هندسة السيتوكروم P450

تتميز الهندسة الإنزيمية العقلانية بإجراء طفرات محددة في الأحماض الأمينية بناءً على معلومات آلية أو بنيوية. ورغم أن آليات عمل إنزيمات P450 مفهومة جيدًا، إلا أن الطفرات القائمة على المعلومات البنيوية غالبًا ما تكون محدودة بسبب صعوبة التبلور . ^{[ 4 ] [ 5 ]} ومع ذلك، عندما يكون ذلك ممكنًا، فإن درجة المرونة العالية ومرونة الموقع النشط في إنزيمات P450 تجعل البنى البلورية غير ضرورية إلى حد كبير للتصميم العقلاني. ^{[ 5 ]} تبرز مشكلة أخرى عند محاولة توسيع نطاق الركائز. غالبًا ما يتم تحقيق ذلك عن طريق زيادة حجم الموقع النشط لإنزيم P450 ، مما قد يؤدي بدوره إلى اتجاهات متعددة لالتحام الركائز ، وبالتالي ضعف الانتقائية الموضعية/الفراغية. ^{[ 5 ]}

التطور الموجه هو استراتيجية هندسة إنزيمية مصممة لمحاكاة الانتقاء الطبيعي في بيئة المختبر. ^{[ 2 ] [ 4 ] [ 5 ]} ونظرًا لصعوبة تطبيق استراتيجيات التصميم العقلاني، أصبح التطور الموجه الاستراتيجية المُفضلة لهندسة إنزيمات السيتوكروم P450. في هذه الاستراتيجية، يمكن إدخال الطفرات إما بشكل شبه عقلاني أو عشوائي عبر طفرات التشبع الموضعي . ثم يتم فحص طفرة السيتوكروم P450 الناتجة (عادةً مكتبة الطفرات) بحثًا عن النشاط المطلوب. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]} تُحال الطفرات التي تُظهر خصائص مُحسّنة إلى جولات لاحقة من الطفرات، وتُكرر هذه الدورة حتى يتم تحقيق الوظيفة المطلوبة بشكل كافٍ.

إنزيم السيتوكروم P450 BM3 (المعروف أيضًا باسم CYP102A1) هو إنزيم سيتوكروم P450 معزول من بكتيريا Bacillus megaterium . ^{[ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 8 ]} وقد خضع BM3 لدراسات مكثفة في مجال هندسة الإنزيمات نظرًا لذوبانه، ونظائره البكتيرية سهلة التعديل، ونظام نقل الإلكترونات المستقل به، فضلًا عن فائدته في التخليق الكيميائي. ^{[ 8 ]} وقد كشفت الدراسات الهندسية أن طفرات BM3 يمكن أن: 1) تُزوَّد بنطاقات ركائز جديدة ومتنوعة، 2) تُظهر انتقائية مكانية/فراغية على ركائز جديدة، 3) تُهندس لتكون عالية الانتقائية والنشاط تجاه ركائز جديدة. [ ^{5 ] [ 6 ] [ 8 ] وقد} أثبتت متغيرات BM3 فائدتها الكبيرة في إنتاج العطور والنكهات والفيرومونات والمستحضرات الصيدلانية . ^{[ ٨ ]} تم إنتاج حمض الأرتيميسينيك (المستخدم في إنتاج منتج الأرتيميسينين الطبيعي الصيدلاني ) باستخدام متحوّر BM3 المسؤول عن أكسدة الألكينين الموجودين في أمورفا-٤،١١-ديين. ^{[ ٨ ] [ ٩ ]} تمت أكسدة الفالنسين إلى نوتكاتون (نكهة الجريب فروت المرغوبة) باستخدام طفرة F87T وI263A (الشكل ١). ^{[ ٨ ]}

أفاد وانغ وزملاؤه مؤخرًا عن وجود متحوّر من إنزيم BM3 قادر على إجراء تفاعل إضافة حلقية البروبان إلى الأوليفينات الستايرينية . ^{[ 6 ]} ونظرًا لضعف نشاط إنزيم BM3 الأصلي في هذا التفاعل، بُذلت جهود هندسية لتحسينه. تُعدّ إنزيمات P450، في جوهرها، إنزيمات هيم-ثيولات تستخدم الأكسجين الجزيئي (O2 ₎ وNAD(P)H لإجراء تفاعلات الأكسدة. ^{[ 10 ]} ولذلك، يُفضّل إنزيم BM3 إجراء تفاعلات الإيبوكسدة بدلًا من تفاعلات إضافة حلقية البروبان في وجود الأوليفينات. ^{[ 6 ]} وقد اختير التفاعل بين إيثيل ديازواسيتات (EDA) والمركب 1 كنموذج للتفاعل نظرًا للصعوبة المعروفة في أكسدة الأوليفينات الفقيرة بالإلكترونات باستخدام التحفيز بالمعادن الانتقالية (الشكل 2). ^{[ 6 ]} ينتج عن هذا التفاعل المركب 2 ، الذي يُمكن تحويله بسهولة إلى ليفوميلناسيبران (فيتزيما)، وهو دواء يُستخدم لعلاج الاكتئاب السريري . ^{[ 6 ]} في البداية، تم توليد طفرات استُبدل فيها بقايا السيستين المحورية المنسقة في المركز التحفيزي بالأحماض الأمينية: السيرين، والألانين، والميثيونين، والهيستيدين، والتيروسين. حفزت الطفرة T268A-axH، التي تحتوي على رابطة هيستيدين محورية، التفاعل بين EDA و 1 بنسبة 81% مع انتقائية فراغية 6:94 وانتقائية ضوئية 42%. ^{[ 6 ]} بعد ذلك، أُجريت جولات لاحقة من الطفرات الموجهة لتشبع الموقع ، مما أسفر عن المتغير المسمى BM3-Hstar (الذي يحتوي على الطفرات T268A-axH، وL437W، وV78M، وL181V)، والذي استطاع تحفيز التفاعل النموذجي بنسبة تزيد عن 92%، وانتقائية ضوئية 92%، وانتقائية فراغية 2:98. ^{[ 6 ]} كميزة إضافية، كان إنزيم BM3-Hstar قادرًا أيضًا على إجراء تفاعل السيكلوبروبان المطلوب في وجود الأكسجين الجوي (O2) (وهو المتغير الوحيد المعروف من BM3 القادر على ذلك). ^{[ 6 ]}

Aside from their synthetic utility, P450 enzymes have also been engineered to better understand their biochemistry.^[10] Based on the proposed catalytic cycle, an axially ligated thiolate moiety (cysteine) donates electron density to the metal center aiding in protonation of a ferric-peroxo anion intermediate (⁻O-O-Fe³⁺) which upon water loss generates a C-H bond reactive iron-oxo species (O=Fe⁴⁺).^{[2][5][8][10]} Alternatively, if the ferric-peroxo anion remains un-protonated, this reactive species can mediate C-C bond cleavage in aldehyde-containing substrates (deformylation).^[10] In order to better understand intermediate dichotomy between the ferric-peroxo anion and iron-oxo species, CYP125 (which is responsible for various metabolic processes including cholesterol degradation) was engineered to replace the axial ligated cysteine residue with selenocysteine (SeCYP125). In turn, it was observed that SeCYP125 favors formation of oxidized products vs deformylated products when reacted with cholesterol-26-aldehyde, indicating that increased electron donation from selenocysteine relative to cysteine results in a higher proportion of iron-oxo relative to ferric-peroxo anion (Figure 3).^[10]

In 2016, work published by Dydio et al. reported an artificial metalloenzyme capable of catalyzing intra-/intermolecular carbene C-H insertions into activated/unactivated C-H bonds, with kinetics like that of a native enzyme (Figure 4). The reported catalyst was developed by switching the iron-protoporphyrin cofactor in thermostable P450 enzyme CYP119A1 with an iridium-methyl-protoporphyrin cofactor (Ir(Me)-PIX), followed by directed evolution. CYP119-Max, a quadruple mutant (C317G, T213G, L69V, V254L), was subsequently obtained. Enantiomeric excesses (ee’s) of up to ±98% were obtained with a fixed catalyst loading of 0.17 mol %. CYP119-Max can also undergo intermolecular insertion reactions, albeit with moderate ee (68%). To demonstrate the applicability of CYP119-Max in the production of fine chemicals, a 200 mM scale reaction produced ethyl-2,3-dihydrobenzofuran-3-carboxylate in 44% yield, with 35,000 turnover number (TON) and 93% ee.^[7]