نسخ النسخ

📅 آخر تحديث: ٢٨ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٨ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 2 صور
الموسوعة الحرة

النسخ المباشر هو تقنية مخبرية تُستخدم لإنتاج جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) من قالب الحمض النووي (DNA) باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي النقي . سُميت هذه الطريقة "بالنسخ المباشر" لأن عملية النسخ تستمر حتى يصل البوليميراز إلى نهاية قطعة الحمض النووي، مُنتجًا حمضًا نوويًا ريبوزيًا بطول مُحدد وقابل للتنبؤ. يُستخدم هذا الاختبار لدراسة نشاط المُحفز ، واختبار كيفية تأثير تغييرات مُحددة في تسلسل الحمض النووي على بدء النسخ، وإنتاج جزيئات حمض نووي ريبوزي ذات حجم دقيق لإجراء اختبارات لاحقة. ولأن التفاعل يحدث خارج الخلية، فإن النسخ المباشر يُتيح تحكمًا دقيقًا في القالب وظروف التفاعل، ولكنه لا يُحاكي تمامًا تعقيد تنظيم الجينات داخل الكائن الحي .

وبشكلٍ أكثر تحديدًا، يُستخدم النسخ المباشر لتحديد موقع بدء النسخ بدقة (يقع على بُعد زوج قاعدي واحد أسفل المُحفِّز) ولتقييم دقة وسرعة النسخ في المختبر . [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] كما يُمكن استخدامه لقياس كيفية تأثير التغييرات في تسلسلات المُحفِّز على ناتج النسخ كميًا. [ 4 ] ومع ذلك، ونظرًا لطبيعته المختبرية ، لا يُمكن لهذا الاختبار التنبؤ بدقة بمستويات النسخ الخاصة بنوع الخلية، على عكس الطرق الحيوية مثل اختبارات النسخ النووي المباشر . [ 1 ] [ 2 ]

التاريخ والخلفية

بول بيرغ عام 1980

كان مايكل تشامبرلين ، الذي توفي أثناء نومه في نوفمبر 2025، أول من عزل بوليميراز الحمض النووي الريبي من بكتيريا الإشريكية القولونية عندما كان طالب دراسات عليا في جامعة ستانفورد مع الراحل بول بيرج، وقد أحدث ثورة في فهم عملية النسخ. [ 5 ]

مبدأ

لإجراء اختبار النسخ المباشر، يُستنسخ الجين المراد دراسته، بما في ذلك المحفز ، في بلازميد . [ 4 ] يُهضم البلازميد عند موقع قطع إنزيم التقييد المعروف ، الواقع أسفل موقع بدء النسخ، بحيث يسهل فصل ناتج النسخ المباشر المتوقع من mRNA بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي . [ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] يجب تنقية الحمض النووي DNA بدرجة عالية قبل إجراء هذا الاختبار. [ 1 ] [ 2 ] لبدء عملية النسخ، يُضاف UTP الموسوم إشعاعيًا ، والنيوكليوتيدات الأخرى ، وبوليميراز RNA إلى الحمض النووي DNA الخطي. [ 1 ] [ 2 ] يستمر النسخ حتى يصل بوليميراز RNA إلى نهاية الحمض النووي DNA، حيث يقوم ببساطة بنسخ قالب الحمض النووي DNA، مما ينتج عنه قطعة mRNA ذات طول محدد. [ 1 ] [ 2 ] يمكن بعد ذلك فصل هذه القطعة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي، جنبًا إلى جنب مع معايير الحجم، وتصويرها إشعاعيًا ذاتيًا. [ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] يُمثل حجم الشريط المقابل حجم الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) من موقع قطع إنزيم التقييد إلى موقع بدء النسخ (+1). [ 4 ] تُشير شدة الشريط إلى كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المُنتَج. [ 4 ] بالإضافة إلى ذلك، يُمكن استخدامه للكشف عما إذا كان النسخ يتم في ظل ظروف مُعينة (مثل وجود مواد كيميائية مُختلفة). [ 6 ]

إجراء

تحضير قالب الحمض النووي: قوالب الحمض النووي المستخدمة في اختبار النسخ إما بلازميدات أو شظايا من الحمض النووي المزدوج (dsDNA) مُصنّعة باستخدام قليل النوكليوتيدات. يُحوّل قالب الحمض النووي الدائري الذي يحتوي على تسلسل المحفز (محفز T7) إلى شكل خطي باستخدام إنزيم القطع الذي يقطع المنطقة الواقعة أسفل المنطقة المراد نسخها. يضمن هذا أن يقوم بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA polymerase) بنسخ الحمض النووي حتى يصل إلى نهاية جزيء الحمض النووي الخطي.

تجميع اختبار النسخ: يُخلط جزيء الحمض النووي الخطي مع Tris-HCl وMgCl₂ و Spermidine و DTT والنيوكليوتيدات (ATP وGTP وCTP وUTP). يُحضن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. يمكن إضافة نيوكليوتيدات موسومة إشعاعيًا أو فلوريًا. في الاختبارات واسعة النطاق، يُوصى بإضافة مثبط الريبونوكلياز وإنزيمات البيروفوسفاتاز غير العضوية لتحسين جودة وكمية النسخ. [ 7 ] بعد النسخ، يمكن إزالة قالب الحمض النووي الزائد بمعالجته بإنزيم DNase.

التطبيقات

  • التطور الموجه: يُعدّ النسخ المباشر طريقةً أساسيةً في تجارب التطور الموجه التي تتطلب توليد مكتبات كبيرة ومتنوعة من الحمض النووي الريبوزي (RNA)، مثل الريبوزيمات والأبتاميرات. في هذه الأنظمة، تُخطّط مجموعات من تسلسلات الحمض النووي (DNA) العشوائية أو المُطفرة وتُنسخ في المختبر باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 لإنتاج جزيئات RNA متجانسة، حيث تُحدد حدودها 5′ و3′ بدقة بواسطة القالب. يُعدّ هذا التخليق المُتحكم فيه بالقالب ضروريًا للحفاظ على ارتباط ثابت بين النمط الجيني والنمط الظاهري أثناء الانتقاء، إذ يجب التعبير عن كل متغير كجزيء RNA كامل الطول لكي يطوى ويؤدي وظيفته بشكل صحيح. استخدمت تجارب SELEX (التطور المنهجي للروابط عن طريق الإثراء الأسي) الأصلية التي أجراها تورك وغولد النسخ المباشر لمكتبات الحمض النووي العشوائية لتوليد مجموعات من الحمض النووي الريبوزي (RNA) لعمليات انتقاء متكررة للارتباط ضد بوليميراز الحمض النووي T4، مما رسّخ هذه الطريقة كأساس لتطور الأبتاميرات . [ ٨ ] وبالمثل، استخدم بارتل وسزوستاك تقنية النسخ المباشر لإنتاج مكتبات تضم أكثر من ١٠¹⁵ جزيء RNA فريد في عزلهم لجزيئات RNA محفزة جديدة، مما يُظهر كيف تُمكّن عملية النسخ الفعالة في المختبر من اختيار الريبوزيمات عالية التعقيد. [ ٩ ] كما اعتمدت عمليات الاختيار اللاحقة التي أجراها ليمان وجويس على النسخ المباشر لتجديد مجموعات كبيرة من جزيئات RNA بعد كل جولة من الإثراء القائم على التحفيز. [ ١٠ ] ولأن كل دورة من الطفرة والاختيار والتضخيم تتطلب تجديد جزيئات RNA محددة بدقة، فإن النسخ المباشر يظل أحد الخطوات التحضيرية الأساسية في التطور الموجه القائم على RNA.
  • تحليل المصفوفات الدقيقة للنسخ المباشر (ROMA): يمكن تنظيم التعبير الجيني البكتيري على مستويات متعددة، بما في ذلك تنشيط أو تثبيط عوامل النسخ المرتبطة بالحمض النووي في موقع بدء النسخ، أو بوليميراز الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على عوامل سيجما مختلفة . يُستخدم إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي النقي على الحمض النووي الجينومي المجزأ للنسخ في المختبر، ويتم تحديد نسخ mRNA بواسطة تحليل تهجين المصفوفات الدقيقة. بعد ذلك، سمح تحليل ROMA بدراسة التأثيرات المباشرة لعوامل سيجما المختلفة، مثل سيجما 70 وسيجما 38 المتداخلين، دون الحاجة إلى بروتين تنظيمي. [ 11 ]  يُعاني تحليل ROMA من محدودية دقة النوكليوتيدات المفردة، وإمكانية استمرار النسخ في الجينات المتقاربة الأصل، مما قد يؤدي إلى إشارات إيجابية خاطئة. [ 12 ]
  • النسخ المتسلسل/تسلسل الحمض النووي الريبوزي (ROSE): للتغلب على قيود تقنية ROMA، طور العلماء تقنية ROSE، وهي منهجية تصاعدية تهدف إلى تجميع آلية النسخ لتكملة تحليل النسخ الجيني في الجسم الحي باستخدام الحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية K-12 MG1655. وهي عبارة عن نسخ جينومي شامل في المختبر باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبوزي المعزول، والريبونوكليوتيدات، والحمض النووي الجينومي. يتم تحضير مكتبة من النسخ الأصلية الخاصة بالنهاية 5' لتوفير قراءة مميزة لنقطة بدء النسخ. تُمكّن هذه التقنية من الكشف عن تسلسلات المحفز بدقة تصل إلى نيوكليوتيد واحد. [ 13 ]

القيود

  • محدودية القدرة على الاستمرار: قد تنفصل بوليميرازات الحمض النووي الريبي ( RNA) الخاصة بالعاثيات، مثل T7 وSP6 وT3، عن قالب الحمض النووي (DNA) قبل الوصول إلى نهاية الجزء الخطي، مما ينتج عنه نسخ مبتورة. يحدث هذا الإنهاء المبكر بشكل متكرر على القوالب الطويلة أو القوالب التي تحتوي على تراكيب ثانوية قوية تعيق الاستطالة. وقد أظهر ميليجان وزملاؤه أن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 يُظهر انخفاضًا ملحوظًا في قدرته على الاستمرار على القوالب التي تتجاوز عدة مئات من النيوكليوتيدات، مما يؤدي إلى منتجات أقصر من المتوقع في ظل الظروف المختبرية القياسية. [ 14 ] [ 15 ]
  • حساسية عالية للملوحة: تتأثر عملية النسخ بشكل كبير بالقوة الأيونية، حيث تعمل الأملاح أحادية التكافؤ (كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم) على تثبيط استقرار معقد بوليميراز الحمض النووي الريبي-المحفز، مما يقلل من كفاءة الاستطالة. وتؤدي الظروف عالية الملوحة إلى زعزعة استقرار المعقد المفتوح وإبطاء الانتقال من مرحلة البدء إلى الاستطالة الفعالة. وقد أفاد ميليجان وآخرون أن زيادة تركيزات الملح تقلل بشكل ملحوظ من كفاءة نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، مما يشير إلى اعتماد تفاعلات المحفز-البوليميراز بشكل كبير على القوة الأيونية. [ 14 ] [ 15 ]
  • المنتجات غير المرغوب فيها الناتجة عن التخليق غير المكتمل: خلال المراحل المبكرة من النسخ، غالبًا ما تُنتج بوليميرازات الحمض النووي الريبي نسخًا قصيرة غير مكتملة (2-10 نيوكليوتيدات) قبل الانتقال إلى الاستطالة المستمرة. تتراكم هذه الحمضيات النووية الريبية القصيرة في تفاعلات النسخ غير المكتملة، مما قد يُعقّد عملية تحديد كمية المنتجات كاملة الطول. وقد أظهر ماكاليستر وزملاؤه أن التكرار غير المكتمل سمة متأصلة في بدء بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، لا سيما عندما تكون المسافة بين المحفزات أو تركيزات النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTP) المُبدأة دون المستوى الأمثل. [ 16 ] [ 17 ]
  • إضافة نيوكليوتيد غير مزدوج القاعدة إلى الطرف 3' من النسخة المُستنسخة: يمكن لبوليميرازات الحمض النووي الريبي T7 وSP6 إضافة نيوكليوتيد واحد أو أكثر غير مُستنسخ إلى الطرف 3' من الحمض النووي الريبي الوليد، حتى عندما ينتهي قالب الحمض النووي بشكل كامل عند موقع التقييد . ينشأ هذا التباين في الطرف 3' من نشاط نقل الطرف غير المعتمد على القالب للبوليميراز. وقد أظهر بليس وآخرون إضافات نيوكليوتيدية ثابتة إلى الطرف 3' في نسخ T7 المُستنسخة، بينما أبلغ هيلم وبروليه بالمثل عن دمج نيوكليوتيدات غير مُستنسخة أثناء تفاعلات النسخ المختبرية لـ SP6 وT7. [ 15 ] [ 18 ] [ 19 ]

التطورات الحديثة

الشكل: امتزاز عاثية زرقاء على بروكلوروكوكس بحري.

للتغلب على قيود استخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ، وبوليميراز العاثية T3، وبوليميراز الحمض النووي الريبي SP6، بذل العلماء جهودًا مكثفة لتحسين تجانس الطرف 3' لنسخ T7، بما في ذلك تعديلات على قالب الحمض النووي، وربط الريبوزيمات بالطرف 3' للحمض النووي الريبي المطلوب. ولتحقيق هذا الغرض، تم توصيف كائن بحري يُدعى العاثية الزرقاء Syn5، وهو بوليميراز حمض نووي ريبي أحادي الوحدة. يتميز بوليميراز الحمض النووي الريبي Syn5 بقدرته على التعرف على تسلسل محفز قصير نسبيًا، وتحمله العالي للملوحة، وكفاءته العالية في معالجة النسخ نظرًا لوجود تسلسلين محفزين في جينومه، والأهم من ذلك، تجانسه العالي جدًا في الطرف 3' لمنتجات الحمض النووي الريبي. كما أنه قادر على إنتاج نسخ دقيقة خالية من النيوكليوتيدات الإضافية غير الأساسية، وهو أمر بالغ الأهمية لتخليق الحمض النووي الريبي الناقل، ومجسات الحمض النووي الريبي، وبادئات الحمض النووي الريبي في المختبر. ويُظهر بوليميراز الحمض النووي الريبي Syn5 استقرارًا أكبر من بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 خلال أربع ساعات من الحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. [ 20 ]

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 6 7 لوينشتاين، ب.م.؛ سونغ، س.ز.؛ غرين، م. (2007). "استخدام النسخ المختبري لاستكشاف الوظائف التنظيمية لمجالات البروتين الفيروسي". طرق وبروتوكولات الفيروسات الغدية . طرق في الطب الجزيئي. المجلد  131. الصفحات 15-31 . doi : 10.1007/978-1-59745-277-9_2 . ISBN  978-1-58829-901-7PMID 17656772​​ 
  2. 1 2 3 4 5 6 7 "النسخ اللاحق" . محطة الجزيئات . تم الاسترجاع في 16 أبريل 2014 .{{cite web}}: CS1 maint: deprecated archiveal service ( link )
  3. ↑ ليلانديه، سي؛ غوتيريس، إس؛ ماثيو، سي؛ فيديل، إف؛ ريماكل، سي؛ مارشال-دروارد، إل؛ برينيك، إيه؛ بيندر، إس؛ شيتريت، بي (1996). "عنصر محفز نشط في النسخ المباشر يتحكم في التعبير عن اثنين من جينات nad وrps في ميتوكوندريا نبات التبغ البري (Nicotiana sylvestris)" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 24 (23): 4798-4804 . doi : 10.1093/nar/24.23.4798 . PMC 146301. PMID 8972868 .  
  4. 1 2 3 4 5 6 أليسون، ليزابيث. "أساسيات البيولوجيا الجزيئية، الفصل 11" (ملف PDF) . دار بلاكويل للنشر . تم الاطلاع عليه بتاريخ 18 أبريل 2014 .
  5. ↑ "في ذكرى الراحل: مايكل ج. تشامبرلين" . علم الأحياء الجزيئي والخلوي . 12-11-2025 . تم الاطلاع عليه بتاريخ 24-11-2025 .
  6. ↑ سانشيز، ألفارو؛ أوزبورن، ميليسا ل.؛ فريدمان، لاري ج.؛ كونديڤ، جين؛ جيليس، جيف (2011). " آلية كبت النسخ في مُحفِّز بكتيري من خلال تحليل جزيئات مفردة" . مجلة EMBO . 30 (19): 3940-3946 . doi : 10.1038/emboj.2011.273 . PMC 3209775. PMID 21829165 .  
  7. ↑ ويتزمان، كارل جيه؛ كانينغهام، فيليب آر؛ أوفينغاند، جيمس (1990). "استنساخ، ونسخ في المختبر، والنشاط البيولوجي للرنا الريبوسومي 23S من الإشريكية القولونية" . أبحاث الأحماض النووية . 18 (12): 3515-3520 . doi : 10.1093/nar/18.12.3515 . ISSN 0305-1048 . 
  8. ↑ تورك، كريغ؛ غولد، لاري (3 أغسطس 1990). "التطور المنهجي للروابط عن طريق الإثراء الأسي: روابط الحمض النووي الريبي لبوليميراز الحمض النووي لبكتيريا العاثية T4" . مجلة ساينس . 249 (4968): 505-510 . doi : 10.1126/science.2200121 . ISSN 0036-8075 . 
  9. ↑ بارتل، ديفيد ب.؛ شوستاك، جاك و. (10-09-1993). "عزل ريبوزيمات جديدة من مجموعة كبيرة من التسلسلات العشوائية" . مجلة ساينس . 261 (5127): 1411-1418 . doi : 10.1126/science.7690155 . ISSN 0036-8075 . 
  10. ↑ ليمان، نايلز؛ جويس، جيرالد ف. (14 يناير 1993). "التطور المختبري لإنزيم RNA ذي اعتمادية معدنية متغيرة" . مجلة نيتشر . 361 (6408): 182-185 . doi : 10.1038/361182a0 . ISSN 0028-0836 . 
  11. ↑ ماكليلان، شون ر.؛ إيامفونغبورن، واراوان؛ هيلمان، جون د. (21-10-2008). "ROMA: منهج مخبري لتحديد الجينات المستهدفة لمنظمات النسخ" . طرق . 47 ( 1): 73-77 . doi : 10.1016/j.ymeth.2008.10.009 . PMC 2632846. PMID 18948201 .  
  12. ↑ ماكليلان، شون ر.؛ ويك، تينا؛ هيلمان، جون د. (23 يوليو/تموز 2008). "عامل سيجما غير معروف سابقًا وبروتينان مساعدان ينظمان التعبير عن إنزيم ديكاربوكسيلاز الأكسالات في بكتيريا العصوية الرقيقة" . علم الأحياء الدقيقة الجزيئي . 69 (4): 954-967 . doi : 10.1111/j.1365-2958.2008.06331.x . ISSN 0950-382X . PMC 2688449. PMID 18573182 .   
  13. ↑ شميدت، باسكال؛ براندت، ديفيد؛ بوش، توبياس؛ كالينوفسكي، يورن (25-05-2023). "توصيف شبكات تنظيم النسخ البكتيرية في الإشريكية القولونية من خلال النسخ/تسلسل الحمض النووي الريبوزي على مستوى الجينوم في المختبر (ROSE)" . الكائنات الدقيقة . 11 (6 ) : 1388. doi : 10.3390/microorganisms11061388 . ISSN 2076-2607 . PMC 10301672. PMID 37374890 .   
  14. 1 2 تشامبرلين، مايكل؛ رينغ، جانيت (25-03-1973). "توصيف بوليميراز الحمض النووي الريبي الخاص بـ T7" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 248 (6): 2235-2244 . doi : 10.1016/S0021-9258(19)44211-7 .
  15. 1 2 3 ميليجان، جون ف.؛ جرويب، دنكان ر.؛ ويثرل، غاري و.؛ أولينبيك، أولكي س. (1987). " تخليق قليل النوكليوتيدات الريبية باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 وقوالب الحمض النووي الاصطناعية" . أبحاث الأحماض النووية . 15 (21): 8783-8798 . doi : 10.1093/nar/15.21.8783 . ISSN 0305-1048 . PMC 306405. PMID 3684574 .   
  16. ↑ لياخوف، ديمتري ل؛ هي، بياو؛ تشانغ، شينغ؛ ستودير، ف. ويليام؛ دان، جون ج؛ ماكاليستر، ويليام ت (4 يوليو 1998). "التوقف والإنهاء بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي لفيروس T7" . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 280 (2): 201-213 . doi : 10.1006/jmbi.1998.1854 . PMID 9654445 . 
  17. ↑ إمبورجيو، ديان؛ رونغ، مينكينغ؛ ما، كايو؛ ماكاليستر، ويليام ت. (2000-08-01). "دراسات حول التعرف على المحفز واختيار موقع البدء بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 باستخدام مجموعة شاملة من متغيرات المحفز" . الكيمياء الحيوية . 39 (34): 10419-10430 . doi : 10.1021/bi000365w . ISSN 0006-2960 . 
  18. ↑ ميلتون، د.أ.؛ كريج، ب.أ.؛ ريباجلياتي، م.ر.؛ مانياتيس، ت.؛ زين، ك.؛ جرين، م.ر. (1984). "تخليق فعال في المختبر للحمض النووي الريبي النشط بيولوجيًا ومجسات تهجين الحمض النووي الريبي من البلازميدات التي تحتوي على محفز العاثية SP6" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 12 (18): 7035-7056 . doi : 10.1093/nar/12.18.7035 . ISSN 0305-1048 . PMC 320141. PMID 6091052 .   
  19. ↑ بليس، جيفري أ.؛ ديريك، ماريا ل.؛ أولينبيك، أولكي س. (1998-10-01). "يُنتج بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 عدم تجانس في النهاية 5′ أثناء النسخ المختبري من قوالب معينة" . الحمض النووي الريبي . 4 (10): 1313-1317 . doi : 10.1017/s135583829800106x . ISSN 1355-8382 . PMC 1369703 .  
  20. ↑ تشو، بين؛ تابور، ستانلي؛ ريتشاردسون، تشارلز سي. (2014-03-01). "إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي Syn5 يُصنّع منتجات الحمض النووي الريبي بدقة عالية" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 42 (5): e33. doi : 10.1093/nar/gkt1193 . ISSN 0305-1048 . PMC 3950665. PMID 24285303 .