تلوين الأبواغ الداخلية

يُعدّ تلوين الأبواغ الداخلية تقنيةً تُستخدم في علم البكتيريا لتحديد وجودها في عينة بكتيرية. ^{[ 1 ]} تُشكّل الأبواغ الداخلية، داخل البكتيريا، تراكيب واقية تُستخدم للبقاء على قيد الحياة في الظروف القاسية، بما في ذلك درجات الحرارة العالية، مما يجعلها شديدة المقاومة للمواد الكيميائية. ^{[ 2 ]} تحتوي الأبواغ الداخلية على كمية قليلة من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) أو لا تحتوي عليه إطلاقًا، مما يدل على مدى خمولها. تحتوي الأبواغ الداخلية على غلاف خارجي صلب مُكوّن من الكيراتين ، يحميها من الحمض النووي (DNA) بالإضافة إلى آليات تكيف أخرى. تتميز الأبواغ الداخلية بقدرتها على إعادة الإنبات لتكوين خلايا نباتية، مما يُضفي عليها طبيعةً واقيةً تجعل تلوينها صعبًا باستخدام التقنيات العادية مثل التلوين البسيط وتلوين غرام . تشمل التقنيات الخاصة لتلوين الأبواغ الداخلية تلوين شيفر-فولتون وتلوين مولر .

دُرست الأبواغ الداخلية لأول مرة عام 1876 على يد العالِمين كوهن وكوخ . [ 3 ^{] ووجدا أن} الأبواغ الداخلية لا تتفاعل مع الأصباغ البسيطة مثل أزرق الميثيلين والسافرانين والكاربول فوكسين . واكتشف هذان العالمان، إلى جانب عدد قليل من العلماء الآخرين، أن الأبواغ كامنة ومقاومة للحرارة. وفي أوائل القرن العشرين، سعى الباحثون إلى إيجاد طرق بديلة للحد من انتشار الأمراض والعدوى الناجمة عن هذه الأبواغ الداخلية. ^{[ 3 ]}

في عام 1922، نشر دورنر طريقة لتلوين الأبواغ الداخلية. وقد توصل إلى تقنية تلوين تفاضلية تظهر فيها الأبواغ الداخلية باللون الأخضر، بينما تظهر الخلايا الخضرية باللون الأحمر المائل للوردي. ^{[ 4 ]} استخدم دورنر الحرارة كخطوة في هذه العملية، لكنها كانت تستغرق وقتًا طويلاً، لذا قام كل من شيفر وفولتون بتعديل طريقته في عام 1933.

قام شايفر وفولتون بتسريع عملية التسخين بشكل كبير باستخدام موقد بنسن . ورغم أن هذه الطريقة لم تكن الأمثل، إلا أنها كانت أسهل بكثير من طريقة دورنر. وقد وفرت هذه الطريقة المحسّنة اختبارًا أسرع وأسهل، وجعلت الأبواغ أكثر حساسية للأصباغ. ^{[ 4 ]} وحتى يومنا هذا، لا يزال يُستخدم اختبار شايفر-فولتون لتحديد أنواع البكتيريا.

تستطيع الأبواغ الداخلية البقاء لعقود في ظروف قاسية متعددة، كالجفاف والتجمد. ويعود ذلك إلى قدرة الحمض النووي الموجود داخلها على البقاء لفترة طويلة. معظم البكتيريا غير قادرة على تكوين الأبواغ الداخلية نظرًا لمقاومتها العالية، ولكن من بين الأنواع الشائعة جنسَي العصوية (أكثر من 100 نوع) والمطثية (أكثر من 160 نوعًا). ^{[ 2 ]}

• بكتيريا الجمرة الخبيثة (Bacillus anthracis) ، التي تسبب مرض الجمرة الخبيثة ^{[ 5 ]}
• بكتيريا العصوية الشمعية - يمكن أن تسبب نوعين من التسمم الغذائي: التسمم القيئي والإسهالي ^{[ 2 ]}
• بكتيريا العصوية الرقيقة – توجد في التربة ^{[ 5 ]}
• المطثية الكزازية - بوغ يسبب تشنج الفك (الكزاز) والشلل التام.
• المطثية الوشيقية – جراثيم توجد في الأطعمة التي لم يتم تعليبها بشكل صحيح.تُباع المطثية الوشيقية أحيانًا تحت اسم البوتوكس، وهي تمنع انتقال الإشارات العصبية.
• المطثية العسيرة – تسبب التهابًا في القولون، وغالبًا ما يكون ذلك بسبب المضادات الحيوية الأخرى. تشمل الأعراض الإسهال وآلام البطن والحمى. ^{[ 6 ]}

تشمل أنواع الأبواغ الداخلية التي يمكن تحديدها: الأبواغ الداخلية الحرة، والأبواغ الداخلية المركزية (في منتصف الخلية)، والأبواغ الداخلية شبه الطرفية (بين طرف الخلية ومنتصفها)، والأبواغ الداخلية الطرفية (في طرف الخلية). وقد يوجد أيضًا مزيج من الأبواغ الطرفية وشبه الطرفية. ويمكن التمييز بين الأبواغ الداخلية بناءً على شكلها، سواءً كانت كروية أو بيضاوية، وحجمها بالنسبة للخلية، وما إذا كانت تُسبب انتفاخًا في الخلية أم لا. ^{[ 2 ]}

في طريقة تلوين شيفر-فولتون ، يُضخّ صبغ أولي يحتوي على الأخضر المالاكيت إلى داخل البوغ عن طريق تبخير البكتيريا. يمكن ترك الأخضر المالاكيت على الشريحة لمدة 15 دقيقة أو أكثر لتلوين الأبواغ. يستغرق تلوين الأبواغ وقتًا طويلاً نظرًا لكثافتها، لذا تعمل الحرارة كمثبت عند إجراء هذا التلوين التفريقي. الأخضر المالاكيت قابل للذوبان في الماء، لذا يمكن إزالة لون الخلايا الخضرية والخلايا الأم للأبواغ بالماء المقطر وتلوينها لاحقًا بمحلول سافرانين بتركيز 0.5% . ^{[ 7 ]} في النهاية، تُظهر مسحة جيدة البوغ الداخلي كنقطة خضراء داخل خلية حمراء أو وردية اللون. ^{[ 2 ]}

تُعدّ المتفطرة إحدى العقبات التي تواجه هذا النوع من عمليات التلوين، إذ أنها تظلّ مصبوغة باللون الأخضر حتى وإن لم تُنتج أي أبواغ داخلية. ويعود ذلك إلى جدارها الخلوي الشمعي الذي يحتفظ بصبغة المالاكيت الأخضر حتى بعد عملية إزالة اللون. وللحصول على مزيد من المعلومات حول هذا النوع من البكتيريا، لا بدّ من استخدامنوع آخر من التلوين يُسمى التلوين المقاوم للأحماض .

المصدر: ^{[ 2 ]}

1. باستخدام تقنية التعقيم، قم بتحضير شريحة مثبتة بالحرارة ومجففة بالهواء مع الكائن الحي المطلوب.
2. قم بتحضير حمام مائي مغلي.
3. قم بتغطية الشريحة بقطعة من منشفة ورقية وضعها على رف التلوين فوق حمام الماء.
4. قم بتغطية المنشفة الورقية الموجودة على الشريحة باللون الأخضر المالاكيت (الصبغة الأساسية).
5. قم بتبخير الشريحة لمدة 5 إلى 7 دقائق (كمادة مثبتة).
6. بعد انتهاء الوقت، أخرج الشريحة من حمام الماء بحرص باستخدام ملقط. انزع المنشفة الورقية.
7. اترك الشريحة تبرد، ثم باستخدام الملقط فوق رف التلوين، اشطفها برفق بالماء المقطر حتى يصبح السائل الخارج صافيًا (مزيل اللون).
8. قم بسكب أي ماء زائد وضع الشريحة على رف التلوين واغمرها بالزعفرانين (صبغة مضادة) لمدة دقيقة واحدة.
9. اشطفي أي فائض من الزعفرانين برفق بالماء المقطر وجففي كلا الجانبين بعناية.
10. عندما تجف الشريحة، قم بفحص الشريحة تحت المجهر باستخدام عدسة الغمر الزيتي (100X).