التثبيط غير التنافسي

التثبيط غير التنافسي هو نوع من أنواع تثبيط الإنزيمات، حيث يقلل المُثبِّط من نشاط الإنزيم ويرتبط به بنفس الكفاءة بغض النظر عما إذا كان قد ارتبط بالركيزة مسبقًا أم لا. ^{[ 1 ]} وهذا يختلف عن التثبيط التنافسي ، حيث تقل ألفة ارتباط الإنزيم بالركيزة في وجود المُثبِّط.

قد يرتبط المثبط بالإنزيم بغض النظر عما إذا كان الركيزة قد ارتبطت بالفعل، ولكن إذا كان لديه ألفة أعلى للارتباط بالإنزيم في حالة معينة أو أخرى، فإنه يسمى مثبطًا مختلطًا . ^{[ 1 ]}

خلال سنوات عمله كطبيب، أنشأ ليونور مايكليس وصديقه بيتر رونا مختبرًا صغيرًا في المستشفى، وعلى مدار خمس سنوات، نشر مايكليس أكثر من مئة بحث علمي. وخلال أبحاثه في المستشفى، كان أول من رصد أنواع التثبيط المختلفة، مستخدمًا الفركتوز والجلوكوز كمثبطات لنشاط إنزيم المالتاز . يقوم المالتاز بتفكيك المالتوز إلى وحدتين من الجلوكوز . وقد سمحت نتائج تلك التجربة بتمييز التثبيط غير التنافسي عن التثبيط التنافسي . يؤثر التثبيط غير التنافسي على قيمة kcat (وليس Km _{) في أي رسم بياني؛ إذ} يرتبط هذا المثبط بموقع متخصص لجزيء معين. وقد توصل مايكليس إلى أنه عند ارتباط المثبط، يُصبح الإنزيم غير نشط. ^{[ 2 ]}

على غرار العديد من علماء عصرهم، عملت ليونور مايكليس ومود مينتين على تفاعل يُستخدم لتغيير تركيب السكروز وتحويله إلى منتجين: الفركتوز والجلوكوز. ^{[ 2 ]} يُسمى الإنزيم المسؤول عن هذا التفاعل إنفرتاز ، وقد أثبتت حركيته ، وفقًا لمايكليس ومينتين، أنها ثورية في مجال حركية الإنزيمات الأخرى. عند التعبير عن معدل التفاعل المدروس، استنتجتا معادلة تصف المعدل بطريقة تشير إلى أنه يعتمد بشكل أساسي على تركيز الإنزيم، بالإضافة إلى وجود المادة المتفاعلة، ولكن إلى حد معين فقط. ^{[ 2 ] [ 3 ]}

وضع أدريان جون براون وفيكتور هنري الأساس لاكتشافات حركية الإنزيمات التي اشتهر بها مايكليس ومينتين. ^{[ 4 ]} تصور براون نظريًا الآلية المقبولة حاليًا لحركية الإنزيمات، لكنه لم يمتلك البيانات الكمية الكافية لتأكيدها. ^{[ 4 ]} قدم فيكتور هنري إسهاماتٍ كبيرة في حركية الإنزيمات خلال أطروحته للدكتوراه، إلا أنه أغفل الإشارة إلى أهمية تركيز أيون الهيدروجين والتغير التلقائي في جزيء الجلوكوز. كان هدف أطروحة هنري مقارنة معرفته بالتفاعلات المحفزة بالإنزيمات بالقوانين المعروفة للكيمياء الفيزيائية. ^{[ 2 ]} يُنسب إلى هنري الفضل في كونه أول من كتب المعادلة المعروفة الآن باسم معادلة مايكليس-مينتين. باستخدام الجلوكوز والفركتوز في التفاعلات التحفيزية التي يتحكم بها إنزيم المالتاز وإنفرتاز، كان ليونور مايكليس أول عالم يميز بين أنواع التثبيط المختلفة باستخدام مقياس الرقم الهيدروجيني (pH) الذي لم يكن موجودًا في زمن هنري. ^{[ 2 ]}

خلال عملهما على وصف معدل هذا التفاعل، اختبر مايكليس ومينتن فكرة العالم فيكتور هنري ، التي مفادها أن الإنزيم المستخدم لديه ميلٌ ما لكلا ناتجي هذا التفاعل - الفركتوز والجلوكوز - وعمّماها. ^{[ 2 ] [ 3 ]} وباستخدام أساليب هنري، أتقن مايكليس ومينتن تقريبًا مفهوم طريقة المعدل الابتدائي لتجارب الحالة المستقرة. أثناء دراستهما للتثبيط، وجدا أن التثبيط غير التنافسي (المختلط) يتميز بتأثيره على ثابت _{معدل التفاعل (kcat} ) ، بينما يتميز التثبيط التنافسي بتأثيره على السرعة (V). ^{[ 2 ]} في تجارب مايكليس ومينتن، ركزا بشكل كبير على تأثيرات الرقم الهيدروجيني على إنزيم الإنفرتيز باستخدام أيونات الهيدروجين. ^{[ 2 ]} إن إنفرتيز هو إنزيم موجود في الخميرة خارج الخلوية، ويحفز التفاعلات عن طريق التحلل المائي أو تحويل السكروز (مزيج من السكروز والفركتوز) إلى سكر محوّل . كان السبب الرئيسي لاستخدام إنزيم الإنفرتيز هو سهولة قياسه وإمكانية إجراء التجارب بسرعة أكبر. يدور السكروز في جهاز قياس الاستقطاب على شكل يمين الدوران (D)، بينما يدور السكر المحول على شكل يسار الدوران (L) . هذا ما جعل تتبع تحول السكر أمرًا بسيطًا نسبيًا. كما وجدوا أن α-D-جلوكوز يُطلق في التفاعلات التي يحفزها إنزيم الإنفرتيز، وهو غير مستقر للغاية ويتحول تلقائيًا إلى β-D-جلوكوز . ^{[ 4 ]} على الرغم من أن كليهما في شكل يمين الدوران، فقد لاحظوا هنا أن الجلوكوز يمكن أن يتغير تلقائيًا، وهو ما يُعرف أيضًا باسم التغير التلقائي في الدوران. كان عدم أخذ هذا في الاعتبار أحد الأسباب الرئيسية لفشل تجارب هنري. باستخدام إنزيم الإنفرتيز لتحفيز تحول السكروز، تمكنوا من معرفة مدى سرعة تفاعل الإنزيم عن طريق قياس الاستقطاب. لذلك، وُجد أن التثبيط غير التنافسي يحدث في التفاعل الذي يتم فيه قلب السكروز بواسطة الإنفرتيز. ^{[ 2 ]}

بينما ترتبط جميع المثبطات غير التنافسية بالإنزيم في مواقع غير تنافسية (أي مواقع أخرى غير موقعه النشط )، إلا أن ليس كل مثبط يرتبط في هذه المواقع يُعد مثبطًا غير تنافسي. ^{[ 1 ]} في الواقع، قد تعمل المثبطات غير التنافسية كمثبطات تنافسية أو غير تنافسية أو غير متنافسة . ^{[ 1 ]}

تستمر العديد من المصادر في الخلط بين هذين المصطلحين، ^{[ 5 ]} أو تنص على تعريف التثبيط التآزري على أنه تعريف التثبيط غير التنافسي.

يُحاكي التثبيط غير التنافسي نظامًا قد يرتبط فيه كل من المُثبِّط والركيزة بالإنزيم في أي لحظة. عندما يرتبط كل من الركيزة والمُثبِّط، لا يستطيع مُركَّب الإنزيم-الركيزة-المُثبِّط تكوين الناتج، ولا يُمكن تحويله إلا إلى مُركَّب الإنزيم-الركيزة أو مُركَّب الإنزيم-المُثبِّط. ويختلف التثبيط غير التنافسي عن التثبيط المختلط العام في أن للمُثبِّط ألفة متساوية للإنزيم ولمُركَّب الإنزيم-الركيزة.

على سبيل المثال، في تفاعلات تحلل الجلوكوز المحفزة بالإنزيمات ، يُحفز إنزيم بيروفات كيناز تراكم الفوسفينول وتحويله إلى بيروفات . يُعد الألانين حمضًا أمينيًا يُصنّع من البيروفات، كما أنه يُثبط إنزيم بيروفات كيناز أثناء تحلل الجلوكوز. الألانين مُثبط غير تنافسي، لذا فهو يرتبط بالركيزة بعيدًا عن الموقع النشط للإنزيم، مما يسمح بأن يكون الناتج النهائي. ^{[ 6 ]}

مثال آخر على التثبيط غير التنافسي هو تثبيط جلوكوز-6-فوسفات لإنزيم هيكسوكيناز في الدماغ. تحتوي ذرتا الكربون 2 و4 في جلوكوز-6-فوسفات على مجموعات هيدروكسيل ترتبط مع مجموعة الفوسفات الموجودة على ذرة الكربون 6 بمركب الإنزيم-المثبط. يختلف الركيزة والإنزيم في تركيب المجموعات التي يرتبط بها المثبط. قدرة جلوكوز-6-فوسفات على الارتباط بمواقع مختلفة في الوقت نفسه تجعله مثبطًا غير تنافسي. ^{[ 7 ]}

تتمثل الآلية الأكثر شيوعًا للتثبيط غير التنافسي في الارتباط العكسي للمثبط بموقع ألوستيري ، ولكن من الممكن أن يعمل المثبط عبر وسائل أخرى، بما في ذلك الارتباط المباشر بالموقع النشط. ويختلف هذا عن التثبيط التنافسي في أن ارتباط المثبط لا يمنع ارتباط الركيزة، والعكس صحيح، بل يمنع ببساطة تكوين الناتج لفترة محدودة.

يُقلل هذا النوع من التثبيط من السرعة القصوى للتفاعل الكيميائي دون تغيير تقارب الارتباط الظاهري للمحفز مع الركيزة (K _{_m} ^{التقريبي} - انظر حركية ميكايليس-مينتين ). عند إضافة مُثبِّط غير تنافسي، تتغير السرعة القصوى (V_max)، بينما تبقى قيمة K_m ثابتة. وفقًا لمخطط لاينويفر-بيرك، تنخفض السرعة القصوى (V_max) عند إضافة مُثبِّط غير تنافسي، وهو ما يظهر في المخطط من خلال تغير كلٍّ من الميل ونقطة التقاطع مع المحور الصادي عند إضافة هذا المُثبِّط. ^{[ 8 ]}

يتمثل الفرق الأساسي بين التثبيط التنافسي وغير التنافسي في أن التثبيط التنافسي يؤثر على قدرة الركيزة على الارتباط عن طريق ربط مثبط بدلاً من الركيزة، مما يقلل من ألفة الإنزيم للركيزة. أما في التثبيط غير التنافسي، فيرتبط المثبط بموقع ألوستيري ويمنع معقد الإنزيم-الركيزة من إتمام التفاعل الكيميائي. وهذا لا يؤثر على ثابت ميكايليس (Km) للإنزيم (للركيزة). ويختلف التثبيط غير التنافسي عن التثبيط غير التنافسي في أنه يسمح للركيزة بالارتباط بمعقد الإنزيم-المثبط وتكوين معقد إنزيم-ركيزة-مثبط، بينما في التثبيط غير التنافسي، يمنع الركيزة من الارتباط بمثبط الإنزيم من خلال تغيير في بنيتها الفراغية عند الارتباط الألوستيري.

في وجود مثبط غير تنافسي، تتساوى الألفة الظاهرية للإنزيم مع الألفة الفعلية. وفقًا لحركية ميكايليس-مينتين ، فإن K _{_m} ^app = K_{_m} . يمكن اعتبار ذلك نتيجة لمبدأ لو شاتيليه ، حيث يرتبط المثبط بكل من الإنزيم ومركب الإنزيم-الركيزة بالتساوي، مما يحافظ على حالة التوازن. مع ذلك، ونظرًا لأن جزءًا من الإنزيم يُثبط دائمًا عن تحويل الركيزة إلى ناتج، ينخفض ​​تركيز الإنزيم الفعال.

رياضياً،

${\displaystyle V_{max}^{app}={\frac {V_{max}}{1+{\frac {[\mathrm {I} ]}{K_{I}}}}}}$

${\displaystyle {appparent\ \mathrm {[E]_{0}} }={\frac {\mathrm {[E]_{0}} }{1+{\frac {\mathrm {[I]} }{K_{I}}}}}}$

تشمل مثبطات إنزيم CYP2C9 غير التنافسية النيفيديبين ، والترانيلسيبرومين ، وفينيل إيزوثيوسيانات ، و6-هيدروكسي فلافون. تشير محاكاة الالتحام الحاسوبي والطفرات المُصنّعة إلى أن موقع الارتباط غير التنافسي لـ6-هيدروكسي فلافون هو موقع الارتباط التغايري المُبلغ عنه لإنزيم CYP2C9 . ^{[ 9 ]}