تلطيخ

الصبغ هو تقنية تستخدم لتعزيز التباين في العينات، عمومًا على المستوى المجهري . تُستخدم البقع والأصباغ بشكل متكرر في علم الأنسجة (الدراسة المجهرية للأنسجة البيولوجية )، وفي علم الخلايا (الدراسة المجهرية للخلايا )، وفي المجالات الطبية لعلم الأمراض النسيجية ، وعلم أمراض الدم ، وعلم الأمراض الخلوية التي تركز على دراسة وتشخيص الأمراض على المستوى المجهري. يمكن استخدام البقع لتحديد الأنسجة البيولوجية (تسليط الضوء، على سبيل المثال، على ألياف العضلات أو النسيج الضام )، أو مجموعات الخلايا (تصنيف خلايا الدم المختلفة )، أو العضيات داخل الخلايا الفردية.

في الكيمياء الحيوية ، يتضمن ذلك إضافة صبغة خاصة بفئة معينة ( الحمض النووي ، البروتينات ، الدهون ، الكربوهيدرات ) إلى ركيزة لتحديد أو تحديد كمية وجود مركب معين. يمكن أن يخدم التلوين والوسم الفلوري أغراضًا مماثلة. يستخدم التلوين البيولوجي أيضًا لتمييز الخلايا في قياس التدفق الخلوي ، ولتمييز البروتينات أو الأحماض النووية في الرحلان الكهربائي للهلام . تُستخدم المجاهر الضوئية لعرض العينات الملطخة عند تكبير عالٍ، عادةً باستخدام إضاءة المجال الساطع أو الإضاءة الفلورية.

لا يقتصر التلوين على المواد البيولوجية فقط، حيث يمكن استخدامه أيضًا لدراسة بنية مواد أخرى؛ على سبيل المثال، الهياكل الرقائقية للبوليمرات شبه البلورية أو الهياكل المجالية للبوليمرات الكتلية .

الصبغ داخل الجسم الحي (يُطلق عليه أيضًا الصبغ الحيوي أو الصبغ الحيوي الداخلي) هو عملية صبغ الأنسجة الحية. من خلال جعل خلايا أو هياكل معينة تأخذ ألوانًا متباينة، يمكن رؤية شكلها ( شكلها ) أو موضعها داخل الخلية أو النسيج ودراستها بسهولة. الغرض المعتاد هو الكشف عن التفاصيل الخلوية التي قد لا تكون واضحة بخلاف ذلك؛ ومع ذلك، يمكن للصبغ أيضًا الكشف عن مكان حدوث مواد كيميائية معينة أو تفاعلات كيميائية محددة داخل الخلايا أو الأنسجة.

تتضمن عملية التلوين في المختبر تلوين الخلايا أو الهياكل التي تم إزالتها من سياقها البيولوجي. غالبًا ما يتم الجمع بين بعض الصبغات للكشف عن تفاصيل وميزات أكثر من صبغة واحدة بمفردها. عند الجمع بين بروتوكولات محددة للتثبيت وإعداد العينة، يمكن للعلماء والأطباء استخدام هذه التقنيات القياسية كأدوات تشخيصية متسقة وقابلة للتكرار. الصبغة المضادة هي صبغة تجعل الخلايا أو الهياكل أكثر وضوحًا، عندما لا تكون مرئية تمامًا بالصبغة الأساسية.

• تصبغ صبغة الكريستال البنفسجي كل من الكائنات الحية إيجابية الجرام وسلبية الجرام. يزيل العلاج بالكحول اللون البنفسجي الكريستالي من الكائنات الحية سلبية الجرام فقط. يستخدم السافرانين كصبغة مضادة لتلوين الكائنات الحية سلبية الجرام التي تم إزالة لونها بالكحول.

أثناء وجودها خارج الجسم الحي، تستمر العديد من الخلايا في العيش والتمثيل الغذائي حتى يتم "تثبيتها". تعتمد بعض طرق التلوين على هذه الخاصية. تسمى تلك البقع التي تستبعدها الخلايا الحية ولكن تمتصها الخلايا الميتة بالفعل بالبقع الحيوية (على سبيل المثال، أزرق التريبان أو يوديد البروبيديوم للخلايا حقيقية النواة). تسمى تلك التي تدخل الخلايا الحية وتصبغها بالبقع فوق الحيوية (على سبيل المثال، أزرق الميثيلين الجديد والأزرق اللامع للكريزيل لصبغ الشبكية ). ومع ذلك، فإن هذه البقع سامة للكائن الحي في النهاية، بعضها أكثر من غيرها. ويرجع ذلك جزئيًا إلى تفاعلها السام داخل الخلية الحية، فعندما تدخل البقع فوق الحيوية إلى الخلية الحية، فقد تنتج نمطًا مميزًا من التلوين يختلف عن تلوين الخلية الثابتة بالفعل (على سبيل المثال، مظهر "الشبكية" مقابل "تعدد الألوان" المنتشر). لتحقيق التأثيرات المرغوبة، تُستخدم البقع في محاليل مخففة للغاية تتراوح من 1: 5000 إلى 1 : 500000 ( هاوي ، 2000 ). لاحظ أنه من الممكن استخدام العديد من البقع في كل من الخلايا الحية والثابتة.

تعتمد الخطوات التحضيرية المطلوبة على نوع التحليل المخطط له. وقد تكون بعض أو كل الإجراءات التالية مطلوبة.

تُستخدم الحوامل الرطبة لعرض الكائنات الحية ويمكن صنعها باستخدام الماء وبعض البقع. يُضاف السائل إلى الشريحة قبل إضافة الكائن الحي ويتم وضع غطاء زجاجي فوق العينة في الماء والبقع للمساعدة في احتوائها داخل مجال الرؤية . ^[1]

التثبيت ، والذي قد يتكون في حد ذاته من عدة خطوات، يهدف إلى الحفاظ على شكل الخلايا أو الأنسجة المعنية قدر الإمكان. في بعض الأحيان يتم استخدام التثبيت الحراري لقتل العينة والالتصاق بها وتغييرها حتى تقبل البقع. تولد معظم المثبتات الكيميائية (المواد الكيميائية المسببة للتثبيت) روابط كيميائية بين البروتينات والمواد الأخرى داخل العينة، مما يزيد من صلابتها. تشمل المثبتات الشائعة الفورمالديهايد والإيثانولوالميثانولو/أو حمض البكريك . يمكن تضمين قطع من الأنسجة في شمع البارافين لزيادة قوتها الميكانيكية واستقرارها ولتسهيل تقطيعها إلى شرائح رقيقة. ^[2]

المواد الموردة هي مواد كيميائية لها القدرة على صنع الأصباغ لتلطيخ المواد التي لا يمكن تلطيخها بخلاف ذلك

يتم تصنيف المواد الموردة إلى فئتين:

أ) المادة الموردة القاعدية: تتفاعل مع الأصباغ الحمضية مثل الشبّة، وكبريتات الحديدوز، وكلوريد سيتيل بيريدينيوم وما إلى ذلك.

ب) المادة الموردة الحمضية: تتفاعل مع الصبغات القاعدية مثل حمض البكريك وحمض التانيك وما إلى ذلك.

^[2] التلوين المباشر: يتم بدون مادة رابطة.

التلوين غير المباشر: التلوين بمساعدة المادة الموردة.

يمثل الجدول تقنيات التلوين غير المباشرة والمواد الموردة المستخدمة في كل منها:

رقم التسلسل	اسم تقنية التلوين غير المباشر	اسم المادة الموردة المطبقة
1.)	صبغة غرام	اليود غرام
2.)	صبغ جدار الخلية أ) طريقة رينجر ب) طريقة ديار	10% حمض التانيك 0.34% تكلفة النقرة
3.)	صبغ الأسواط أ) طريقة ليفسون ب) طريقة لوفلر	حمض التانيك في صبغة ليفسون موردانت لوفلر (حمض التانيك 20٪)
4.)	صبغ البكتيريا الحلزونية أ) طريقة فونتانا ب) طريقة بيكر	موردانت فونتانا (حمض التانيك 5٪) موردانت فونتانا (حمض التانيك 5٪)

تتضمن عملية النفاذية معالجة الخلايا بمادة فعالة سطحية (عادةً) . تعمل هذه المعالجة على إذابة أغشية الخلايا ، وتسمح لجزيئات الصبغة الأكبر بالدخول إلى داخل الخلية.

تتضمن عملية التركيب عادةً ربط العينات بشريحة مجهر زجاجية للملاحظة والتحليل. في بعض الحالات، يمكن زراعة الخلايا مباشرة على الشريحة. بالنسبة لعينات الخلايا السائبة (كما هو الحال مع مسحة الدم أو مسحة عنق الرحم )، يمكن وضع العينة مباشرة على الشريحة. بالنسبة لقطع الأنسجة الأكبر حجمًا، يتم عمل أقسام رقيقة (شرائح) باستخدام ميكروتوم ؛ يمكن بعد ذلك تركيب هذه الشرائح وفحصها.

تتوفر معظم الأصباغ المستخدمة بشكل شائع في المجهر كصبغات معتمدة من BSC . وهذا يعني أن عينات من دفعة الشركة المصنعة تم اختبارها من قبل هيئة مستقلة، وهي لجنة الصبغة البيولوجية ( BSC )، ووجد أنها تلبي أو تتجاوز معايير معينة من النقاء ومحتوى الصبغة والأداء في تقنيات الصبغ مما يضمن إجراء تجارب أكثر دقة ونتائج أكثر موثوقية. يتم نشر هذه المعايير في مجلة Biotechnic & Histochemistry التابعة للجنة . ^[3] العديد من الأصباغ غير متسقة في التركيب من مورد إلى آخر. يزيل استخدام البقع المعتمدة من BSC مصدر النتائج غير المتوقعة. ^[4]

يبيع بعض البائعين بقعًا "معتمدة" من قبلهم وليس من قبل لجنة البقع البيولوجية. قد تكون هذه المنتجات مناسبة أو غير مناسبة للتطبيقات التشخيصية وغيرها. ^[5]

طريقة بسيطة لصبغ البكتيريا والتي عادة ما تكون ناجحة، حتى عندما تفشل طرق الصبغ الإيجابية، هي استخدام صبغة سلبية . يمكن تحقيق ذلك عن طريق تلطيخ العينة على الشريحة ثم وضع نيجروسين (صبغة صناعية سوداء) أو حبر الهند (تعليق مائي لجزيئات الكربون). بعد التجفيف، يمكن رؤية الكائنات الحية الدقيقة في المجهر الميداني الساطع على أنها شوائب أخف وزناً تتناقض بشكل جيد مع البيئة المظلمة المحيطة بها. ^[6] الصبغ السلبي قادر على تلطيخ الخلفية بدلاً من الكائنات الحية لأن جدار الخلية للكائنات الحية الدقيقة عادةً ما يكون له شحنة سالبة تطرد الصبغة المشحونة سلبًا. الأصباغ المستخدمة في الصبغ السلبي حمضية. ^[1] ملاحظة: الصبغ السلبي هو تقنية خفيفة قد لا تدمر الكائنات الحية الدقيقة، وبالتالي فهي غير مناسبة لدراسة مسببات الأمراض.

على عكس الصبغة السلبية، تستخدم الصبغة الإيجابية صبغات أساسية لتلوين العينة على خلفية زاهية. وبينما يستخدم الكروموفور في الصبغة السلبية والإيجابية على حد سواء، فإن نوع الكروموفور المستخدم في هذه التقنية هو أيون مشحون إيجابيا بدلا من أيون سلبي. يجذب جدار الخلية المشحون سلبًا للعديد من الكائنات الحية الدقيقة الكروموفور المشحون إيجابيا مما يتسبب في امتصاص العينة للصبغة مما يمنحها لون الصبغة المستخدمة. يُستخدم الصبغ الإيجابي بشكل أكثر شيوعًا من الصبغة السلبية في علم الأحياء الدقيقة. فيما يلي الأنواع المختلفة من الصبغة الإيجابية. ^[1]

التلوين البسيط هو تقنية تستخدم نوعًا واحدًا فقط من الصبغة على شريحة في كل مرة. نظرًا لاستخدام صبغة واحدة فقط، ستكون العينات (للصبغات الإيجابية) أو الخلفية (للصبغات السلبية) بلون واحد. لذلك، تُستخدم الصبغات البسيطة عادةً لعرض كائن حي واحد فقط لكل شريحة. يستخدم التلوين التفاضلي عدة صبغات لكل شريحة. بناءً على الصبغات المستخدمة، ستظهر الكائنات الحية ذات الخصائص المختلفة بألوان مختلفة مما يسمح بتصنيف عينات متعددة. يمكن أيضًا استخدام التلوين التفاضلي لتلوين عضيات مختلفة داخل كائن حي واحد والتي يمكن رؤيتها في تلوين الأبواغ الداخلية . ^[1]

أنواع تقنيات التلوين ^[7]

رقم التسلسل	تقنية التلوين	تحضير	طلب	نتيجة
1.	بسيط (أحادي اللون)	تلطيخ البقع بصبغة واحدة. على سبيل المثال الميثيلين الأزرق، سافرانين درجة ≥×←← إلخ.	تستخدم لتسليط الضوء على الميكروبات وتوضيح الخلايا الاشكال والترتيبات	يتم صبغ الكائنات الحية بلون الصبغة المطبقة
2.	سلبي (إرتياح)	لطخة مختلطة مع نيجروسين ونشرها في فيلم رقيق	دراسة مورفولوجيا الخلية	الكائن الحي ملطخ، والخلفية سوداء
3	غرام	الصبغة الأولية: يتم تطبيق اللون البنفسجي البلوري على الفيلم ثم معالجته باليود (المادة الموردة) والكحول (مزيل اللون) ثم يتم صبغه بالصفرانين	يميز البكتيريا في إحدى المجموعتين، إيجابية الجرام أو سلبية الجرام	تظهر الجرام موجبة اللون أرجوانية اللون تظهر الجرام السالبة باللون الوردي
4	الصيام الحمضي (تقنية زيل-نيلسن)	فيلم ملطخ بـ ZNCF الساخن المزيل للون (كحول حمضي) وملطخ بأزرق الميثيلين	افصل البكتيريا المقاومة للأحماض غير المزالة اللون والتي لم يتم إزالة لونها عن البكتيريا المقاومة للأحماض الملونة	البكتيريا المقاومة للأحماض: حمراء خالٍ من الأحماض: أزرق
5	الأبواغ الداخلية (طريقة دورنور)	صبغة أولية باللون الأخضر المالاكيتي مثبتة بالحرارة لاختراق الجراثيم؛ الخلايا النباتية مصبوغة بصبغة مضادة للصبغة السافرانين	يكتشف وجود الأبواغ الداخلية في ستة أجناس من البكتيريا	الأبواغ الداخلية: خضراء الخلايا النباتية: حمراء
6	كبسولة أ: طريقة الهسهسة (تقنية إيجابية) ب: تقنية مانيفالز (سلبية)	لطخة ملطخة بصبغة هيس بعد المعالجة بكبريتات النحاس يتم دهن المعلق البكتيري مع اللون الأحمر الكونغولي ويتم وضع صبغة مانيفال	يمكن ملاحظة الكبسولات كمناطق واضحة تحيط بخلايا البكتيريا المغلفة وتستخدم لإثبات وجود الكبسولات.	الكبسولة: بنفسجي فاتح/لون أرجواني باهت البكتيريا: كبسولة أرجوانية، خلية بكتيرية، تبرز على خلفية داكنة
7	جدار الخلية (طريقة ديار)	تم معالجة اللطاخة باستخدام CPC الذي يتفكك لتكوين سيتيل بيريدينيوم مشحون إيجابيا وأيونات كلوريد مشحونة سلبًا. يتم امتصاص الأيونات المشحونة إيجابيا على جدار الخلية المشحون سلبًا	يصبغ جدار الخلية للبكتيريا	جدار الخلية: أحمر السيتوبلازم: أزرق
8	الأسواط (طريقة ليفسون)	يعمل الموردانت على تكثيف الأسواط قبل التلوين ويزيد من الرؤية مجهريًا عند صبغه بصبغة ليفسون	يظهر وجود الأسواط	الأسواط: حمراء الخلايا النباتية: زرقاء
9	المواد النووية (تقنية فولجن)	يتم معالجة اللطاخة بالتحلل المائي لإطلاق البيورينات من الحمض النووي، والبيورينات تسبب تحول الفورانوز إلى ألدهيد. تتوفر مجموعات الألدهيد للتفاعل مع كاشف شيف لتكوين مركبات الإضافة.	لإثبات وجود الحمض النووي في الخلية، ولكن للكشف عن الحمض النووي، يجب تدمير الحمض النووي الريبي بشكل انتقائي عن طريق التحلل المائي الحمضي دون التأثير على الحمض النووي.	المواد النووية - أرجوانية وردية اللون، السيتوبلازم - عديم اللون
10	الحبيبات المتغايرة اللون (طريقة ألبرتس)	يتم معالجة اللطاخة أولاً بالكلوروفورم لإزالة الدهون. يتم تطبيق اللطاخة بصبغة ألبرتس التي تحتوي على صبغات كاتيونية مثل الأزرق التولويدين والأخضر المالاكيت. يصبغ الأزرق التولويدين الحبيبات بشكل تفضيلي بينما يصبغ الأخضر المالاكيت السيتوبلازم.	تظهر الحبيبات الطبيعة أحادية اللون النموذجية، ويستخدم هذا لإظهار الحبيبات	الحبيبات: سوداء مزرقة، السيتوبلازم: خضراء
11	الدهون داخل الخلايا (طريقة بوردون)	يتم صبغ الدهون باستخدام صبغات قابلة للذوبان في الدهون مثل الأسود السوداني. عند تطبيق الأسود السوداني، تنتقل الصبغات B إلى الدهون وتظل هناك بينما يتم صبغ السيتوبلازم بالصفرانين.	للكشف عن وجود الدهون في جدار الخلية أو غشاء الخلية أو كرات الدهون (PHB في السيتوبلازم)	حبيبات الدهون: أزرق غامق، السيتوبلازم: وردي فاتح
12	السكاريد المتعدد (طريقة هوتش كوس)	يتم أكسدة السكاريد المتعدد مع البريودات لتكوين بولي ألدهيد يتفاعل مع كواشف شيف للحصول على اللون الأحمر، بينما يتم صبغ السيتوبلازم باللون الأخضر المالاكيت.	يكتشف تراكم حبيبات السكاريد في الخلايا	السكاريد المتعدد: أحمر السيتوبلازم: أخضر

تُستخدم صبغة جرام لتحديد حالة الجرام لتصنيف البكتيريا على نطاق واسع بناءً على تكوين جدار الخلية . تستخدم صبغة جرام اللون البنفسجي البلوري لصبغ جدران الخلايا، واليود (كمادة رابطة)، وصبغة مضادة للفوكسين أو السفرانين (لتمييز جميع البكتيريا). تساعد حالة الجرام في تقسيم عينات البكتيريا إلى مجموعتين، تمثلان عمومًا شجرة التطور الأساسية الخاصة بها. هذه الخاصية، جنبًا إلى جنب مع تقنيات أخرى تجعلها أداة مفيدة في مختبرات علم الأحياء الدقيقة السريرية، حيث يمكن أن تكون مهمة في الاختيار المبكر للمضادات الحيوية المناسبة . ^[8]

في أغلب المستحضرات المصبوغة بالجرام، تظهر الكائنات الحية سلبية الجرام باللون الأحمر أو الوردي بسبب صبغة مضادة. وبسبب وجود محتوى دهني أعلى، تزداد مسامية جدار الخلية بعد المعالجة بالكحول، وبالتالي يمكن لمجمع CVI (البلورة البنفسجية – اليود) أن يمر عبرها. وبالتالي، لا يتم الاحتفاظ بالصبغة الأولية. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من معظم البكتيريا إيجابية الجرام، تحتوي البكتيريا سلبية الجرام على بضع طبقات فقط من الببتيدوجليكان وغشاء خلوي ثانوي يتكون في المقام الأول من الليبوبوليساكاريد.

تُستخدم صبغة الأبواغ الداخلية لتحديد وجود أو غياب الأبواغ الداخلية ، مما يجعل من الصعب جدًا قتل البكتيريا. وقد ثبت أن صبغ الأبواغ البكتيرية صعب لأنه غير منفذ للكواشف الصبغية المائية. تُعد صبغة الأبواغ الداخلية مفيدة بشكل خاص لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية المكونة للأبواغ الداخلية مثل Clostridioides difficile . قبل تطوير طرق أكثر كفاءة، تم إجراء هذه الصبغة باستخدام طريقة Wirtz مع التثبيت الحراري والصبغ المضاد. من خلال استخدام الأخضر المالاكيت ونسبة مخففة من كاربول فوكسين، كان تثبيت البكتيريا في حمض الأسيتيك طريقة رائعة لضمان عدم خلط الأصباغ. ومع ذلك، فقد أدت طرق الصبغ المنقحة حديثًا إلى تقليل الوقت المستغرق لإنشاء هذه البقع بشكل كبير. تضمن هذا التعديل استبدال كاربول فوكسين بسافرانين مائي مقترنًا بصيغة مخففة حديثًا بنسبة 5٪ من الأخضر المالاكيت. تم إجراء هذا التركيب الجديد والمحسن للبقع بنفس الطريقة السابقة باستخدام التثبيت الحراري والشطف والتجفيف بالنشاف للفحص اللاحق. عند الفحص، سيتم صبغ جميع البكتيريا المكونة للأبواغ باللون الأخضر مصحوبًا بظهور جميع الخلايا الأخرى باللون الأحمر. ^[9]

صبغة Ziehl –Neelsen هي صبغة مقاومة للأحماض تستخدم لصبغ أنواع من بكتيريا السل التي لا يمكن صبغها بإجراءات الصبغ المختبرية القياسية مثل صبغة جرام.

يتم إجراء هذه الصبغة من خلال استخدام كل من الكاربولين فوكسين الملون باللون الأحمر الذي يصبغ البكتيريا وصبغة مضادة مثل الأزرق الميثيلين .

تُستخدم صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين بشكل متكرر في علم الأنسجة لفحص أقسام الأنسجة الرقيقة. ^{[10] تصبغ} الهيماتوكسيلين نوى الخلايا باللون الأزرق، بينما تصبغ الإيوزين السيتوبلازم والنسيج الضام والمواد خارج الخلية الأخرى باللون الوردي أو الأحمر. ^[10] يمتص خلايا الدم الحمراء الإيوزين بقوة ، مما يلونها باللون الأحمر الفاتح. في مستحضر H&E المصنوع بمهارة، تكون خلايا الدم الحمراء برتقالية تقريبًا، ويكتسب الكولاجين والسيتوبلازم (خاصة العضلات) درجات مختلفة من اللون الوردي.

تم تطوير صبغة بابانيكولاو ، أو صبغة PAP، لتحل محل خزعة الإبرة الدقيقة (FNAC) على أمل تقليل أوقات الصبغ والتكلفة دون المساس بالجودة. هذه الصبغة هي طريقة مستخدمة بشكل متكرر لفحص عينات الخلايا من مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة في مختلف الأعضاء. لقد تحملت صبغة PAP العديد من التعديلات من أجل أن تصبح "بديلاً مناسبًا" لـ FNAC. نشأ هذا التحول من تقدير العلماء للطاخات الثابتة الرطبة التي تحافظ على هياكل النوى على عكس المظهر غير الشفاف للطاخات رومانوفسكي المجففة بالهواء. أدى هذا إلى إنشاء صبغة هجينة من الثابتة الرطبة والمجففة بالهواء تُعرف باسم صبغة بابانيكولاو فائقة السرعة. يتضمن هذا التعديل استخدام محلول ملحي أنفي لإعادة ترطيب الخلايا لزيادة شفافية الخلايا ويقترن باستخدام الفورمالين الكحولي لتعزيز ألوان النوى. تُستخدم صبغة بابانيكولاو الآن بدلاً من الصبغة الخلوية في جميع أنواع الأعضاء بسبب زيادة جودتها المورفولوجية وتقليل وقت الصبغة وانخفاض التكلفة. يستخدم بشكل متكرر لصبغ عينات مسحة عنق الرحم . ^[11] يستخدم مزيجًا من الهيماتوكسيلين ، البرتقالي G ، الإيوزين Y ، الأخضر الفاتح SF المصفر ، وأحيانًا البني بسمارك Y. [ ^{10] [11] [12]}

^[13] حمض الدوري-شيف هو صبغة خاصة في علم الأنسجة تستخدم لتمييز الكربوهيدرات ( الجليكوجين ، الجليكوبروتين ، البروتيوغليكان ). يستخدم حمض الدوري-شيف بشكل شائع على أنسجة الكبد حيث تتكون رواسب الجليكوجين والتي يتم إجراؤها في محاولة للتمييز بين أنواع مختلفة من أمراض تخزين الجليكوجين. يعد حمض الدوري-شيف مهمًا لأنه يمكنه الكشف عن حبيبات الجليكوجين الموجودة في أورام المبايض والبنكرياس في الجهاز الصماء، وكذلك في المثانة والكلى في الجهاز الكلوي. يمكن أن تظهر الأغشية القاعدية أيضًا في صبغة حمض الدوري-شيف ويمكن أن تكون مهمة عند تشخيص أمراض الكلى. نظرًا للحجم الكبير من الكربوهيدرات داخل جدار الخلية للخيوط الفطرية وأشكال الخميرة من الفطريات، يمكن أن تساعد صبغة حمض الدوري-شيف في تحديد موقع هذه الأنواع داخل عينات أنسجة جسم الإنسان.

إن صبغة ماسون الثلاثية الألوان هي (كما يوحي الاسم) بروتوكول صبغ ثلاثي الألوان. وقد تطورت الوصفة من تقنية ماسون الأصلية لتطبيقات محددة مختلفة، ولكنها جميعًا مناسبة تمامًا للتمييز بين الخلايا والأنسجة الضامة المحيطة بها . تنتج معظم الوصفات الكيراتين الأحمر وألياف العضلات، وتلوين الكولاجين والعظام باللون الأزرق أو الأخضر ، وتلوين السيتوبلازم باللون الأحمر الفاتح أو الوردي ، ونوى الخلايا باللون الأسود .

تعتبر صبغة رومانوسكي من الصبغات متعددة الألوان وتعتمد على مزيج من الإيوزين بالإضافة إلى ( الإيوزين المختزل كيميائيًا ) والأزرق الميثيليني منزوع الميثيل (يحتوي على نواتج الأكسدة اللازوردية A واللازوردية B). تتطور هذه الصبغة بألوان مختلفة لجميع هياكل الخلايا ("تأثير رومانوسكي-جيمسا") وبالتالي تم استخدامها في صبغ أشكال العدلات المتعددة ونوى الخلايا. تشمل المتغيرات الشائعة صبغة رايت وصبغة جينر وصبغة ماي-جرونوالد وصبغة ليشمان وصبغة جيمسا .

تُستخدم جميعها لفحص عينات الدم أو نخاع العظم . وهي مفضلة على H&E لفحص خلايا الدم لأن أنواعًا مختلفة من الكريات البيضاء (خلايا الدم البيضاء) يمكن تمييزها بسهولة. كما أنها مناسبة أيضًا لفحص الدم للكشف عن الطفيليات التي تنتقل عن طريق الدم مثل الملاريا . ^[14]

الصبغ الفضي هو استخدام الفضة لصبغ المقاطع النسيجية . هذا النوع من الصبغ مهم في إظهار البروتينات (على سبيل المثال الكولاجين من النوع الثالث ) والحمض النووي . يستخدم لإظهار كل من المواد داخل الخلايا وخارجها . يستخدم الصبغ الفضي أيضًا في الرحلان الكهربائي للهلام بالتدرج الحراري .

تختزل الخلايا الأرجنتافينية محلول الفضة إلى فضة معدنية بعد تثبيت الفورمالين . تم اكتشاف هذه الطريقة من قبل الإيطالي كاميلو جولجي ، باستخدام تفاعل بين نترات الفضة وثنائي كرومات البوتاسيوم ، وبالتالي ترسب كرومات الفضة في بعض الخلايا (انظر طريقة جولجي ). تختزل الخلايا المحبة للجيروفيلية محلول الفضة إلى فضة معدنية بعد تعرضها للصبغة التي تحتوي على عامل اختزال . ومن الأمثلة على ذلك الهيدروكينون أو الفورمالين.

تستخدم صبغة السودان أصباغ السودان لصبغ المواد المحبة للدهون، والتي غالبًا ما تتضمن الدهون . غالبًا ما يتم استخدام صبغات السودان III ، والسودان IV ، والزيت الأحمر O ، وتيتروكسيد الأوزميوم ، والسودان الأسود B. غالبًا ما يتم استخدام صبغة السودان لتحديد مستوى الدهون في البراز في تشخيص الإسهال الدهني .

صبغة Wirtz-Conklin هي تقنية خاصة مصممة لصبغ الأبواغ الحقيقية باستخدام صبغة الأخضر المالاكيت كصبغة أساسية والصفرانين كصبغة مضادة. بمجرد صبغها، لا تفقد لونها. إن إضافة الحرارة أثناء عملية الصبغ هي عامل مساهم كبير. ^[15] تساعد الحرارة على فتح غشاء الجراثيم حتى تتمكن الصبغة من الدخول. الغرض الرئيسي من هذه الصبغة هو إظهار إنبات جراثيم البكتيريا. إذا كانت عملية الإنبات جارية، فإن الجراثيم ستتحول إلى اللون الأخضر بسبب الأخضر المالاكيت وستكون الخلية المحيطة حمراء بسبب الصفرانين. يمكن أن تساعد هذه الصبغة أيضًا في تحديد اتجاه الجراثيم داخل الخلية البكتيرية؛ سواء كانت طرفية (عند الطرف)، أو تحت الطرفية (داخل الخلية)، أو مركزية (في منتصف الخلية تمامًا).

تسمح صبغة الببتيد الهجين الكولاجيني (CHP) بطريقة سهلة ومباشرة لصبغ الكولاجين المتحلل من أي نوع (النوع الأول والثاني والرابع وما إلى ذلك) بغض النظر عما إذا كان قد تعرض للتلف أو التدهور من خلال وسائل إنزيمية أو ميكانيكية أو كيميائية أو حرارية. تعمل عن طريق إعادة الطي إلى حلزون الكولاجين الثلاثي مع الخيوط المفردة المتاحة في الأنسجة. يمكن تصور CHPs بواسطة مجهر فلوري بسيط .

تتفاعل أو تتركز أصباغ مختلفة في أجزاء مختلفة من الخلية أو النسيج، وتُستخدم هذه الخصائص لصالح الكشف عن أجزاء أو مناطق معينة. فيما يلي قائمة ببعض أكثر البقع البيولوجية شيوعًا. ما لم يُذكر خلاف ذلك، يمكن استخدام جميع هذه الأصباغ مع الخلايا والأنسجة الثابتة؛ يتم ذكر الأصباغ الحيوية (المناسبة للاستخدام مع الكائنات الحية).

البرتقالي الأكريديني (AO) هو صبغة كاتيونية فلورية انتقائية للأحماض النووية مفيدة لتحديد دورة الخلية. إنه نفاذ للخلايا، ويتفاعل مع الحمض النووي والحمض النووي الريبي عن طريق التداخل أو الجذب الكهروستاتيكي. عندما يرتبط بالحمض النووي، فإنه يشبه إلى حد كبير الفلوريسين من الناحية الطيفية. مثل الفلوريسين، فهو مفيد أيضًا كصبغة غير محددة لإضاءة الخلايا المصبوغة تقليديًا على سطح عينة صلبة من الأنسجة (تلوين الإضاءة الخلفية بالفلورسنت ^[16] ).

^{[17] يضفي} اللون البني بسمارك (ويُعرف أيضًا باسم البني بسمارك Y أو البني مانشستر) لونًا أصفر على المخاط الحمضي ولونًا بنيًا مكثفًا على الخلايا البدينة. أحد عيوب هذه الصبغة أنها تمحو أي بنية أخرى تحيط بها وتجعل جودة التباين منخفضة. يجب إقرانها بصبغات أخرى لتكون مفيدة. بعض الصبغات التكميلية المستخدمة جنبًا إلى جنب مع البني بسمارك هي الهيماتوكسيلين والأزرق تولويدين والتي توفر تباينًا أفضل داخل عينة الأنسجة.

الكارمين هو صبغة حمراء شديدة تستخدم لصبغ الجليكوجين ، في حين أن الشبة الكارمينية هي صبغة نووية. تتطلب بقع الكارمين استخدام مادة رابطة، عادةً الألومنيوم .

يصبغ اللون الأزرق اللامع Coomassie البروتينات بلون أزرق قوي غير محدد. ويستخدم غالبًا في التحليل الكهربائي للهلام.

تصبغ صبغة الكريسيل البنفسجية المكونات الحمضية في سيتوبلازم الخلايا العصبية باللون البنفسجي، وخاصة أجسام نيسل . تستخدم هذه الصبغة غالبًا في أبحاث الدماغ.

عند دمجه مع مادة رابطة مناسبة، يصبغ البنفسج البلوري جدران الخلايا باللون الأرجواني. البنفسج البلوري هو الصبغة المستخدمة في صبغة جرام.

DAPI عبارة عن صبغة نووية فلورية ، يتم إثارتها بواسطة الضوء فوق البنفسجي وتظهر فلورية زرقاء قوية عند ارتباطها بالحمض النووي . يرتبط DAPI بتكرارات غنية بـ A = T للكروموسومات. كما لا يمكن رؤية DAPI باستخدام المجهر الناقل العادي. يمكن استخدامه في الخلايا الحية أو الثابتة. الخلايا الملطخة بـ DAPI مناسبة بشكل خاص لعد الخلايا. ^[18]

يستخدم الإيوزين غالبًا كصبغة مضادة للهيماتوكسيلين، مما يضفي لونًا ورديًا أو أحمر على المواد السيتوبلازمية والأغشية الخلوية وبعض الهياكل خارج الخلية. كما يضفي لونًا أحمر قويًا على خلايا الدم الحمراء . يمكن أيضًا استخدام الإيوزين كصبغة مضادة في بعض أشكال صبغة جرام، وفي العديد من البروتوكولات الأخرى. يوجد في الواقع مركبان وثيقا الصلة يشار إليهما عادةً باسم الإيوزين. غالبًا ما يتم استخدام الإيوزين Y (المعروف أيضًا باسم الإيوزين Y ws أو الإيوزين المصفر)؛ له صبغة صفراء خفيفة جدًا. مركب الإيوزين الآخر هو الإيوزين B (الإيوزين المزرق أو الأحمر الإمبراطوري)؛ له صبغة زرقاء خافتة جدًا. الصبغتان قابلتان للتبادل، واستخدام أحدهما أو الآخر هو أكثر مسألة تفضيل وتقاليد.

يتداخل بروميد الإيثيديوم ويصبغ الحمض النووي، مما يوفر صبغة حمراء برتقالية فلورية. وعلى الرغم من أنه لن يصبغ الخلايا السليمة، إلا أنه يمكن استخدامه لتحديد الخلايا التي هي في المراحل النهائية من موت الخلايا المبرمج - حيث تحتوي هذه الخلايا على أغشية أكثر نفاذية بكثير . وبالتالي، غالبًا ما يستخدم بروميد الإيثيديوم كعلامة على موت الخلايا المبرمج في مجموعات الخلايا وتحديد نطاقات الحمض النووي في الرحلان الكهربائي للهلام . يمكن أيضًا استخدام الصبغة بالاشتراك مع البرتقالي الأكريديني (AO) في عد الخلايا القابلة للحياة. تتسبب صبغة EB/AO المدمجة هذه في توهج الخلايا الحية باللون الأخضر بينما تحتفظ الخلايا الميتة بالفلورسنت الأحمر البرتقالي المميز.

يمكن استخدام حمض الفوكسين لصبغ الكولاجين أو العضلات الملساء أو الميتوكوندريا . يستخدم حمض الفوكسين كصبغة نووية وسيتوبلازمية في طريقة مالوري للثلاثي الكرومي. يصبغ حمض الفوكسين السيتوبلازم في بعض أشكال ثلاثي الكروم لميسون. في بيكرو-فوكسين لفان جيسون، يضفي حمض الفوكسين لونه الأحمر على ألياف الكولاجين. حمض الفوكسين هو أيضًا صبغة تقليدية للميتوكوندريا (طريقة ألتمان).

الهيماتوكسيلين (الهيماتوكسيلين في أمريكا الشمالية) هو صبغة نووية. ^[10] يستخدم مع المادة الموردة، ويصبغ الهيماتوكسيلين النوى باللون الأزرق البنفسجي أو البني. ^[10] يستخدم غالبًا مع الإيوزين في صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (الهيماتوكسيلين والإيوسين)، وهي واحدة من أكثر الإجراءات شيوعًا في علم الأنسجة . ^[10]

هوكست هو مركب مشتق من ثنائي بنزيميدازول يرتبط بالأخدود الصغير في الحمض النووي . يستخدم غالبًا في المجهر الفلوري لصبغ الحمض النووي، تظهر بقع هوكست باللون الأصفر عند إذابتها في المحاليل المائية وتنبعث منها ضوء أزرق تحت إثارة الأشعة فوق البنفسجية. هناك نوعان رئيسيان من هوكست : هوكست 33258 وهوكست 33342. المركبان متشابهان وظيفيًا، ولكن مع اختلاف بسيط في البنية. يحتوي هوكست 33258 على مجموعة هيدروكسيل طرفية وبالتالي يكون أكثر قابلية للذوبان في المحلول المائي، ومع ذلك فإن هذه الخاصية تقلل من قدرته على اختراق الغشاء البلازمي . يحتوي هوكست 33342 على استبدال إيثيلي في مجموعة الهيدروكسيل الطرفية (أي مجموعة إيثيل إيثر) مما يجعله أكثر كراهية للماء لمرور أسهل عبر الغشاء البلازمي

يستخدم اليود في الكيمياء كمؤشر للنشا . عندما يختلط النشا باليود في المحلول، يتطور لون أزرق داكن للغاية، يمثل مركب النشا/اليود. النشا مادة شائعة في معظم خلايا النبات، وبالتالي فإن محلول اليود الضعيف سيصبغ النشا الموجود في الخلايا. اليود هو أحد مكونات تقنية التلوين المعروفة باسم صبغة جرام ، المستخدمة في علم الأحياء الدقيقة . يستخدم اليود كمادة رابطة في صبغة جرام، حيث يعزز دخول الصبغة من خلال المسام الموجودة في جدار الخلية/الغشاء.

محلول لوغول أو يود لوغول (IKI) هو محلول بني اللون يتحول إلى اللون الأسود في وجود النشويات ويمكن استخدامه كصبغة للخلايا مما يجعل نوى الخلايا أكثر وضوحًا.

يستخدم محلول لوغول مع الخل العادي (حمض الأسيتيك) لتحديد التغيرات السرطانية وما قبل السرطانية في أنسجة عنق الرحم والمهبل أثناء فحوصات المتابعة "لطاخة عنق الرحم" استعدادًا للخزعة. يتسبب حمض الأسيتيك في تحول الخلايا غير الطبيعية إلى اللون الأبيض، بينما تصبغ الأنسجة الطبيعية باللون البني الماهوجني بسبب اليود. ^[19]

يمكن استخدام اللون الأخضر المالاكيت (المعروف أيضًا باسم الأخضر الماسي B أو الأخضر الفيكتوري B) كصبغة مضادة للزرقة الخضراء للسافرانين في تقنية تلوين جيمينيز للبكتيريا. ويمكن استخدامه أيضًا لصبغ الجراثيم مباشرة .

يستخدم الأخضر الميثيل بشكل شائع مع المجاهر ذات المجال الساطع، وكذلك المجاهر الفلورية ^[20] لصبغ الكروماتين في الخلايا بحيث يمكن رؤيتها بسهولة أكبر.

يستخدم الميثيلين الأزرق في صبغ الخلايا الحيوانية، مثل خلايا الخد البشرية، لجعل نواتها أكثر وضوحًا. كما يستخدم أيضًا في صبغ أفلام الدم في علم الخلايا.

بقع حمراء محايدة (أو حمراء التولولين) مادة نيسل الحمراء. تستخدم عادة كصبغة مضادة مع صبغات أخرى.

يصبغ اللون الأزرق النيلي (أو الأزرق النيلي أ) نوى الخلايا باللون الأزرق. ويمكن استخدامه مع الخلايا الحية.

يتم تكوين اللون الأحمر النيلي (المعروف أيضًا باسم أوكسازون النيل الأزرق) عن طريق غلي اللون الأزرق النيلي مع حمض الكبريتيك . ينتج عن هذا مزيج من اللون الأحمر النيلي والأزرق النيلي. اللون الأحمر النيلي هو صبغة محبة للدهون ؛ حيث تتراكم في الكريات الدهنية داخل الخلايا، مما يؤدي إلى صبغها باللون الأحمر. يمكن استخدام اللون الأحمر النيلي مع الخلايا الحية. يتألق بقوة عند تقسيمه إلى دهون، ولكن عمليًا لا يتألق على الإطلاق في المحلول المائي.

يستخدم رباعي أكسيد الأوزميوم في المجهر الضوئي لصبغ الدهون . يذوب في الدهون، ويختزل بالمواد العضوية إلى الأوزميوم العنصري، وهو مادة سوداء يمكن رؤيتها بسهولة.

يوديد البروبيديوم هو عامل تداخل فلوري يمكن استخدامه لصبغ الخلايا. يستخدم يوديد البروبيديوم كصبغة للحمض النووي في قياس التدفق الخلوي لتقييم قابلية الخلايا للبقاء أو محتوى الحمض النووي في تحليل دورة الخلية، أو في المجهر لتصور النواة والعضيات الأخرى التي تحتوي على الحمض النووي. لا يستطيع يوديد البروبيديوم عبور غشاء الخلايا الحية، مما يجعله مفيدًا للتمييز بين الخلايا الميتة والخلايا الميتة والخلايا السليمة. يرتبط يوديد البروبيديوم أيضًا بالحمض النووي الريبي، مما يستلزم العلاج بالنوكليازات للتمييز بين صبغ الحمض النووي الريبي والحمض النووي.

الرودامين عبارة عن صبغة فلورية خاصة بالبروتين تستخدم عادة في المجهر الفلوري.

السافرانين (أو السافرانين O) هو صبغة حمراء كاتيونية. ترتبط بالنوى (DNA) وغيرها من بوليانيونات الأنسجة ، بما في ذلك جليكوز أمينوغليكان في الغضاريف والخلايا البدينة، ومكونات اللجنين والبلاستيدات في أنسجة النباتات. ^[21] لا ينبغي الخلط بين السافرانين والزعفران، وهي صبغة طبيعية باهظة الثمن تستخدم في بعض الطرق لإضفاء اللون الأصفر على الكولاجين، للتباين مع الألوان الزرقاء والحمراء التي تضفيها الصبغات الأخرى على النوى والسيتوبلازم في الأنسجة الحيوانية (بما في ذلك البشرية).

إن الكتابة الخاطئة "safranin" شائعة الاستخدام. إن النهاية -ine مناسبة لـ safranine O لأن هذه الصبغة عبارة عن أمين. ^{[4] [22] [23]}

تسمى الأنسجة التي تمتص البقع بالأنسجة الكروماتية . وقد تم تسمية الكروموسومات بهذا الاسم بسبب قدرتها على امتصاص البقع البنفسجية.

يمكن الإشارة إلى التقارب الإيجابي لبقعة معينة باللاحقة -philic . على سبيل المثال، يمكن الإشارة إلى الأنسجة التي تتلطخ ببقع زرقاء على أنها أزوروفيلية . يمكن أيضًا استخدام هذا لخصائص تلطيخ أكثر عمومية، مثل الحمضية للأنسجة التي تتلطخ بالبقع الحمضية (وخاصة الإيوزين )، والقاعدية عند التلوين بالأصباغ الأساسية ، والأمفوفيلية ^[24] عند التلوين بالأصباغ الحمضية أو القاعدية. على النقيض من ذلك، لا تمتص الأنسجة الكارهة للصبغة الصبغة الملونة بسهولة.

كما هو الحال في المجهر الضوئي، يمكن استخدام البقع لتعزيز التباين في المجهر الإلكتروني النافذ . وعادة ما تستخدم المركبات كثيفة الإلكترونات من المعادن الثقيلة.

^[25] حمض الفوسفوتنجستيك هو صبغة سلبية شائعة للفيروسات والأعصاب والسكريات المتعددة ومواد الأنسجة البيولوجية الأخرى. يستخدم في الغالب في شكل 0.5-2٪ درجة حموضة مما يجعله محايدًا ويقترن بالماء لصنع محلول مائي. يمتلئ حمض الفوسفوتنجستيك بمادة كثيفة الإلكترون تلطخ الخلفية المحيطة بالعينة باللون الداكن والعينة نفسها فاتحة. هذه العملية ليست تقنية إيجابية طبيعية للتلوين حيث تكون العينة داكنة وتظل الخلفية فاتحة.

يستخدم رباعي أكسيد الأوزميوم في المجهر الضوئي لصبغ الدهون . يذوب في الدهون، ويختزل بالمواد العضوية إلى عنصر الأوزميوم، وهو مادة سوداء يمكن رؤيتها بسهولة. ولأنه معدن ثقيل يمتص الإلكترونات، فهو ربما أكثر الصبغات شيوعًا المستخدمة في علم التشكل في المجهر الإلكتروني البيولوجي. كما يستخدم في صبغ البوليمرات المختلفة لدراسة شكلها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ .
₄يعتبر الأوزميوم متقلبًا للغاية وسامًا للغاية. وهو عامل مؤكسد قوي حيث أن رقم أكسدة الأوزميوم هو +8. وهو يؤكسد العديد من المواد بقوة، ويترك وراءه رواسب من الأوزميوم غير المتطاير في حالة أكسدة أقل.

يعتبر رباعي أكسيد الروثينيوم متطايرًا بنفس القدر وأكثر عدوانية من رباعي أكسيد الأوزميوم وقادرًا على تلطيخ المواد التي تقاوم صبغة الأوزميوم، على سبيل المثال البولي إيثيلين.

تشمل المواد الكيميائية الأخرى المستخدمة في تلوين المجهر الإلكتروني ما يلي: موليبدات الأمونيوم ، يوديد الكادميوم ، كاربوهيدرازيد ، كلوريد الحديديك ، هيكسامين ، ثلاثي كلوريد الإنديوم ، نترات اللانثانوم (III) ، أسيتات الرصاص ، سترات الرصاص ، نترات الرصاص (II) ، حمض الدوري ، حمض الفوسفوموليبديك ، فيري سيانيد البوتاسيوم ، فيرو سيانيد البوتاسيوم ، أحمر الروثينيوم ، نترات الفضة ، بروتينات الفضة ، كلورو أورايت الصوديوم، نترات الثاليوم ، ثيوسيميكاربازيد ، أسيتات اليورانيل ، نترات اليورانيل ، وكبريتات الفاناديل .

• لجنة البقع البيولوجية : مراقبة الجودة من قبل طرف ثالث وإصدار الشهادات للبقع
• علم الخلايا : دراسة الخلايا
• علم الأنسجة : دراسة الأنسجة
• المناعة النسيجية : استخدام المصل المضاد لوضع علامات على مستضدات محددة
• روثينيوم (II) تريس (باثوفينانثرولين ديسلفونات) ، صبغة بروتينية.
• الصبغة الحيوية : الصبغات التي لا تقتل الخلايا
• الصفحة : فصل جزيئات البروتين
• حقنة الباريوم - نوع من الصبغة الحيوية التي تخلق تباينًا في جزء الأشعة السينية من طيف الضوء
• التنقيط

• لجنة الصبغة البيولوجية هي شركة مستقلة غير ربحية تقوم باختبار الأصباغ منذ أوائل عشرينيات القرن العشرين وإصدار شهادات الموافقة على دفعات الأصباغ التي تلبي المعايير المعترف بها دوليًا.
• ملف مرجعي للأصباغ وتقنيات التلوين.
• الصبغ الحيوي للكائنات الأولية وتقنيات التثبيت المؤقتة ذات الصلة ~ هاوي، 2000
• الحديث عن التثبيت: الجزء الأول والجزء الثاني – بقلم م. خالد عمر
• صور مجهرية لبقع الأنسجة
• الأسئلة الشائعة حول تمارين التلوين في الصفحة الرئيسية لـ Sridhar Rao PN