-آن؛ وانغ، وي؛ شيا، يون؛ سونغ، لي؛ تشين، زي-هان؛ تسو، هانغ-تشي؛ تان، شوان-بينغ؛ هو، آرون هو-بوي؛ كونغ، سيو-كاي؛ لو، جاكي فونغ-تشوين (2019-08-01). "تطوير اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي المباشر (dirRT-qPCR) للتشخيص السريري لفيروس زيكا" . المجلة الدولية للأمراض المعدية . 85 : 167-174 . doi : 10.1016/j.ijid.2019.06.007 . ISSN 1201-9712 . PMID 31202908 .  
  21. ↑ باخوفن، كلوديا؛ ويلوبي، كيم؛ زادوكس، روث؛ بور، بول؛ ميلور، دومينيك؛ راسل، جورج سي. (2013-06-01). "يُمكّن تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المباشر من المصل من إجراء تحليل سريع وفعال من حيث التكلفة للتطور الجيني لفيروس الإسهال الفيروسي البقري". مجلة أساليب علم الفيروسات . 190 (1): 1-3 . doi : 10.1016/j.jviromet.2013.03.015 . ISSN 0166-0934 . PMID 23541784 .  
  22. 1 2 3 شميتجن تي دي، زاكراجسيك بي إيه، ميلز إيه جي، جورن في، سينجر إم جيه، ريد إم دبليو (أكتوبر 2000). "التفاعل التسلسلي الكمي العكسي لدراسة تحلل الحمض النووي الريبوزي الرسول: مقارنة بين طريقتي نقطة النهاية والوقت الحقيقي". مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية . 285 (2): 194-204 . doi : 10.1006/abio.2000.4753 . PMID 11017702. S2CID 258810 .  
  23. 1 2 راجيفان إم إس، فيرنون إس دي، تايسافانغ إن، أونغر إي آر (فبراير 2001). "التحقق من صحة بيانات التعبير الجيني المستندة إلى المصفوفات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (الحركي) في الوقت الحقيقي" . مجلة التشخيص الجزيئي . 3 (1): 26-31 . doi : 10.1016/S1525-1578(10) 60646-0 . PMC 1907344. PMID 11227069 .  
  24. ↑ ستون-مارشات م، كارفيل أ، سكورونيك أ، لايغريد و.و. (مارس 1994). "الكشف عن فيروس مرض الخيل الأفريقي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي" . مجلة علم الأحياء الدقيقة السريرية . 32 (3): 697-700 . doi : 10.1128/JCM.32.3.697-700.1994 . PMC 263109. PMID 8195381 .  
  25. 1 2 مينتون، أ.ب. (أبريل 1995). "الحصر كمحدد لبنية الجزيئات الكبيرة وتفاعليتها. الجزء الثاني: تأثيرات التفاعلات الجاذبة الضعيفة بين المذابات الكبيرة المحصورة والهياكل المحيطة بها" . مجلة الفيزياء الحيوية ، 68 (4): 1311-1322 . Bibcode : 1995BpJ....68.1311M . doi : 10.1016/S0006-3495(95)80304-8 . PMC 1282026. PMID 7787020 .  
  26. ↑ هسو م، يو إي واي، سبروسانسكي أو، ماك إيتشيرن إم جيه، لو إن إف (يوليو 2012). "التحليل الوظيفي لنظير Est1/Ebs1 الوحيد في خميرة كلوفيروميسيس لاكتيس يكشف عن أدوار في كل من صيانة التيلومير ومقاومة الراباميسين" . الخلية حقيقية النواة . 11 (7): 932-42 . doi : 10.1128/EC.05319-11 . PMC 3416500. PMID 22544908 .  
  27. ↑ شميتجن تي دي، وليفاك كيه جيه (2008). " تحليل بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي باستخدام طريقة C(T) المقارنة". نات بروتوكول . 3 (6): 1101-1108 . doi : 10.1038/nprot.2008.73 . PMID 18546601. S2CID 205464270 .  
  28. 1 2 3 4 تانغ، يي-وي (13-09-2012)، التقنيات المتقدمة في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي ، سبرينغر، ISBN 978-1461439691
  29. ↑ جاوس، دبليو سي، وآداموفيتش، جيه (يونيو 1994). "استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد كمية التعبير الجيني" . أبحاث الجينوم . 3 (6): S123–35. doi : 10.1101/gr.3.6.s123 . PMID 7522722 . 
  30. ↑ تساي إس جيه، ويلتبانك إم سي (نوفمبر 1996). "تحديد كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي التنافسي مع منهجية المنحنى القياسي" . تقنيات حيوية . 21 (5): 862-866 . doi : 10.2144/96215st04 . PMID 8922627 . 
  31. 1 2 راماكرز سي، رويتر جيه إم، ديبريز آر إتش، مورمان إيه إف (مارس 2003). "تحليل بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (PCR) دون افتراضات مسبقة". رسائل علم الأعصاب. 339 ( 1): 62-66 . doi : 10.1016/S0304-3940(02)01423-4 . PMID 12618301. S2CID 9459695 .  
  32. ↑ هالفورد دبليو بي، فالكو في سي، جيبهاردت بي إم، كار دي جيه (يناير 1999). "القدرة الكمية الكامنة لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي" . مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية . 266 (2): 181-191 . doi : 10.1006/abio.1998.2913 . PMID 9888974 . 
  33. ↑ كينغ ن (2010). "استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المقارن لدراسة تأثير حضانة السيستين على تعبير GPx1 في خلايا عضلة القلب المعزولة حديثًا". بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 630. الصفحات 215-232 . doi : 10.1007/978-1-60761-629-0_14 . ISBN   978-1-60761-628-3PMID 20301000​​ 
  34. ↑ تشانغ جيه تي، تشين آي إتش، لياو سي تي، وآخرون (نوفمبر 2002). "طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام النسخ العكسي للكشف الكمي عن عوامل النمو المحفزة لتكوين الأوعية الدموية لدى مرضى سرطان الرأس والرقبة". مجلة الكيمياء الحيوية السريرية . 35 (8): 591-596 . doi : 10.1016/S0009-9120(02)00403-4 . PMID 12498992 .  
  35. ↑ لو، رو-جيان؛ تشاو، لي؛ هوانغ، باو-ينغ؛ يي، فاي؛ وانغ، وين-لينغ؛ تان، وين-جي (5 سبتمبر 2021). "لوحة فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي للكشف عن فيروس كورونا 2 المسبب لمتلازمة الالتهاب التنفسي الحاد الوخيم ومتغيراته" . المجلة الطبية الصينية . 134 (17): 2048-2053 . doi : 10.1097/CM9.0000000000001687 . PMC 8439998. PMID 34402479 .  
  36. 1 2 3 جاورث، نيكول (27 مارس 2020). "كيف يتم الكشف عن فيروس كوفيد-19 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي؟" . الوكالة الدولية للطاقة الذرية . تم الاطلاع عليه بتاريخ 16 فبراير 2023 .
  37. ↑ هولدن، إم جيه؛ وانغ، إل. (2008). "التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز في الوقت الحقيقي: خيارات ومشكلات المجسات الفلورية" . التقييس وضمان الجودة في قياسات الفلورة II . سلسلة سبرينغر حول الفلورة. المجلد 6. ص 489. doi : 10.1007/4243_2008_046 . ISBN   978-3-540-70570-3.
  38. ↑ يانغ دي كيه، كوون سي إتش، كيم بي إتش، وآخرون . (ديسمبر 2004). "تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي بتقنية TaqMan للكشف عن فيروس التهاب الدماغ الياباني" . مجلة العلوم البيطرية . 5 (4): 345-351 . doi : 10.4142/jvs.2004.5.4.345 . PMID 15613819 .  
  39. شاركي ، ف . هـ.، وبانات، إ. م.، ومارشانت، ر. (يوليو 2004). " الكشف عن التعبير الجيني وتحديد كميته في علم البكتيريا البيئية" . مجلة علم الأحياء الدقيقة التطبيقية والبيئية . 70 (7): 3795-3806 . Bibcode : 2004ApEnM..70.3795S . doi : 10.1128/AEM.70.7.3795-3806.2004 . PMC 444812. PMID 15240248 .  
  40. ↑ راتكليف آر إم، تشانغ جي، كوك تي، سلوتس تي بي (يوليو 2007). "التشخيص الجزيئي للفيروسات الطبية". قضايا حالية في البيولوجيا الجزيئية . 9 (2): 87-102 . PMID 17489437 . 
  41. ↑ إلنيفرو إي إم، أششي إيه إم، كوبر آر جيه، كلابر بي إي (أكتوبر 2000). "تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد: التحسين والتطبيق في علم الفيروسات التشخيصي" . مجلة علم الأحياء الدقيقة السريرية . 13 (4): 559-70 . doi : 10.1128/cmr.13.4.559-570.2000 . PMC 88949. PMID 11023957 .  
  42. ↑ بوستين، إس. أ. (يوليو 2005). "التفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز القائم على التألق في الوقت الحقيقي: لمحة عن الإجراءات والتفضيلات الحالية". مجلة الخبراء في التشخيص الجزيئي ، 5 (4): 493-498 . doi : 10.1586/14737159.5.4.493 . PMID 16013967. S2CID 1833811 .  
  43. ↑ لين إل، تشامبرلين إل، تشو إل جيه، غرين إم آر (فبراير 2012). "تحليل تنشيط النسخ الموجه بواسطة Gal4 باستخدام طفرات Tra1 المعيبة بشكل انتقائي في التفاعل مع Gal4" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 109 ( 6): 1997-2002 . Bibcode : 2012PNAS..109.1997L . doi : 10.1073/pnas.1116340109 . PMC 3277556. PMID 22308403 .  
  44. ↑ توريس آر جيه، غارسيا إم جي، بويغ جي جي (ديسمبر 2012). "التشخيص قبل الولادة وحاملو مرض ليش-نيهان الناتج عن خلل في تنظيم التعبير الجيني لـ HPRT". جين . 511 (2): 306-307 . doi : 10.1016/j.gene.2012.09.121 . PMID 23046577 . 
  45. ↑ شي إل، نيكاستري دي جي، الحفناوي تي، هيوز إس جيه، لوكيتش جيه دي، غودفري تي إي (يوليو 2007). "المؤشرات المثلى للكشف الكمي في الوقت الحقيقي عن الخلايا السرطانية المنتشرة من سرطان الجلد، وسرطان الثدي، وسرطان القولون، وسرطان المريء، وسرطان الرأس والرقبة، وسرطان الرئة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي" . مجلة الكيمياء السريرية . 53 (7): 1206-1215 . doi : 10.1373/clinchem.2006.081828 . PMID 17525108 . 
  46. ↑ "فيروس كورونا: اختبار السفر" . المعهد العالي للصحة .
  47. ↑ ميدلاين بلس (19 سبتمبر 2024). "اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل" . المكتبة الوطنية للطب . المعاهد الوطنية للصحة. مؤرشف من الأصل في 16 مارس 2025. تم الاطلاع عليه في 21 مارس 2025 .
  48. 1 2 كليفلاند كلينك (21 يناير 2025). "اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل" . مؤرشف من الأصل في 4 مارس 2025. تم الاطلاع عليه في 21 مارس 2025 .
  49. ↑ شياو واي إتش (ديسمبر 2003). "طريقة جديدة للتفاعل التسلسلي للبوليميراز العكسي للقياس الكمي الدقيق" . بي إم سي للتكنولوجيا الحيوية . 3 22. doi : 10.1186/1472-6750-3-22 . PMC 317330. PMID 14664723 .  
  50. ↑ جيتيمي جيه إم، ما بي، أليك إم، جولد إم إتش (فبراير 1998). "تحليل تنظيم عائلة جينات بيروكسيداز المنغنيز باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي" . مجلة علم الأحياء الدقيقة التطبيقية والبيئية . 64 (2): 569-74 . Bibcode : 1998ApEnM..64..569G . doi : 10.1128/AEM.64.2.569-574.1998 . PMC 106084. PMID 9464395 .  
  51. ↑ مارتيل، فاطمة؛ ديرك غروندمان؛ إدغار شويغ (31 مارس 2002). "طريقة بسيطة للتخلص من النتائج الإيجابية الكاذبة في تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي" . مجلة الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية . 35 (2): 248-250 . doi : 10.5483/BMBRep.2002.35.2.248 . PMID 12297038 . 
  52. ↑ "مجموعة أدوات النسخ عالية الدقة بخطوة واحدة" . Biotools. مؤرشف من الأصل في 20 مايو 2013. تم الاطلاع عليه في 12 ديسمبر 2012 .
  53. ^ ديجين، هانز يواكيم. دوفيل، أنيت؛ إيزل، دوريس؛ جرونوالد-جانهو، ستيفاني؛ كيسي، جو (2006). دليل تطبيقات PCR (PDF) (3 ed.). تشخيصات روش. ص 135 – 137.  
  54. ↑ "بروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي ذو الخطوتين" (ملف PDF) . معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا . تم الاطلاع عليه بتاريخ 12 ديسمبر 2012 .
  55. 1 2 "www.microarrays.ca" (PDF) .
  56. ↑ بوستين، إس. أ. (أبريل 2010). "لماذا الحاجة إلى إرشادات نشر نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي؟ - حالة MIQE". طرق . 50 (4): 217-226 . doi : 10.1016/j.ymeth.2009.12.006 . PMID 20025972 . 
  57. 1 2 Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. (أبريل 2009). "إرشادات MIQE: الحد الأدنى من المعلومات اللازمة لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي" . Clin. Chem . 55 (4): 611–22 . doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID 19246619 .  
  58. ↑ باباماثايو إس، بوكسال-كلاسبي جيه، دوغلاس إي جيه، جاجيسنياك بي، بيريه إتش، ميرسر-تشالمرز جيه، كومار في كيه، لومونوسوف جي بي، ريبود جيه، لاباي إم، كوبر جيه إم، كاسبرزيك-هوردن بي، موشو دي (أكتوبر 2023). " LoCKAmp: تقنية المختبر على لوحة الدوائر المطبوعة للكشف الجيني عن الفيروسات في أقل من 3 دقائق" . مختبر على رقاقة . 23 (20): 4400-4412 . doi : 10.1039/d3lc00441d . PMC 10563828. PMID 37740394 .  
  59. ↑ "جهاز تشخيص LoCKAmp يُوصف بأنه 'أسرع اختبار لكوفيد في العالم'"" . المهندس . 2 نوفمبر 2023. تم الاطلاع عليه بتاريخ 29 أكتوبر 2024 .