لطخة جنوبية

تقنية ساوثرن بلوت هي طريقة تُستخدم للكشف عن تسلسل الحمض النووي ( DNA) وتحديد كميته في عينات الحمض النووي. تُستخدم هذه الطريقة في البيولوجيا الجزيئية . باختصار، يُهضم الحمض النووي المُستخلص من عينة بيولوجية (مثل الدم أو الأنسجة) باستخدام إنزيمات التقييد ، ثم تُفصل شظايا الحمض النووي الناتجة بالرحلان الكهربائي باستخدام تيار كهربائي لتحريكها عبر هلام أو مادة شبيهة بالمنخل، مما يسمح للشظايا الأصغر بالتحرك أسرع من الشظايا الأكبر. تُنقل شظايا الحمض النووي من الهلام أو المادة إلى غشاء صلب، ثم يُعرَّض هذا الغشاء لمسبار الحمض النووي المُوسَم بعلامة مشعة أو فلورية أو كيميائية. تسمح هذه العلامة برؤية أي شظايا حمض نووي تحتوي على تسلسلات مُكملة لتسلسل مسبار الحمض النووي داخل ساوثرن بلوت. ^{[ 1 ]}

تجمع تقنية ساوثرن بلوت بين نقل شظايا الحمض النووي المفصولة بالرحلان الكهربائي إلى غشاء ترشيح في عملية تسمى التلطيخ ، والكشف اللاحق عن الشظايا عن طريق تهجين المجس . ^{[ 2 ]}

سُميت هذه الطريقة نسبةً إلى عالم الأحياء البريطاني إدوين ساذرن ، الذي نشرها لأول مرة عام ١٩٧٥. ^{[ ٣ ]} وقد سُميت طرق أخرى للتلطيخ (مثل التلطيخ الغربي ، ^{[ ٤ ]} والتلطيخ الشمالي ، والتلطيخ الشرقي ، والتلطيخ الجنوبي الغربي ) التي تستخدم مبادئ مماثلة، ولكن باستخدام الحمض النووي الريبي أو البروتين، بأسماء الاتجاهات الأصلية كنوع من التورية على اسم ساذرن. ولأن التسمية تحمل اسمًا ، يُكتب اسم ساذرن بحرف كبير، كما هو متعارف عليه في أسماء الأعلام . وقد تتبع أسماء طرق التلطيخ الأخرى هذا التقليد، قياسًا على ذلك. ^{[ ٥ ]}

ابتكر ساوثرن تقنية ساوثرن بلوت بعد دمج ثلاثة ابتكارات. أولها إنزيمات القطع المحددة، التي طُوّرت في جامعة جونز هوبكنز على يد توم كيلي وهاملتون سميث . تُستخدم هذه الإنزيمات لقطع الحمض النووي عند تسلسل محدد. وقد قدّم كينيث ونورين موراي هذه التقنية باسم ساوثرن. أما الابتكار الثاني فهو الفصل الكهربائي الهلامي، الذي يعتمد على فصل مخاليط الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) أو البروتينات وفقًا لحجمها الجزيئي، وقد طُوّر أيضًا في جامعة جونز هوبكنز على يد دانيال ناثانز وكاثلين دانا عام 1971. والابتكار الثالث هو طريقة النقل عبر الغشاء، التي طوّرها فريدريك سانجر ، عندما نقل جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA) إلى ورق DEAE. ابتُكرت تقنية ساوثرن بلوت عام 1973، لكنها لم تُنشر حتى عام 1975. ورغم نشرها لاحقًا، انتشرت التقنية على نطاق واسع عندما قدّمها ساوثرن لعالم في مختبر كولد سبرينغ هاربور يُدعى مايكل ماثيوز، وذلك برسمها على ورقة. ^{[ 6 ]}

يُهضم الحمض النووي الجينومي باستخدام إنزيم تقييد واحد أو أكثر، ثم تُفصل شظايا الحمض النووي حسب الحجم باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي. قبل نقل شظايا الحمض النووي إلى غشاء صلب، سواء كان من النايلون أو النيتروسليلوز، تُخضع أولًا لعملية تمسخ باستخدام محلول قلوي. ^{[ 7 ]} بعد تثبيت شظايا الحمض النووي على الغشاء، تُستخدم طرق ما قبل التهجين لتقليل ارتباط المجسات غير النوعي. ثم تُهجن الشظايا الموجودة على الغشاء مع مجسات الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) أو قليل النوكليوتيدات، سواء كانت موسومة إشعاعيًا أو غير مشعة، والتي تُكمل تسلسل الحمض النووي المستهدف. بعد ذلك، تُستخدم طرق الكشف لتصوير الحمض النووي المستهدف. ^{[ 8 ]}

1. عزل الحمض النووي: يُعزل الحمض النووي المراد دراسته من أنسجة مختلفة. يُعدّ الدم المصدر الأنسب للحمض النووي، ولكن يمكن عزله أيضاً من أنسجة أخرى (كالشعر، والسائل المنوي، واللعاب، وغيرها).
2. هضم الحمض النووي: تُستخدم إنزيمات القطع المحددة لتقطيع خيوط الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي العالي إلى أجزاء أصغر. يتم ذلك بإضافة الكمية المطلوبة من الحمض النووي، والتي يمكن تغييرها وفقًا للمسبار المستخدم ومدى تعقيد الحمض النووي، مع إنزيم القطع، ومحلول الإنزيم، والماء المقطر. ثم يُحضن المزيج عند درجة حرارة 37  درجة مئوية طوال الليل.
3. الفصل الكهربائي الهلامي: تُفصل شظايا الحمض النووي (DNA) كهربائيًا على هلام الأغاروز لفصلها حسب الحجم. إذا كان حجم بعض شظايا الحمض النووي أكبر من 15 كيلوبايت ، فيمكن معالجة الهلام بحمض، مثل حمض الهيدروكلوريك المخفف، قبل نقلها إلى الغشاء . يؤدي ذلك إلى إزالة البيورينات من شظايا الحمض النووي، مما يُفتت الحمض النووي إلى قطع أصغر، وبالتالي يسمح بنقل أكثر كفاءة من الهلام إلى الغشاء.
4. التمسخ: في حال استخدام طرق النقل القلوية، يُوضع هلام الحمض النووي في محلول قلوي (يحتوي عادةً على هيدروكسيد الصوديوم ) لتمسخ الحمض النووي المزدوج. قد يُحسّن التمسخ في بيئة قلوية ارتباط بقايا الثايمين سالبة الشحنة في الحمض النووي بمجموعات الأمين موجبة الشحنة في الغشاء، مما يؤدي إلى فصله إلى خيوط مفردة من الحمض النووي لتهجينها لاحقًا مع المجس (انظر أدناه)، كما يُدمر أي حمض نووي ريبوزي متبقٍ قد يكون موجودًا في الحمض النووي. مع ذلك، غالبًا ما يكون اختيار طرق النقل القلوية بدلًا من الطرق المتعادلة تجريبيًا، وقد ينتج عنه نتائج مماثلة.
5. النقل: توضع طبقة من غشاء النيتروسليلوز (أو النايلون كبديل ) فوق (أو أسفل، حسب اتجاه النقل) الهلام. يُضغط على الهلام باستمرار (إما بالشفط، أو بوضع مجموعة من المناشف الورقية ووزن فوق الغشاء والهلام) لضمان تلامس جيد ومتساوٍ بين الهلام والغشاء. في حالة النقل بالشفط، يُستخدم محلول SSC بتركيز 20X لضمان إحكام الإغلاق ومنع جفاف الهلام. ثم يُستخدم النقل الشعري للمحلول من منطقة ذات جهد مائي عالٍ إلى منطقة ذات جهد مائي منخفض (عادةً ورق ترشيح ومناديل ورقية) لنقل الحمض النووي من الهلام إلى الغشاء؛ حيث تربط تفاعلات التبادل الأيوني الحمض النووي بالغشاء نظرًا للشحنة السالبة للحمض النووي والشحنة الموجبة للغشاء. يمكن استخدام خمس طرق لنقل شظايا الحمض النووي إلى الغشاء الصلب، وهي: ^{[ 8 ]}
   1. النقل الشعري الصاعد: تنقل هذه الطريقة قطعة الحمض النووي لأعلى من الهلام إلى الغشاء حيث يكون تدفق السائل أو المحلول المنظم لأعلى.
   2. النقل الشعري الهابط: يتم ذلك عن طريق وضع الجل على سطح الغشاء (عادة غشاء نايلون مشحون) وسيتم نقل شظايا الحمض النووي في اتجاه هابط مع تدفق المحلول القلوي.
   3. النقل المتزامن إلى غشائين: تُستخدم هذه الطريقة لنقل أجزاء الحمض النووي ذات التركيز العالي في وقت واحد من الهلام إلى غشائين.
   4. النقل الكهربائي: تستخدم هذه الطريقة عادةً تيارًا كهربائيًا كبيرًا مما يجعل من الصعب نقل الحمض النووي بكفاءة بسبب درجة حرارة المحلول المستخدم، لذلك يمكن تجهيز هذه الأجهزة بأجهزة تبريد أو استخدامها في منطقة باردة.
   5. النقل بالتفريغ: تستخدم هذه الطريقة محلولًا منظمًا من الحجرة العلوية لنقل الحمض النووي من الجل إلى غشاء النيتروسليلوز أو النايلون، ويتم وضع الجل مباشرة على الغشاء، ويتم وضع الغشاء على شاشة مسامية في حجرة التفريغ.
6. التثبيت: ثم يتم خبز الغشاء في فرن فراغي أو فرن عادي عند درجة حرارة 80  درجة مئوية لمدة ساعتين (ظروف قياسية؛ غشاء نيتروسليلوز أو نايلون) أو تعريضه للأشعة فوق البنفسجية (غشاء نايلون) لربط الحمض النووي المنقول بالغشاء بشكل دائم.
7. التهجين: بعد ذلك، يُعرَّض غشاء الخلية لمسبار التهجين ، وهو عبارة عن قطعة واحدة من الحمض النووي (DNA) ذات تسلسل محدد، يُراد التحقق من وجودها في الحمض النووي المستهدف. يُوسَم الحمض النووي للمسبار بحيث يمكن الكشف عنه، عادةً عن طريق دمج مواد مشعة أو وسم الجزيء بصبغة فلورية أو ملونة . في بعض الحالات، قد يُصنع مسبار التهجين من الحمض النووي الريبوزي (RNA) بدلاً من الحمض النووي (DNA). ولضمان خصوصية ارتباط المسبار بالحمض النووي للعينة، تستخدم معظم طرق التهجين الشائعة الحمض النووي المنوي لسمك السلمون أو الرنجة لحجب سطح الغشاء والحمض النووي المستهدف، بالإضافة إلى الفورماميد منزوع الأيونات ، ومواد منظفة مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لتقليل الارتباط غير النوعي للمسبار.
8. الكشف: بعد التهجين، يتم غسل المسبار الزائد من الغشاء (عادة باستخدام محلول SSC )، ويتم تصوير نمط التهجين على فيلم الأشعة السينية عن طريق التصوير الإشعاعي الذاتي في حالة المسبار المشع أو الفلوري، أو عن طريق ظهور اللون على الغشاء إذا تم استخدام طريقة الكشف اللونية.

يشير تهجين المجس مع قطعة محددة من الحمض النووي على غشاء الترشيح إلى أن هذه القطعة تحتوي على تسلسل حمض نووي مكمل للمجس. تسمح خطوة نقل الحمض النووي من هلام الرحلان الكهربائي إلى الغشاء بربط مجس التهجين الموسوم بسهولة بالحمض النووي المفصول حسب الحجم. كما تسمح بتثبيت هجائن الهدف-المجس، وهو أمر ضروري للتحليل بالتصوير الإشعاعي الذاتي أو طرق الكشف الأخرى. يمكن استخدام تقنية ساوثرن بلوت، التي تُجرى باستخدام الحمض النووي الجينومي المهضوم بواسطة إنزيمات التقييد، لتحديد عدد التسلسلات (مثل نسخ الجينات) في الجينوم . سينتج عن تهجين المجس مع قطعة واحدة فقط من الحمض النووي لم تُقطع بواسطة إنزيم التقييد حزمة واحدة في ساوثرن بلوت، بينما من المرجح ملاحظة حزم متعددة عندما يتهجن المجس مع عدة تسلسلات متشابهة للغاية (مثل تلك التي قد تكون ناتجة عن تكرار التسلسل). لتحسين الخصوصية وتقليل تهجين المجس مع التسلسلات التي تقل نسبة تطابقها عن 100%، يمكن تغيير معايير التهجين (على سبيل المثال، برفع درجة حرارة التهجين أو خفض محتوى الملح). يتميز غشاء النايلون بمتانته وقدرته العالية على الارتباط بقطع الحمض النووي مقارنةً بغشاء النيتروسليلوز، مما يجعل قطع الحمض النووي أكثر ثباتًا على الغشاء حتى عند حضانته في درجات حرارة عالية. إضافةً إلى ذلك، وبالمقارنة مع غشاء النيتروسليلوز الذي يتطلب محلولًا منظمًا عالي التركيز الأيوني لربط قطع الحمض النووي بالغشاء، تستخدم أغشية النايلون المشحونة محاليل منظمة ذات تركيز أيوني منخفض جدًا لنقل حتى قطع الحمض النووي الصغيرة التي يبلغ طولها حوالي 50 زوجًا قاعديًا إلى الغشاء، وعادةً ما يُفصل الحمض النووي المراد نقله باستخدام هلام بولي أكريلاميد. في خطوة النقل، تُعد طريقة النقل بالتفريغ الطريقة الأكثر فعالية لنقل الحمض النووي من الهلام إلى الغشاء، نظرًا لسرعة وكفاءة نقله. ^{[ 8 ]}

1. يمكن استخدام تقنية نقل ساوثرن بلوت للاستنساخ القائم على التماثل، وذلك بالاعتماد على تسلسل الأحماض الأمينية للمنتج البروتيني للجين المستهدف. تُصمم قليل النوكليوتيدات بحيث تكون مكملة للتسلسل المستهدف. تُصنّع هذه القليل النوكليوتيدات كيميائيًا، وتُوسم إشعاعيًا، ثم تُستخدم لفحص مكتبة الحمض النووي ، أو مجموعات أخرى من شظايا الحمض النووي المستنسخة. تُحلل التسلسلات التي تتهجن مع مسبار التهجين بشكل إضافي، على سبيل المثال، للحصول على التسلسل الكامل للجين المستهدف.
2. يمكن دراسة إعادة ترتيب الكروموسومات أو الجينات الطبيعية باستخدام هذه التقنية. ^{[ 7 ]}
3. يمكن استخدامها للعثور على تسلسلات مماثلة في أنواع أخرى أو في الجينوم عن طريق تقليل خصوصية التهجين. ^{[ 7 ]}
4. في خليط يحتوي على أحجام مختلفة من الحمض النووي المهضوم، يُستخدم لتحديد قطعة التقييد ذات الحجم المحدد. ^{[ 7 ]}
5. يُعدّ هذا مفيدًا في تحديد التغييرات التي تحدث في الجينات، بما في ذلك عمليات الإدخال وإعادة الترتيب والحذف والطفرات النقطية التي تؤثر على مواقع التقييد. ^{[ 7 ]}
6. علاوة على ذلك، يُستخدم لتحديد منطقة معينة تستخدم العديد من إنزيمات التقييد المختلفة في عملية رسم خرائط التقييد. كما يُستخدم لتحديد موقع التعرف الذي طرأ عليه تغيير نتيجة لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة الذي يُغير إنزيم تقييد معين. ^{[ 7 ]}
7. يمكن استخدام تقنية ساوثرن بلوت لتحديد مواقع المثيلة في جينات معينة. وتُعدّ إنزيمات القطع MspI و HpaII مفيدة بشكل خاص ، حيث تتعرف كلتاهما على نفس التسلسل وتقطعه. مع ذلك، يتطلب HpaII وجود مثيلة في قاعدة السيتوزين (C) ضمن ذلك الموقع، بينما يقطع MspI الحمض النووي غير المثيل في ذلك الموقع فقط. لذا، فإن أي مواقع مثيلة ضمن تسلسل يتم تحليله باستخدام مسبار معين سيتم قطعها بواسطة الإنزيم الأول، وليس الثاني. ^{[ 9 ]}
8. يمكن استخدامها في تحديد الهوية الشخصية من خلال بصمات الأصابع، وفي تشخيص الأمراض. ^{[ 10 ]}

1. بالمقارنة مع الاختبارات الأخرى، فإن تقنية ساوثرن بلوت هي تقنية معقدة تتضمن خطوات متعددة، وتتطلب هذه الخطوات معدات وكواشف باهظة الثمن. ^{[ 10 ]}
2. يلزم وجود كميات كبيرة من الحمض النووي عالي الجودة. ^{[ 10 ]}
3. يُعدّ التهجين الجنوبي طريقة تستغرق وقتاً طويلاً، ولا يمكنها سوى تقدير حجم الحمض النووي لأنها طريقة شبه كمية. ^{[ 10 ]}
4. لا يمكن استخدامه للكشف عن الطفرات على مستوى أزواج القواعد. ^{[ 10 ]}

• الفصل الكهربائي الهلامي للأحماض النووية
• جزء التقييد
• البصمة الوراثية
• لطخة نورثرن
• لطخة ويسترن
• لطخة شرقية
• بقعة جنوبية غربية
• لطخة شمال غربية

• أوبن ويتوير