تسلسل الجيل الثالث

بالمقارنة مع الجيل الثاني من تقنيات التسلسل، يتميز الجيل الثالث من التسلسل بميزة واضحة تتمثل في إنتاج قراءات أطول بكثير. ومن المتوقع أن تُسهم هذه القراءات الأطول في تخفيف العديد من التحديات الحسابية المتعلقة بتجميع الجينوم، وإعادة بناء النسخ، وعلم الجينوم البيئي، من بين مجالات أخرى مهمة في علم الأحياء والطب الحديثين. ^{[ 2 ]}

من المعروف أن جينومات حقيقيات النوى، بما في ذلك الرئيسيات والبشر، معقدة وتحتوي على عدد كبير من المناطق المتكررة الطويلة. لذا، تعتمد قراءات التسلسل القصيرة من الجيل الثاني على استراتيجيات تقريبية لاستنتاج التسلسلات على نطاقات طويلة لأغراض التجميع وتحديد المتغيرات الجينية. وقد استُخدمت قراءات أزواج الأطراف في الجيل الثاني للتغلب على هذه القيود. ومع ذلك، غالبًا ما تكون أطوال أجزاء أزواج الأطراف غير معروفة بدقة، ويجب تقريبها أيضًا. وبفضل إمكانية الحصول على قراءات طويلة، تتمتع تقنيات التسلسل من الجيل الثالث بمزايا واضحة.

المؤشرات فوق الجينية هي تعديلات مستقرة وقابلة للتوريث على جزيء الحمض النووي (DNA) لا تقع ضمن تسلسله. ومن الأمثلة على ذلك مثيلة الحمض النووي في مواقع CpG ، والتي وُجد أنها تؤثر على التعبير الجيني. وتُعد تعديلات الهيستون مثالًا آخر. يعتمد الجيل الحالي من تقنيات التسلسل على تقنيات مخبرية مثل تسلسل ChIP للكشف عن المؤشرات فوق الجينية. تتضمن هذه التقنيات وسم شريط الحمض النووي، وكسر الأجزاء التي تحتوي على المؤشرات وترشيحها، ثم إجراء التسلسل. قد يُمكّن تسلسل الجيل الثالث من الكشف المباشر عن هذه المؤشرات نظرًا لإشارتها المميزة عن القواعد النيوكليوتيدية الأربعة الأخرى. ^{[ 6 ]}

تشمل المزايا المهمة الأخرى لتقنيات التسلسل من الجيل الثالث سهولة الحمل وسرعة التسلسل. ^{[ 7 ]} ونظرًا لأن معالجة العينات المسبقة المطلوبة أقل بكثير مقارنةً بتقنيات التسلسل من الجيل الثاني، يُمكن تصميم أجهزة أصغر حجمًا. وقد طرحت شركة أوكسفورد نانوبور تكنولوجي مؤخرًا جهاز التسلسل MinION في الأسواق . يتميز هذا الجهاز بحجمه الذي يُقارب حجم ذاكرة فلاش USB عادية ، ويمكن استخدامه بسهولة عن طريق توصيله بجهاز كمبيوتر محمول. إضافةً إلى ذلك، ولأن عملية التسلسل لا تتم بالتوازي عبر مناطق الجينوم، يُمكن جمع البيانات وتحليلها في الوقت الفعلي. قد تكون هذه المزايا لتقنيات التسلسل من الجيل الثالث مناسبة تمامًا للمستشفيات التي تتطلب جمع البيانات وتحليلها بسرعة وفي الموقع.

عند توفر جينوم مرجعي ، كما هو الحال مع الإنسان، يمكن ببساطة محاذاة قراءات التسلسل الجديدة مع هذا الجينوم المرجعي لتحديد خصائصها. يُعدّ هذا التجميع المرجعي سريعًا وسهلًا، ولكنه ينطوي على عيب يتمثل في "إخفاء" التسلسلات الجديدة والتغيرات الكبيرة في عدد النسخ . إضافةً إلى ذلك، لا توجد جينومات مرجعية لمعظم الكائنات الحية حتى الآن.

يُعدّ التجميع من الصفر نهجًا بديلًا لتجميع الجينوم مقارنةً بالمحاذاة المرجعية. ويشير إلى إعادة بناء تسلسلات الجينوم الكاملة بالكامل من قراءات التسلسل الخام. يُختار هذا الأسلوب عندما لا يتوفر جينوم مرجعي، أو عندما يكون نوع الكائن الحي غير معروف كما هو الحال في علم الجينوم البيئي ، أو عندما توجد متغيرات جينية ذات أهمية قد لا تُكتشف بواسطة محاذاة الجينوم المرجعي.

نظراً لقصر قراءات التسلسل التي تنتجها تقنيات التسلسل الحالية، يُعدّ التجميع من الصفر مشكلة حسابية معقدة . وعادةً ما يُعالج هذا الأمر من خلال عملية تكرارية لإيجاد وربط قراءات التسلسل ذات التداخلات المنطقية. وقد استُخدمت تقنيات حسابية وإحصائية متنوعة، مثل رسوم بيانية دي بروين ورسوم بيانية توافقية لتخطيط التداخل، لحل هذه المشكلة. ومع ذلك، ونظراً للطبيعة المتكررة للغاية لجينومات حقيقيات النوى، لا تزال إعادة بناء تسلسلات الجينوم بدقة واكتمال في التجميع من الصفر أمراً صعباً. وقد طُرحت قراءات الأطراف المزدوجة كحل محتمل، على الرغم من أن أطوال القطع الدقيقة غالباً ما تكون غير معروفة ويجب تقريبها. ^{[ 8 ]}

قد تُخفف أطوال القراءة الطويلة التي توفرها تقنيات التسلسل من الجيل الثالث من العديد من التحديات التي تواجه تجميع الجينوم من الصفر. فعلى سبيل المثال، إذا أمكن تسلسل منطقة متكررة كاملة بشكل لا لبس فيه بقراءة واحدة، فلن تكون هناك حاجة إلى أي استدلال حسابي. وقد اقتُرحت طرق حسابية للتخفيف من مشكلة ارتفاع معدلات الخطأ. فعلى سبيل المثال، أظهرت إحدى الدراسات أن تجميع جينوم ميكروبي من الصفر باستخدام تقنية تسلسل PacBio وحدها كان أداؤه أفضل من تجميعه باستخدام تقنيات التسلسل من الجيل الثاني. ^{[ 9 ]}

يمكن أيضًا استخدام تقنية التسلسل من الجيل الثالث بالتزامن مع تقنية التسلسل من الجيل الثاني. يُشار إلى هذا النهج غالبًا باسم التسلسل الهجين. على سبيل المثال، يمكن استخدام قراءات طويلة من تقنية التسلسل من الجيل الثالث لحل الغموض الموجود في الجينومات التي جُمعت سابقًا باستخدام تقنية التسلسل من الجيل الثاني. من ناحية أخرى، استُخدمت قراءات قصيرة من الجيل الثاني لتصحيح الأخطاء الموجودة في قراءات الجيل الثالث الطويلة. بشكل عام، أظهر هذا النهج الهجين تحسنًا ملحوظًا في تجميع الجينومات من الصفر. ^{[ 10 ]}

تتطلب الطرق الأكثر شيوعًا حاليًا لفحص حالة المثيلة إجراء تحليل يُجزّئ الحمض النووي قبل التسلسل القياسي من الجيل الثاني على منصة Illumina . ونتيجةً لقصر طول القراءة، تُفقد المعلومات المتعلقة بأنماط المثيلة الأطول. ^{[ 6 ]} توفر تقنيات التسلسل من الجيل الثالث إمكانية التسلسل الفوري لجزيء واحد لقراءات أطول، والكشف عن تعديلات الحمض النووي دون الحاجة إلى التحليل المذكور آنفًا. ^{[ 12 ]}

استُخدم جهاز MinION من شركة Oxford Nanopore Technologies للكشف عن تعديل الحمض النووي (DNAm). عند مرور كل خيط من الحمض النووي عبر المسام، يُنتج إشارات كهربائية وُجد أنها حساسة للتغيرات فوق الجينية في النيوكليوتيدات. استُخدم نموذج ماركوف المخفي (HMM) لتحليل بيانات MinION للكشف عن تعديل الحمض النووي 5-ميثيل سيتوزين (5mC). ^{[ 6 ]} دُرِّب النموذج باستخدام حمض نووي مُعدّل صناعيًا من بكتيريا الإشريكية القولونية ، وقُيست الإشارات الناتجة بتقنية المسام النانوية. ثم استُخدم النموذج المُدرَّب للكشف عن 5mC في قراءات جينومية من MinION لخط خلوي بشري يحتوي على ميثيلوم مرجعي. يتمتع المصنف بدقة 82% في المواقع الفردية المأخوذة عشوائيًا، وترتفع هذه الدقة إلى 95% عند تطبيق عتبات أكثر صرامة. ^{[ 6 ]}

تتناول طرق أخرى أنواعًا مختلفة من تعديلات الحمض النووي باستخدام منصة MinION. درس ستويبر وزملاؤه 4-ميثيل سيتوزين (4mC) و6-ميثيل أدينين (6mA)، بالإضافة إلى 5mC، كما طوروا برنامجًا لعرض بيانات MinION الخام مباشرةً بطريقة سهلة الاستخدام. ^{[ 13 ]} ووجدوا أنه في بكتيريا الإشريكية القولونية ، التي تمتلك ميثيلومًا معروفًا ، يمكن استخدام نوافذ أحداث بطول 5 أزواج قاعدية لتقسيم الإشارات الكهربائية الخام لـ MinION وتحليلها إحصائيًا. يمكن لاختبار مان-ويتني U البسيط الكشف عن الأجزاء المعدلة من تسلسل الإشريكية القولونية ، بالإضافة إلى تقسيم التعديلات إلى مناطق 4mC أو 6mA أو 5mC. ^{[ 13 ]}

يبدو من المرجح أنه في المستقبل، سيتم استخدام البيانات الأولية لجهاز MinION للكشف عن العديد من العلامات اللاجينية المختلفة في الحمض النووي.

استُخدم تسلسل PacBio أيضًا للكشف عن مثيلة الحمض النووي. في هذه المنصة، يتوافق عرض النبضة - عرض نبضة الضوء الفلوري - مع قاعدة محددة. في عام 2010، تبيّن أن المسافة بين النبضات في العينات الضابطة والمثيلة تختلف، وأن لكل نوع من أنواع المثيلة عرض نبضة مميز. ^{[ 12 ]} في عام 2012، وباستخدام منصة PacBio، تم تحديد مواقع ارتباط ناقلات مثيل الحمض النووي. ^{[ 14 ]} وفي عام 2015، تم الكشف عن مثيلة N6 في دودة Caenorhabditis elegans. ^{[ 15 ]} وفي عام 2016، تم الكشف عن مثيلة الحمض النووي على N6- أدينين باستخدام منصة PacBio في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران ^{. [ 16 ]}

تُعد الأشكال الأخرى لتعديلات الحمض النووي - الناتجة عن المعادن الثقيلة أو الأكسدة أو أضرار الأشعة فوق البنفسجية - من الطرق الممكنة للبحث باستخدام تقنيات التسلسل من الجيل الثالث مثل Oxford Nanopore و PacBio.

تطلّبت بيانات MinION الخام معالجةً، كالتطبيع إلى الإشارة المتوسطة، مما قلّل من قدرة التقنية على العمل في الوقت الفعلي. ^{[ 13 ]} ولا تزال مشكلة اتساق الإشارات الكهربائية قائمة، ما يصعّب تحديد النيوكليوتيدات بدقة. يتميّز MinION بإنتاجية منخفضة؛ ونظرًا لصعوبة الحصول على قراءات متداخلة متعددة، فإنّ ذلك يُفاقم مشاكل دقة الكشف عن تعديلات الحمض النووي في المراحل اللاحقة. يتطلّب كلٌّ من نموذج ماركوف المخفي والأساليب الإحصائية المستخدمة مع بيانات MinION الخام رصدًا متكررًا لتعديلات الحمض النووي للكشف عنها، ما يعني ضرورة وجود النيوكليوتيدات المُعدّلة بشكلٍ ثابت في نسخٍ متعددة من الجينوم، على سبيل المثال في خلايا أو بلازميدات متعددة في العينة.

بالنسبة لمنصة PacBio أيضًا، تختلف متطلبات التغطية تبعًا لنوع المثيلة المتوقع اكتشافه. وحتى مارس 2017، لم يكن من الممكن اكتشاف عوامل فوق جينية أخرى، مثل تعديلات الهيستون، باستخدام تقنيات الجيل الثالث. غالبًا ما تُفقد أنماط المثيلة الأطول نظرًا للحاجة إلى تجميع أجزاء أصغر.

التضفير البديل (AS) هو العملية التي قد ينتج عنها جين واحد نسخ mRNA متعددة ومختلفة، وبالتالي ترجمات بروتينية مختلفة. ^{[ 18 ]} تشير بعض الأدلة إلى أن التضفير البديل ظاهرة شائعة، وقد يلعب دورًا رئيسيًا في تحديد الأنماط الظاهرية للكائنات الحية، وخاصة في حقيقيات النوى المعقدة؛ إذ تحتوي جميع حقيقيات النوى على جينات تتكون من إنترونات قد تخضع للتضفير البديل. على وجه الخصوص، تشير التقديرات إلى أن التضفير البديل يحدث في 95% من جميع الجينات البشرية متعددة الإكسونات. ^{[ 19 ]} يتمتع التضفير البديل بإمكانية لا يمكن إنكارها للتأثير على عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية. إن تطوير المعرفة في هذا المجال له آثار بالغة الأهمية على دراسة علم الأحياء بشكل عام.

تُنتج تقنيات التسلسل الحالية قراءات قصيرة فقط، مما يُقيّد بشدة القدرة على اكتشاف النسخ الجينية المتميزة؛ إذ يجب إعادة هندسة هذه القراءات القصيرة إلى النسخ الأصلية التي كان من الممكن أن تُنتج القراءات المُلاحظة. ^{[ 20 ]} وتزداد هذه المهمة تعقيدًا بسبب التباين الكبير في مستويات التعبير بين النسخ، وبالتالي تباين تغطية القراءات عبر تسلسل الجين. ^{[ 20 ]} إضافةً إلى ذلك، قد تتشارك النسخ الفردية في الإكسونات ، مما يجعل الاستدلالات الواضحة شبه مستحيلة. ^{[ 18 ]} وتستند الطرق الحسابية الحالية في استدلالاتها إلى تراكم القراءات القصيرة في مواقع تسلسلية مختلفة، غالبًا من خلال وضع افتراضات مُبسطة. ^{[ 20 ]} ويتبع برنامج Cufflinks نهجًا مُقتصدًا، ساعيًا إلى تفسير جميع القراءات بأقل عدد ممكن من النسخ. ^{[ 21 ]} من ناحية أخرى، يحاول برنامج StringTie تقدير وفرة النسخ في الوقت نفسه أثناء تجميع القراءات. ^{[ 20 ]} ورغم منطقية هذه الطرق، إلا أنها قد لا تُحدد دائمًا النسخ الحقيقية.

أجرت دراسة نُشرت عام 2008 مسحًا لـ 25 بروتوكولًا مختلفًا لإعادة بناء النسخ الجينية. ^{[ 17 ]} أشارت نتائجها إلى أن الطرق الحالية ضعيفة عمومًا في تجميع النسخ الجينية، على الرغم من أن قدرتها على كشف الإكسونات الفردية لا تزال سليمة نسبيًا. ^{[ 17 ]} ووفقًا للتقديرات، يبلغ متوسط ​​حساسية كشف الإكسونات في البروتوكولات الـ 25 نحو 80% لجينات دودة Caenorhabditis elegans . ^{[ 17 ]} في المقابل، تنخفض حساسية تحديد النسخ الجينية إلى 65%. أما بالنسبة للبشر، فقد أفادت الدراسة أن متوسط ​​حساسية كشف الإكسونات بلغ 69%، بينما بلغ متوسط ​​حساسية كشف النسخ الجينية 33% فقط. ^{[ 17 ]} بعبارة أخرى، بالنسبة للبشر، تستطيع الطرق الحالية تحديد أقل من نصف جميع النسخ الجينية الموجودة.

أظهرت تقنيات التسلسل من الجيل الثالث آفاقًا واعدة في حل مشكلة الكشف عن النسخ وتقدير وفرة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) على مستوى النسخ. ورغم أن معدلات الخطأ لا تزال مرتفعة، إلا أن هذه التقنيات قادرة على إنتاج قراءات أطول بكثير. ^{[ 22 ]} وقد طرحت شركة باسيفيك بيوساينس منصة iso-seq، التي تقترح تسلسل جزيئات mRNA بأطوالها الكاملة. ^{[ 22 ]} ومن المتوقع أن تطرح شركة أوكسفورد نانوبور تقنيات مماثلة. ويمكن التخفيف من مشكلة ارتفاع معدلات الخطأ من خلال قراءات قصيرة إضافية عالية الجودة. وقد تم اختبار هذا النهج سابقًا، وأُفيد بأنه يقلل معدل الخطأ بأكثر من ثلاثة أضعاف. ^{[ 23 ]}

تتمثل الميزة الرئيسية لتقنيات التسلسل من الجيل الثالث في علم الجينوم البيئي في سرعة التسلسل مقارنةً بتقنيات الجيل الثاني. وتُعد سرعة التسلسل مهمة، على سبيل المثال، في المجال السريري (مثل تحديد مسببات الأمراض )، لتمكين التشخيص الفعال واتخاذ الإجراءات السريرية في الوقت المناسب.

استُخدم جهاز MinION من شركة Oxford Nanopore عام 2015 للكشف الميتاجينومي الفوري عن مسببات الأمراض في عينات سريرية معقدة ذات خلفية عالية. تم تسلسل أول قراءة لفيروس إيبولا (EBOV) بعد 44 ثانية من جمع البيانات . ^{[ 24 ]} كانت هناك مطابقة موحدة للقراءات مع الجينوم؛ حيث تطابقت قراءة واحدة على الأقل مع أكثر من 88% من الجينوم. سمحت القراءات الطويلة نسبيًا بتسلسل جينوم فيروسي شبه كامل بدقة عالية (97-99% تطابق) مباشرة من عينة سريرية أولية. ^{[ 24 ]}

يُعد جين الحمض النووي الريبوزي 16S مؤشرًا شائعًا في دراسات تنوع المجتمعات الميكروبية . وقد استُخدمت كل من منصة MinION ومنصة SMRT من PacBio لتسلسل هذا الجين. ^{[ 25 ] [ 26 ]} وفي هذا السياق، كان معدل الخطأ في PacBio مماثلاً لمعدل الخطأ في القراءات الأقصر من منصتي التسلسل 454 وMiSeq من Illumina.

حال معدل الخطأ المرتفع في جهاز MinION (حوالي 10-40%) دون تحديد مؤشرات مقاومة المضادات الحيوية ، والتي تتطلب دقة على مستوى النوكليوتيد الواحد. وللسبب نفسه، لم يتم تحديد مسببات الأمراض حقيقية النواة . ^{[ 24 ]} كما يُعدّ سهولة انتقال التلوث عند إعادة استخدام خلية التدفق نفسها (بروتوكولات الغسل القياسية غير فعّالة) مصدر قلق. قد تسمح الرموز الشريطية الفريدة بإجراء تحليلات متعددة. علاوة على ذلك، يُعدّ تحديد الأنواع بدقة للبكتيريا والفطريات والطفيليات أمرًا بالغ الصعوبة، نظرًا لتشابهها في جزء كبير من الجينوم، واختلاف بعضها بنسبة تقل عن 5%.

لا تزال تكلفة التسلسل لكل قاعدة أعلى بكثير من تكلفة تقنية MiSeq. ومع ذلك، فإن إمكانية إضافة تسلسلات كاملة الطول من كائنات حية، أصغر من الحد الأدنى للكشف باستخدام طريقة سانجر ، إلى قواعد البيانات المرجعية ^{[ 25 ]} قد تُسهم بشكل كبير في تحديد الكائنات الحية في علم الجينوم البيئي.